Arthritis Research & Therapy, 2004; 6(6): R567-R577 (más artículos en esta revista)

Resistencia a la IL-10 inhibición de la producción de interferón gamma y la expresión de citoquinas supresor de señalización 1 en los linfocitos T CD4 + de pacientes con artritis reumatoide

BioMed Central
Jiro Yamana (jyamanajyamana@yahoo.co.jp) [1], Masahiro Yamamura (yamamura@md.okayama-u.ac.jp) [1], Akira Okamoto (cag93700@pop13.odn.ne.jp) [1] , Tetsushi Aita (ccf39160@nyc.odn.ne.jp) [1], Mitsuhiro Iwahashi (ajisu@hotmail.com) [1], Katsue Sunahori (katsuna75@yahoo.co.jp) [1], Hirofumi Makino (makino @ Md.okayama-u.ac.jp) [1]
[1] Departamento de Medicina Clínica y Ciencia, la escuela de postgrado de Medicina y Odontología de la Universidad de Okayama, Okayama, Japón

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Resumen

IL-10 se ha demostrado que bloquear el antígeno-específica de células T de respuesta de citoquinas por la inhibición de la vía de señalización CD28. Se encontró que la sangre periférica los linfocitos T CD4 + de pacientes con artritis reumatoide activa (RA) fueron capaces de producir una mayor cantidad de interferón gamma después de CD3 y CD28 costimulation en presencia de 1 ng / ml de IL-10 que fueron normales de control de CD4 + T Células, aunque su expresión de la superficie de tipo 1 del receptor de IL-10 se aumentó. La fosforilación de la señal de transductor y activador de la transcripción 3 fue sostenido tanto en la sangre y el tejido sinovial de células T CD4 + de la AR, pero no fue aumentada por la presencia de 1 ng / ml de IL-10. Sueros de los pacientes con AR inducida transductor de señales y activador de la transcripción 3 fosforilación normal en los linfocitos T CD4 +, que fue abolida por la mayoría de neutralizar anti-IL-6 de anticuerpos. Preincubación normal de las células CD4 + T con IL-6, IL-10 redujo mediada por la inhibición de la producción de interferón gamma. Sangre células CD4 + T de los pacientes con AR que figuran mayores niveles de citoquinas supresor de señalización 1, pero menores niveles de citoquinas supresor de señalización 3 mRNA en comparación con el control de los linfocitos T CD4 +, determinada por PCR en tiempo real. Estos resultados indican que la AR los linfocitos T CD4 + se vuelven resistentes al efecto inmunosupresor de la IL-10 antes de la migración en el tejido sinovial, y esta alteración de la señalización de IL-10 puede estar asociado con sostenido transductor de señales y activador de la transcripción 3 y supresor de la activación de la señalización de citoquinas 1 inducción.

Introducción

IL-10 es una citoquina clave en la regulación de las respuestas inflamatorias, principalmente mediante la inhibición de la producción y la función de las citocinas proinflamatorias. IL-10 se une al receptor de IL-10 (IL-10R) complejo que se compone de dos subunidades, que es el principal componente ligando vinculante tipo 1, IL-10R (IL-10R1) y el accesorio componente de tipo 2, IL-10R [1 ]. La interacción de IL-10 e IL-10R compromete la quinasa Janus (JAK), la familia de tirosina quinasas Jak1 y Tyk2, que son constitutivamente asociados con la IL-10R1 y tipo 2, IL-10R, respectivamente [2]. IL-10 induce la fosforilación de la tirosina y de la activación de factores de transcripción latentes transductor de señales y activador de la transcripción (STAT) 3 y STAT1 [3]. Tras la fosforilación, STAT1 y proteínas STAT3 forma homodimeros o heterodimers, trasladar rápidamente en el núcleo, y modulan la transcripción de genes. Curiosamente, STAT3 es indispensable para los dos IL-10-derivados anti-inflamatorios y la IL-6 derivada de las respuestas proinflamatorias [4]. Estudios de células de tipo específico-STAT3 ratones deficientes han demostrado que la activación de STAT3 es fundamental para la IL-10 mediada por reacciones anti-inflamatorios en macrófagos y neutrófilos [5], pero es responsable de IL-6 mediada la prevención de la apoptosis en T Células [6]. El supresor de la señalización de citoquinas (SOCS) las proteínas han sido identificadas como una familia de los inhibidores de quinasa JAK endógeno que puede actuar en el clásico de inhibición de los bucles de retroalimentación, pero su papel de los mediadores de crosstalk inhibición de citoquinas por parte de vías de señalización se han aclarado [7]. Estudios recientes indican que SOCS3 desempeña un papel clave en la regulación de la divergencia de acción de la IL-10 y IL-6, específicamente por el bloqueo de STAT3 inducida por la activación de la IL-6, pero no el inducido por la IL-10 [8, 9].

La membrana sinovial de la artritis reumatoide (AR) se caracteriza por un infiltrado de una variedad de células inflamatorias, como linfocitos, macrófagos y células dendríticas, junto con la proliferación de fibroblastos sinoviales similares a las células. Numerosas citocinas son overproduced en el inflamado conjunto, y de los macrófagos y fibroblastos sinoviales son una fuente importante de citoquinas proinflamatorias. Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e IL-1, dos de los principales productos de los macrófagos, son cruciales en el proceso de inflamación crónica y destrucción conjunta, y que dan lugar a efector componentes, incluidas otras citoquinas inflamatorias, quimiocinas, factores de crecimiento, la matriz Proteasas, el óxido nítrico, y de especies reactivas del oxígeno [10]. IL-6 es una citoquina pleiotrópica producida por la activación de fibroblastos sustancialmente, y su proinflamatorias acciones incluyen la simulación de la respuesta de fase aguda, de maduración de las células B en células plasmáticas, células T funciones, y la diferenciación de células precursoras hematopoyéticas [11].

Sin embargo, anti-inflamatorios inhibidores de las citoquinas y de citoquinas también están presentes en grandes cantidades en las articulaciones RA. IL-10, producida por los macrófagos y, en parte, por las células T en el tejido sinovial (ST), es más conocido como un regulador negativo de los macrófagos y las células Th1, pero el nivel de expresión es insuficiente para contrarrestar la cascada de eventos proinflamatorias [12]. Además, la acción antiinflamatoria de la IL-10 parece ser modulada a nivel de la transducción de señales durante la inflamación crónica. IL-10 de señalización en macrófagos se perjudica a la exposición crónica a citoquinas proinflamatorias como TNF-α y la IL-1 y los complejos inmunes [13, 14]. Superficie celular expresión de la IL-10R1 disminuye en el líquido sinovial células dendríticas debido a la presencia de TNF-α, IL-1, y la colonia de granulocitos y macrófagos, factor estimulante [15].

Los linfocitos T CD4 + pueden ser activadas por antígenos arthritogenic, junto con CD28-estimuladoras de señalización mediada, en la AR. La importancia de este proceso autoinmune ha recibido el apoyo de la vinculación de los antígenos del CMH clase II HLA-DRB1 * 0404 y HLA-DRB1 * 0401 con la susceptibilidad a la enfermedad y la gravedad [16, 17], y por el alto nivel de expresión de MHC clase II y ambas moléculas ligandos CD28, CD80 y CD86, en el inflamado ST [18 - 20]. La continua aparición de activar los linfocitos T CD4 +, aunque pocos en número, puede ser crucial en el mantenimiento de la activación de los macrófagos y fibroblastos sinoviales superficie celular a través de la señalización por medio de la superficie celular CD69 y CD11, así como la liberación de citoquinas proinflamatorias Th1 Como el interferón gamma (IFN) - γ e IL-17 [21, 22]. Además, los linfocitos T CD4 +, podría estimular la producción de células B de autoanticuerpos como factor reumatoide y los osteoclastos mediada por la destrucción ósea. Su función obligatoria en la AR sinovitis fue recientemente demostrado por el éxito de tratamiento de la enfermedad activa por la inhibición selectiva de la activación de células T con la proteína de fusión de células T citotóxicas-antígeno asociado 4 (CD152)-IgG, que pueden bloquear la participación de CD28 en T Por su unión a las células CD80 y CD86 con alta avidez [23].

IL-10 bloquea eficazmente el antígeno-específica de células T de respuesta de citoquinas por la inhibición de la vía de señalización CD28 [24], así como indirectamente por downregulating la función de las células presentadoras de antígenos. Para dilucidar la resistencia de los linfocitos T CD4 + a esta inhibición directa en la AR, se determinó la producción de IFN-γ después de CD3 y CD28 costimulation en presencia de IL-10, la inducción de STAT1 y STAT3 fosforilación de la IL-10, y La expresión de mRNA SOCS1 y SOCS3 en la sangre periférica (PB), los linfocitos T CD4 + de los pacientes con AR.

Materiales y métodos
Pacientes y muestras

El total de población de pacientes consistió en 32 pacientes con AR (25 mujeres y siete hombres, con una media de edad ± desviación estándar, 52,8 ± 12,4 años) diagnosticados de acuerdo a la revisión de los criterios de 1987 del Colegio Americano de Reumatología (oficialmente, la American Rheumatism Association) [ 25]. Todos los pacientes recibían prednisolona (≤ 7,5 mg / día) y el modificador de la enfermedad, los fármacos antirreumáticos. Parámetros clínicos en los pacientes del estudio fueron los siguientes (media ± desviación estándar): velocidad de sedimentación, 55,9 ± 35,4 mm / hora; suero de proteína C-reactiva (CRP), 32,0 ± 32,0 mg / l, y la clase IgM factor reumatoide título , 142 ± 158 U / ml. Los pacientes se dividieron en dos grupos: 24 pacientes con enfermedad activa, que había múltiples ofertas y / o hinchazón en las articulaciones y CRP nivel sérico elevado (≥ 10 mg / l), y ocho pacientes con la enfermedad inactiva, que satisface el Colegio Americano de Reumatología preliminar Criterios para la remisión clínica [26]. Dieciséis voluntarios sanos (11 mujeres y cinco hombres, la edad, 45,8 ± 11,2 años) sirvieron como controles. ST muestras se obtuvieron a partir de tres RA pacientes que se someten a reemplazo total de rodilla. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado.

Aislamiento de linfocitos T CD4 +

Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se preparan a partir de muestras de sangre heparinized por centrifugación más de Ficoll-Hypaque gradientes de densidad (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Los linfocitos T CD4 + fueron purificados de PBMC por la selección positiva utilizando anti-CD4 mAb revestida de piedras magneticas (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los linfocitos T CD4 + fueron aisladas de muestras ST, como ha sido descrito previamente [27]. En pocas palabras, dulce ST muestras fueron fragmentados y digeridos con colagenasa y DNasa durante 1 hora a 37 ° C. Después de la eliminación de los desechos de tejidos, ST suspensiones de células en un medio de cultivo (medio RPMI 1640; Life Technologies, Gaithersburg, MD, EE.UU.) suplementado con 25 mM HEPES (2 mM L-glutamina, el 2% no los aminoácidos, 100 UI / ml de penicilina, y 100 mg / ml estreptomicina; Tecnologías de la Vida) con el 10% de calor-FCS inactivado (Life Technologies) fueron incubadas a 37 ° C en el plazo de seis platos así (Coster, Cambridge, MA, EE.UU.) durante 45 min. No adherentes se cosecharon las células y los linfocitos T CD4 + fueron purificados por la selección positiva como ya se ha descrito.

Cultura de los linfocitos T CD4 +

PB CD4 + T-poblaciones de células resuspendido en una densidad de 1 × 10 6 células / ml en medio de cultivo con un 10% de FCS, y 0,5 ml de células en suspensión fueron dispensadas en los pozos de 24 y placas microtiter (Coster) recubierto con 1 Μ g / ml anti-CD3 mAb (Immunotech, Marseille, Francia). Las células fueron incubadas con 1 μ g / ml anti-CD28 mAb (Immunotech) en la presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de la IL-10 (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.) a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5 CO 2% [28]. Cultura sobrenadantes se recogieron 36 horas más tarde y libre de las muestras de células fueron almacenadas a -30 ° C hasta el ensayo de citoquinas.

Para examinar el efecto de la IL-6 en las células T de respuesta a IL-10, los linfocitos T CD4 + de controles sanos fueron incubados en medio de cultivo con un 10% de FCS en la presencia o ausencia de 10 ng / ml IL-6 (Becton Dickinson ) Durante 36 horas. Las células fueron entonces estimulados durante 36 horas con mAb anti-CD3 y anti-CD28 mAb en la presencia o ausencia de 1 ng / ml de IL-10. Cultura sobrenadantes se realizaron mediciones de las concentraciones de IFN-γ.

Análisis de citometría de flujo para la expresión de IL-10R1

Se tomó una muestra de 5 × 10 5 células de PBMC se resuspendió en PBS con un 1% FCS. PBMC se incubaron con saturar las concentraciones de anti-IL-10R1 mAb (IgG 1; sistemas de I + D, Minneapolis, MN, EE.UU.) o con isotipo-control pareado mAb (Immunotech), seguido de incubación con FITC-conjugado de cabra anti-ratón IgG 1 Anticuerpo policlonal (Santa Cruz biotecnologías, Santa Cruz, CA, EE.UU.). Las células fueron incubadas con ficoeritrina-conjugadas anti-CD4 mAb (Becton Dickinson). Las células se lavaron bien con el 1% FCS / PBS entre incubaciones. El análisis se realizó sobre un cytometer flujo FACScan (Becton Dickinson).

Inmunoensayo de IFN-γ e IL-2

Las concentraciones de IFN-γ e IL-2 en la cultura sobrenadantes de los linfocitos T CD4 + se midieron por duplicado por el sandwich ELISA cuantitativo usando citoquinas específicas de la captura con biotina mAb detección de citoquinas y las proteínas recombinantes (todos de Becton Dickinson), de acuerdo con las instrucciones del fabricante Protocolo. Los límites de detección de IFN-γ e IL-2 fueron 15 pg / ml.

Aislamiento de ARNm y PCR en tiempo real

Total celular ARN se extrajo de PB los linfocitos T CD4 + mediante un kit de aislamiento de ARN (RNeasy Mini kit, Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. CDNA fue sintetizado de RNA total con el virus de la leucemia murina Molony la transcriptasa inversa (EE.UU. bioquímicas, Cleveland, OH, EE.UU.) y oligo (dT) 15 primers (Promega, Madison, WI, EE.UU.). PCR en tiempo real se realizó con el LightCycler Instrument (Roche Diagnostics, Penzberg, Alemania) en capilares de vidrio. La mezcla de reacción que contiene Taq ADN polimerasa y el ADN de doble vertiente específica de I colorante SYBR Green (ADN Lightcycler Rápido "Master SYBR Green I; Roche Diagnostics) y primers específicos se han añadido a cDNA diluciones.

El cDNA muestras fueron desnaturalizados a 95 ° C durante 10 minutos, y luego fueron amplificados por 40-50 ciclos: a 95 ° C (10 s), a 65 ° C (15 s), y 72 ° C (22 s) para Β-actina; a 95 ° C (10 s), a 62 ° C (15 s), y de 72 ° C (10 s) para SOCS1, y en 96 ° C (10 s), a 68 ° C (15 S), y de 72 ° C (15 s) para SOCS3. La amplificación de las curvas de fluorescencia valores versus ciclo se obtuvieron, y un análisis de la curva de fusión se realizó. Los niveles de expresión SOCS3 y SOCS1 se determinó a través de la normalización en relación con β-actina de expresión. El avance y retroceso primers fueron las siguientes: en lugar de β-actina, 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 'y 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'; para SOCS1, 5'-AGACCCCTTCTCACCTCTTG-3 'y 5'-GCACAGCAGAAAAATAAAGC-3', y Para SOCS3, 5'-CCCGCCGGCACCTTTCTG-3 'y 5'-AGGGGCCGGCTCAACACC-3'.

Western blot

Los linfocitos T CD4 + fueron estimulados durante 20 min por el indicado concentraciones de IL-10 y IL-6 en una densidad de 5 × 10 5 células en 0,5 ml de medio de cultivo con un 10% de FCS. Para examinar el efecto del suero de IL-6 en la fosforilación de STAT, normal de los linfocitos T CD4 + fueron estimulados durante 20 minutos con 30% de suero de la AR activa en medio de cultivo con 40 μ g / ml neutralizar cabra anti-IL-6 policlonal de anticuerpos (IgG; Techne , De Princeton, NJ, EE.UU.) o el control de cabra IgG (Techne). Lisados de células enteras fueron preparados por la colocación en celdas de 100 μ l de buffer de lisis SDS (62,5 mM Tris-HCl [pH 6,8], 2% SDS, 10% de glicerol, 50 mM dithiothreitol, 0,1% bromphenol azul). Luego de 20 μ l de proteína muestras fueron fraccionado, el 10% geles de poliacrilamida-SDS y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido), y la membrana fue bloqueada con 5% de leche descremada en Tris-salina tamponada con 0,1% de Tween 20.

Fosforilación de la tirosina STAT1 y STAT3 se detectó utilizando kits comerciales disponibles (Señalización Cell Technology, Beverly, MA, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, la membrana se incubó con los anticuerpos (IgG conejo) de anticuerpos anti-STAT1, anti-tirosina fosforilados 701 de STAT1 de anticuerpos, los anticuerpos anti-STAT3, y anti-tirosina fosforilados 705 de STAT3 anticuerpos, como lo recomienda diluido en 1 / 2000 con Tris-salina tamponada con 0,1% de Tween 20 con un 5% de BSA. Unión de los anticuerpos fue detectado por peroxidasa de rábano-conjugadas anti-anticuerpos IgG de conejo diluido en 1 / 4000 con Tris-salina tamponada con 0,1% de Tween 20 con un 5% de BSA, y se reveló utilizando el sistema de quimioluminiscencia. Proteínas bandas se cuantificaron por densitometría usando NIH-Análisis de la imagen, y la fosforilación de STAT se comparó con la cantidad total de proteínas STAT. IFN-γ-Hela estimulado las células se utilizaron como control positivo de STAT1 phosophorylation.

Análisis estadístico

Los datos son expresados como el valor medio ± error estándar de la media o caja de parcelas. La significación estadística de las diferencias entre los dos grupos se determinó mediante la U de Mann-Whitney o la prueba de los rangos con signos de Wilcoxon test. P <0,05 fue considerado significativo.

Resultados
Resistencia a la IL-10 inhibición de la producción de IFN-γ en la AR los linfocitos T CD4 +

El itinerario estimuladoras CD28 es crucial para la eficacia de antígeno-específica de células T producción de citoquinas, y la IL-10 puede reprimir directamente esta respuesta mediante la inhibición de la fosforilación de tirosina CD28 y encuadernación de fosfatidilinositol 3-quinasa [24]. Para evaluar la capacidad de respuesta de la AR los linfocitos T CD4 + a IL-10, PB purificada de células T CD4 + de tres pacientes con AR activa y de tres controles sanos fueron estimulados por inmovilizados anticuerpo anti-CD3 y de anticuerpos anti-CD28 con o sin diluir las concentraciones De la IL-10 durante 36 horas, y la producción de IFN-γ se mide por ELISA. Como se muestra en la Fig. 1, la producción de IFN-γ por la activación normal de los linfocitos T CD4 + fue inhibido en la mayoría de las concentraciones tan bajas como 1 ng / ml de IL-10. Sin embargo, la AR los linfocitos T CD4 + son capaces de producir cantidades significativas de IFN-γ, en presencia de 1 ng / ml de IL-10, y la máxima, pero no por completo la inhibición de IL-10 se obtuvo a 10-100 ng / ml.

Por lo tanto, en comparación de los niveles de producción de IFN-γ por los linfocitos T CD4 + después de CD3 y CD28 costimulation en presencia de 1 ng / ml de IL-10 en pacientes con AR con enfermedad activa (múltiples inflamatorias articulares, CRP nivel ≥ 10 mg / l) E inactiva la enfermedad (en remisión, el nivel de CRP <10 mg / l) [26] y en controles sanos. No hubo diferencias estadísticamente significativas en la producción de IFN-γ sin IL-10 entre estos tres grupos (Fig. 2a], pero el efecto inhibidor de la IL-10 en la producción de IFN-γ fue significativamente limitado en el grupo de AR activa, en comparación con el RA grupo de inactivos y los controles (porcentaje de disminución: la AR activa, de 2,9 ± 14,4%; inactivos RA, 45,6 ± 14,4%; controles, el 65,8 ± 7,9%) (Fig. 2b]. Como consecuencia, los linfocitos T CD4 + de los pacientes con AR activa producido mayores niveles de IFN-γ, en presencia de 1 ng / ml de IL-10 que hizo normal los linfocitos T CD4 + (Fig. 2a].

Además, comparamos la producción de IL-2 por los linfocitos T CD4 + después de CD3 y CD28 costimulation en presencia de IL-10 en pacientes con AR activa y controles sanos. Del mismo modo, la producción de IL-2 no se vio afectada por 1 ng / ml de IL-10 en pacientes con AR (porcentaje de descenso, -2,1 ± 13,8%), mientras que se redujo significativamente en los controles sanos (61,1 ± 13,7%, P <0,05) . Tomados en conjunto, estos resultados indican que la RA los linfocitos T CD4 + se vuelven menos sensibles a la immunoregulatory efecto de la IL-10 durante la fase activa.

Incremento en la expresión de la superficie celular IL-RA 10R1 sobre los linfocitos T CD4 +

El complejo funcional del receptor de IL-10 se compone de dos subunidades, que es el principal componente ligando vinculante IL-10R1 y el accesorio componente de tipo 2, IL-10R [1]. IL-10R1 expresión desempeña un papel fundamental en las respuestas celulares a IL-10 [29]. Para examinar si la resistencia a la inhibición de IL-10 en la AR los linfocitos T CD4 + fue debido a la limitación de la expresión del receptor, la superficie de la célula expresión de la IL-10R1 PB sobre los linfocitos T CD4 + de los pacientes con AR activa y de los controles sanos fue determinada por citometría de flujo Análisis. Como se muestra en la Fig. 3a, 3b, la intensidad de la IL-10R1 expresión de los linfocitos T CD4 + fue significativamente mayor en los pacientes con AR en comparación con los controles sanos. Estos resultados sugieren que la vía de transducción de señales intracelulares de la IL-10 puede verse afectada en los linfocitos T CD4 + de la AR activa.

Defectuosa de IL-10 mediada por fosforilación de STAT3 en la AR los linfocitos T CD4 +

La interacción de la IL-10R con IL-10 induce la fosforilación de la tirosina y la activación de los factores de transcripción STAT1 latente y STAT3 [3]. Macrófagos específicas de los ratones deficientes STAT3-STAT3 demostrado que desempeña un papel dominante en la IL-10 mediada por anti-inflamatorios respuestas [5], que recientemente ha sido confirmado por los macrófagos humanos en los estudios de dominante-STAT3 sobreexpresión negativos [30]. La inducción de STAT1 y STAT3 fosforilación de la IL-10 PB en las células CD4 + T de los pacientes con AR activa y de los controles sanos se examinó utilizando el Western Blot. STAT3 fosforilación es dosis-dependiente inducida por IL-10 después de la activación de 20 minutos en condiciones normales de las células CD4 + T (Fig. 4a, 4b]. En cambio, se STAT3 fosforilados en recién aisladas PB células CD4 + de los pacientes con AR y STAT3 esta fosforilación es detectable durante un máximo de 6 horas. STAT3 fosforilación se amplió sólo cuando es activada por tanto como 10 ng / ml IL-10. Ambos sostenido STAT3 fosforilación y defectuosa de IL-10 inducida STAT3 fosforilación se encontraron en la AR ST los linfocitos T CD4 + (Fig. 4c]. Por otra parte, la IL-10 inducida por STAT1 fosforilación no se detectó en ninguno de los dos RA CD4 + o células T normales de las células CD4 + T (Fig. 4a]. Estos resultados indican que es el principal STAT3 IL-10-STAT activados en las células T CD4 +, y la IL-10 inducida por la activación STAT3 puede verse disminuida en la AR activa, en asociación con la fosforilación sostenido STAT3.

IL-6-mediada STAT3 fosforilación y la inhibición de la IL-10 en sentido normal de los linfocitos T CD4 +

STAT3 es activado por muchos factores de crecimiento y citoquinas como la IL-6, la familia de citocinas (IL-6, IL-11, factor inhibidor de leucemia, y oncostatin M), plaquetas factor de crecimiento derivado, y el factor de crecimiento epidérmico, además de IL-10 [4], pero estudios anteriores han demostrado que la IL-6 es el principal factor de líquido sinovial en la AR que induce la activación constitutiva de STAT3 en células mononucleares [31]. Dado que la IL-6 también es abundante en el suero de los pacientes con AR activa, frecuentemente detectado en> 1 ng / ml [27], hemos examinado si la exposición persistente de los linfocitos T CD4 + a altas concentraciones de IL-6 en la circulación de la sangre es responsable Para su activación sostenida STAT3 y resistencia a la inhibición de IL-10 en la AR activa. Ambos STAT1 y STAT3 activada por fosforilación fue IL-6 en condiciones normales de las células CD4 + T (datos no presentados), de acuerdo con observaciones anteriores [4]. Normal de los linfocitos T CD4 + fueron incubadas durante 20 min con medio de cultivo que contenga 30% de suero de los pacientes con AR activa y neutralizantes anti-IL-6 anticuerpo o el control de anticuerpos, y la fosforilación de STAT fue examinado por el oeste blot. RA suero fue capaz de inducir la fosforilación de la tirosina STAT3 pero no STAT1, y esta activación de STAT3 fue abolida por la mayoría de neutralización de la actividad IL-6 (Fig. 5a]. Estos resultados indican que la IL-6 es la dominante en la activación de STAT3-factor que figura en el suero de los pacientes con AR activa. La falta de activación de STAT1 por RA suero sugiere que las concentraciones mucho más elevadas de IL-6 puede ser necesario para la activación de STAT1 en comparación con STAT3 activación, o que los inhibidores de STAT1 señalización pueden estar presentes en el suero de la AR.

Seguidamente examinó si la IL-6 podría suprimir el efecto de la IL-10 que inhiben la producción de IFN-γ por los linfocitos T CD4 +. Después de la preincubación con o sin 10 ng / ml de IL-6 durante 36 horas, normal de los linfocitos T CD4 + fueron estimulados por CD3 y CD28 costimulation en la presencia o ausencia de 1 ng / ml de IL-10 durante 36 horas, y el IFN-γ La producción se mide por ELISA. IL-6 pretratamiento de las células normales la reducción de la IL-10 mediada por la inhibición de la producción de IFN-γ (Fig. 5b], lo que indica que las altas concentraciones de IL-6 podría modular la respuesta de células T de IL-10. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la exposición persistente a suero de IL-6 puede tener un papel en la inducción de la activación de STAT3 y la resistencia al efecto inhibitorio de la IL-10 en la AR los linfocitos T CD4 +.

Alta expresión de mRNA SOCS1 RA en los linfocitos T CD4 +

IL-6 induce dos inhibidores potentes de JAKs (SOCS1 y SOCS3 proteínas) que no sólo actúan como mediadores de la retroalimentación negativa de inhibición, pero también desempeñan un papel importante en la inhibición por oponerse a interferencias de otras vías de señalización de citoquinas-[7]. SOCS3 Recientemente se ha demostrado que la STAT3 en concreto, inhibe la activación inducida por la IL-6 pero no de IL-10, con lo que la diferencia de la regulación de la acción de IL-6 y IL-10 [8, 9]. Por el contrario, SOCS1 es capaz de inhibir parcialmente la IL-10 mediada por activación de STAT3 y respuestas celulares, así como de IFN-γ mediada por la activación STAT1 [32]. Para determinar si SOCSs participaron en el defectuoso IL-10 inducida por la activación de STAT3 RA los linfocitos T CD4 +, los niveles de mRNA SOCS1 y SOCS3 PB expresión en los linfocitos T CD4 + de los pacientes con AR activa y de controles sanos fueron comparados por semicuantitativo real PCR a tiempo. La RA los linfocitos T CD4 + que figuran mayores niveles de SOCS1 pero SOCS3 niveles más bajos de las transcripciones que hizo de control de los linfocitos T CD4 + (Fig. 6a]. Constitutiva expresión de mRNA SOCS1 RA en los linfocitos T CD4 + fue comparable con la expresión normal de los linfocitos T CD4 + estimulado por 10 ng / ml IL-6 (Fig. 6b], el apoyo a su importancia funcional. Defectuosa de IL-10 inducida por la activación STAT3, por tanto, parece deberse, al menos en parte, a una abundancia de SOCS1 RA en los linfocitos T CD4 +.

Discusión

Los linfocitos T CD4 + orquestar la de tipo Th1 mediada por células respuesta inmune en la AR [22]. Activan los linfocitos T CD4 + estimular macrófagos, fibroblastos sinoviales, células B, y los osteoclastos a través de la expresión de moléculas de superficie celular y citoquinas Th1, contribuyendo así a la inflamación crónica y en la destrucción. Los linfocitos T CD4 + requieren dos señales para ser activado; antígeno de ocupación de los receptores CD28 y mediada costimulation. En el ST lesión, los ligandos CD28, CD80 y CD86 tanto, junto con los antígenos MHC clase II, son sustancialmente expresadas por células presentadoras de antígeno, como macrófagos y células dendríticas [18 - 20]. La importancia de CD28 en la participación de células T mediada proceso de la enfermedad ha sido recientemente demostrado por la eficacia clínica de su bloqueador citotóxica de células T antígeno asociado 4 (CD152)-IgG en los pacientes con AR [23].

IL-10 desempeña un papel predominante en la limitación de las respuestas inmunes e inflamatorias mediante la regulación de la función de los macrófagos y las células Th1 [1]. IL-10 inhibe la fosforilación de la tirosina de la molécula CD28 y el posterior fosfatidilinositol 3-quinasa en las células T vinculante, y, por tanto, directamente actúa sobre las células T [24]. En el presente estudio, encontramos que PB células CD4 + T de los pacientes con AR activa, en presencia de IL-10, son capaces de producir mayores niveles de IFN-γ después de CD3 y CD28 costimulation de lo normal de células T CD4 +. A pesar de alto nivel de IL-10R1 expresión y de la activación constitutiva STAT3, IL-10 inducida por la fosforilación de la tirosina STAT3 es reprimida en la AR los linfocitos T CD4 +, en contraste a la normalidad los linfocitos T CD4 +, donde STAT3 fosforilación es dosis-dependiente inducible por IL -10. Las concentraciones séricas de IL-6 de los pacientes con AR induce STAT3 pero no STAT1 fosforilación normal en los linfocitos T CD4 +, y exógenos IL-6 induce la resistencia a la IL-10 inhibición de la producción de IFN-γ. RA los linfocitos T CD4 + contener niveles más altos de SOCS1 pero contienen niveles más bajos de SOCS3 transcripciones en comparación con el normal de los linfocitos T CD4 +. Estos resultados indican que los linfocitos T CD4 + se vuelven resistentes al efecto inhibidor de la IL-10 antes de la migración en los inflamado ST, y sugieren que esta resistencia puede deberse a alteración de la IL-10 dependiente de la activación STAT3, en asociación con la fosforilación y sostenido STAT3 SOCS1 inducción.

IL-10 mediada por la inhibición de CD4 + de células T es principalmente la producción de citoquinas dependientes de su inhibición de los macrófagos de la presentación de antígeno función de la célula beta [1]. Sin embargo, este efecto inhibidor indirecto se piensa que es restringido en el lugar de la activación de células T en la AR, ya que los macrófagos en el ST expresar altos niveles de citoquinas, moléculas CD80 y CD86, y los antígenos MHC clase II [10, 18 - 20] . Más recientemente, la IL-10 se ha demostrado que induce el antígeno-específica de células T CD28 apatía mediante la inhibición de la fosforilación de tirosina [33]. Este efecto directo también puede ser limitada en los pacientes con AR activa, porque sus PB los linfocitos T CD4 + mostró un defectuoso IL-10-CD28 inhibición de la producción de ambos costimulated IFN-γ e IL-2.

Numerosas citocinas, tanto proinflamatorias y antiinflamatorias, se han detectado en la ST de la AR, y el equilibrio entre esos opuestos de citoquinas regula las actividades de la gravedad de la enfermedad [10]. Endógena de IL-10, producida principalmente por macrófagos y células T, inhibe la producción de citoquinas proinflamatorias por las células ST [12]. Sin embargo, esta actividad normativa parece estar restringido durante la inflamación crónica. La activación de los estímulos extracelulares reguladas quinasa quinasa p38 y vías, inducida por el TNF-α y la IL-1, inhibe la Jak1-STAT3 compartidos por vía de señalización de IL-10 e IL-6, se adhirieron macrófagos [13]. Más importante aún, IL-10 mediada por activación de STAT3 es casi indetectable en la AR sinovial macrófagos. Esta alteración de la señalización de IL-10 es probablemente inducida por la exposición crónica a los complejos inmunes in vivo, porque ambos superficie celular IL-10R1 expresión y de IL-10 inducida por la activación Jak1 son reprimidas en IFN-γ-priming macrófagos por una proteína quinasa C-dependientes Después de la ligadura de la vía de la IgG receptor Fc gamma [14]. Además, las células dendríticas de los fluidos RA sinovial son resistentes a la immunoregulatory efecto de la IL-10 debido a una disminución del transporte intracelular de IL-10R1 en presencia de estímulos de citoquinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1, y la colonia de granulocitos y macrófagos - Factor estimulante [15]. Hemos demostrado que la resistencia de la AR los linfocitos T CD4 + a IL-10 puede estar asociado a defectos de IL-10 que dependen de STAT3 activación, pero no con IL-10R1 expresión. Efectos inhibitorios de la IL-10 en estos tipos de células inflamatorias, por lo tanto, son moduladas diferencialmente en la transducción de señales en el marco del nivel medio inflamatoria en la AR.

En asociación con problemas de IL-10 mediada por activación de STAT3, STAT3 resultó ser tirosina fosforilados persistente (hasta 6 horas) en recién aisladas PB y ST células CD4 + T de los pacientes con AR. STAT3 es activada por una variedad de citoquinas, en particular la IL-6, la familia de las citoquinas (por ejemplo, IL-6, IL-11, factor inhibidor de leucemia, y oncostatin M) y factores de crecimiento, además de la IL-10 [4]. De estas citoquinas, la IL-6 juega un papel preponderante en la obtención de reacciones sistémicas a como la respuesta de fase aguda en la AR activa, debido principalmente a su abundancia en la circulación de la sangre [27]. De acuerdo con este concepto, la IL-6 fue el principal factor de activación de STAT3-contenida en el suero de los pacientes con AR activa, y la respuesta a IL-10 fue suprimida en condiciones normales de las células CD4 + T después de 36 horas de incubación con IL-6. Estos resultados sugieren que tanto la activación sostenida STAT3 y la resistencia a la inhibición de IL-10 se encuentran en la AR los linfocitos T CD4 + puede ser inducida después de la exposición crónica en vivo a altas concentraciones séricas de IL-6. Sin embargo, también es posible que STAT3 actividad podría ser constitutivamente inducida en los linfocitos T CD4 + por su propia secreción de IL-10, que conduzca a la pérdida de la sensibilidad a la exógena de IL-10, debido a la AR los linfocitos T CD4 + en el ST son capaces de Niveles significativos de la producción de IL-10 [34].

Los linfocitos T CD4 + aisladas de la ST de la AR también mostró un defecto en la IL-10 inducida STAT3 vía de señalización. Es más probable que la resistencia de los linfocitos T CD4 + a IL-10 pueden ser incluso aumentada después de la migración en los inflamado ST, IL-6, porque está muy concentrado en comparación con el nivel de sangre [27]. Además, la participación de otras citoquinas proinflamatorias esencial en este proceso fue sugerido por nuestros experimentos preliminares que demuestran que la IL-10 mediada por la inhibición del IFN-γ en los linfocitos T CD4 + se redujo en un pretratamiento con IL-1 β y TNF-α, aunque menos Eficacia que por la IL-6 (datos no presentados). Además, el IFN-γ e IL-10 producidas por los linfocitos T CD4 + mismos pueden ser responsables de la alteración de la señalización de IL-10 en el ST, porque los infiltrados de células T producen citocinas ambos [34, 35]. En una forma autocrina, IL-10 Mayo persistentemente estimular la activación de STAT3 y IFN-γ puede inducir proteína SOCS1 como un crosstalk inhibidor de la IL-10 de señalización [32]. Las células T-efecto inhibitorio de la IL-10 puede ser modulada complicatedly a la exposición a una respuesta inflamatoria en la AR entorno de las articulaciones, en los que muchas citoquinas están presentes sustancialmente [10].

STAT3 activación ha sido implicado en la patogénesis de la AR. Active STAT3 es constitutivamente expresada en el líquido sinovial de células mononucleares de los pacientes con AR [36]. IL-6 es el principal factor de activación de STAT3-presente en el líquido sinovial, que tiene un papel crucial en la activación de los monocitos funciones tales como la expresión de genes de los receptores Fc gamma tipo I y tipo III y del HLA-DR [31]. Más recientemente, los altos niveles de STAT3 activada, que se consideran inducida principalmente por la IL-6, se han detectado en el ST, y la activación de STAT3 se ha demostrado que el estar involucrados en la proliferación de fibroblastos sinoviales y la producción de IL-6 [37]. En este sentido, STAT3 es fundamental en la supervivencia y la expansión del factor de crecimiento de fibroblastos sinoviales dependientes [38]. Además, la importancia de la persistencia de STAT3 en la señalización de células Th1-dominado por la artritis autoinmune ha sido sugerido por estudios de la gp130 F759 F759 / F759 F759 ratones, en el que la homología Src fosfatasa-2 sitio de unión de gp130 (glicoproteína transmembrana de la subunidad β de La IL-6, la familia de receptores de citoquinas), la tirosina 759, se ha mutado para fenilalanina [39]. En la gp130 F759 F759 / F759 F759 ratones, las células T, CD4 + en particular las células T subconjunto, están crónicamente activados y resistentes a la activación de la muerte celular inducida por gp130 a través de la activación mediada por STAT3.

La longevidad de las señales de citoquinas transduced por la vía de JAK-STAT está regulada por la familia de proteínas SOCS [7]. Se encontró que los linfocitos T CD4 + de pacientes con AR activa expresaron mayores niveles de SOCS1, pero niveles más bajos de SOCS3, en comparación con el normal de los linfocitos T CD4 +. SOCS1 impide la activación de JAK directamente por unión a JAK, y SOCS3 inhibe la acción de JAK por su unión a la homología Src fosfatasa-2-vinculante dominio de los receptores como gp130 [40]. SOCS1 y SOCS3 son inducidos por diversas citoquinas, incluyendo IL-6 y IL-10, como mediadores de votos negativos y de inhibición de crosstalk [7]. Estudios recientes con ratones que carecen de SOCS3 o SOCS1 reveló que SOCS3 es un regulador negativo de la señalización de IL-6, pero no de IL-10 de señalización. Estudios de SOCS3 condicional de los ratones deficientes han demostrado que la deficiencia de SOCS3, pero no SOCS1 deficiencia, los resultados sostenidos en la activación de STAT3 en respuesta a IL-6 [8, 41]. El análisis de SOCS3 déficit de macrófagos ha indicado que SOCS3 es un inhibidor crucial de la IL-6 inducida respuesta transcripcional [42]. Sin embargo, SOCS3 es prescindible para los votos negativos y de inhibición de la immunoregulatory acción de la IL-10 en macrófagos [41]. Por el contrario, SOCS1 se encontró directamente a inhibir la IL-10 de señalización mediada [43]. El aumento de SOCS1 expresión en la AR los linfocitos T CD4 + pueden estar asociados con la alteración de la respuesta a IL-10 y IL-10 mediada por activación de STAT3, y defectuosos SOCS3 expresión pueden ser responsables de la persistencia de STAT3 activación en respuesta a IL-6 suero .

Existe la posibilidad de que la inducción SOCS1 puede estar asociada con la capacidad de los linfocitos T CD4 + para producir IFN-γ, ya que los linfocitos T CD4 + de la AR activa puede producir altos niveles de IFN-γ, en presencia de IL-10, y porque IFN-γ ha sido conocido como un potente inductor de SOCS1 [32]. Es de interés en este sentido al indicar que polarizó las células Th1 y Th2 expresan altos niveles de mRNA SOCS1 y SOCS3, respectivamente [44]. IL-12 inducida por la activación STAT4 es inhibida por SOCS3 inducción en células Th2, mientras que la IL-4 inducida STAT6 señalización SOCS1 se ve disminuida por inducción en células Th1. SOCS1 y SOCS3 pueden tener importantes funciones específicas como Th1 y Th2 específicas, mutuamente excluyentes, transversal hablar represores de la IL-4-STAT6 y la IL-12-STAT4 vías de señalización, respectivamente. En consonancia con esta idea, PB células T de los pacientes con enfermedades alérgicas significativamente expresar altos niveles de SOCS3 transcripciones, y la SOCS3 expresión se correlaciona bien con los niveles séricos de IgE y patología de la enfermedad [45]. Superior SOCS1 expresión con menor SOCS3 PB expresión en los linfocitos T CD4 + de los pacientes con AR, en comparación con los controles sanos, por lo tanto, es probable que en consonancia con sus sistémica sesgo hacia un fenotipo Th1, como ya ha sido demostrado [46 - 49].

Conclusión

Las células CD4 + T de los pacientes con AR activa se caracterizan por su resistencia a la IL-10 inhibición de la producción de IFN-γ, debido a la fosforilación constitutiva STAT3 y alteración de la IL-10 mediada por activación de STAT3. La defectuosa señalización de STAT3 es posiblemente asociados con predominio SOCS1 más de SOCS3. Estas anomalías en la AR activa se cree que son inducidos principalmente después de la exposición crónica a altas concentraciones de IL-6. La limitada eficacia de la IL-10 tratamiento de los pacientes con AR [50] se puede explicar en parte por la apatía de la IL-10 de células inflamatorias, incluyendo células T. Por el contrario, la eficacia terapéutica de los anti-IL-6 receptor de anticuerpos ha reportado en los pacientes con AR [51], y uno de los efectos de este tratamiento puede ser la de normalizar las células T a través de la inhibición de IL-6 dependiente de la activación STAT3 . Más específicos dirigidos a la terapia de activación de STAT3 se espera, por ejemplo, la inducción del gen SOCS3, la eficacia de la que se ha demostrado en modelos animales [37].

Abreviaturas

BSA = albúmina sérica bovina; CRP = proteína C-reactiva, ELISA = ensayo inmunoenzimático; Fc = crystallazibe fragmento; FCS = suero de ternera fetal; FITC = fluoresceína isotiocianato; IFN-γ = interferón gamma; interleucina IL =; IL - 10R = receptor de la interleukina-10, IL-10R1 = tipo 1 del receptor de interleucina-10; JAK = Janus quinasa; mAb = anticuerpo monoclonal; MHC = complejo principal de histocompatibilidad; PB = sangre periférica; PBMC = células mononucleares de sangre periférica; PBS = fosfato - Salina tamponada; PCR = reacción en cadena de polimerasa; AR = artritis reumatoide; SOXS = supresor de citocinas de señalización; ST = tejido sinovial; STAT = transductor de señales y activador de la transcripción; Th = células T helper; TNF-α = factor de necrosis tumoral alfa.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Jiro Yamana era responsable de los experimentos y el análisis de datos y escribió el informe. Masahiro Yamamura encargada de la planificación de la investigación y escribió el manuscrito. Akira Okamoto, Tetsushi Aita, Mitsuhiro Iwahashi, y Katsue Sunahori ayudó a los experimentos. Hirofumi Makino leer críticamente el manuscrito.

Agradecimientos

Los autores se agradecen a la Dra S. Yamana (Higashihiroshima Memorial Hospital, Hiroshima, Japón) para el suministro de muestras clínicas. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones (14570413/16590982) del Ministerio de Educación, Ciencia, Cultura y Tecnología del Japón.