PLoS Medicine, 2005; 2(3): (más artículos en esta revista)

La visualización no invasiva de la Activado α v β3 integrina en el cáncer de los pacientes y la Tomografía por Emisión de Positrones [18 F]-Galacto RGD

Biblioteca Pública de la Ciencia
Roland Haubner [1], A Wolfgang Weber [1], Ambros J Cerveza [1], Eugenija Vabuliene [1], Daniel Reim [1], Mario Sarbia [3], Karl-Friedrich Becker [3], Michael Goebel [4 ], Rüdiger Hein [5], Hans-Jürgen Wester [1], Horst Kessler [6], Markus Schwaiger [1]
Resumen
Antecedentes

La integrina α v β3 desempeña un papel importante en la angiogénesis tumoral y la metástasis de las células, y actualmente está siendo evaluado como un objetivo para nuevos enfoques terapéuticos. Varias técnicas se están estudiando a fin de que la determinación no invasiva de α v β3 expresión. Desarrollamos [18 F]-Galacto RGD, un F-18 etiquetados glicosilada α v β3 antagonista, que permite la vigilancia de α v β3 expresión con tomografía por emisión de positrones (PET).

Métodos y resultados

Aquí por el análisis cuantitativo de las imágenes resultantes de un pequeño animal-escáner de PET que la captación de [18 F]-Galacto RGD en el tumor se correlaciona con α v β3 expresión posteriormente determinada por análisis de Western blot. Además, usando el A431 humanos carcinoma de células escamosas modelo que demuestran que este método es lo suficientemente sensible para visualizar α v β3 expresión resultante exclusivamente de la vasculatura tumoral. Lo que es más importante, este estudio muestra, que [18 F]-Galacto RGD no invasiva con PET permite la evaluación cuantitativa de la α v β3 patrón de expresión en las células endoteliales del tumor y en los pacientes con tumores malignos.

Conclusiones

Con imágenes moleculares [18 F]-Galacto RGD y PET puede aportar datos importantes para la planificación y la supervisión de las terapias anti-angiogénicos la orientación α v β3 integrinas y puede revelar la participación y el papel de esta integrina en los procesos angiogénicos metastásico y en diversas enfermedades.

Introducción

Célula-célula y célula-matriz de interacciones desempeñan papeles esenciales en la angiogénesis tumoral y las metástasis. Integrinas son una de las clases principales de los receptores involucrados en estos procesos. Además de tener funciones adhesivo, la transducción integrinas mensajes a través de distintas vías de señalización e influir en la proliferación y la apoptosis de las células tumorales, así como de activar las células endoteliales. Un destacado miembro de esta clase es el receptor de la integrina α v β3. Se ha demostrado que la α v β3 es un importante receptor que afectan el crecimiento del tumor, invasión local, y el potencial metastásico [1, 2]. Esta integrina se expresa en diferentes tumores malignos y media la adhesión de las células tumorales en una variedad de proteínas de la matriz extracelular, lo que permite a estas células migran durante la invasión y extravasación [3].

La integrina α v β3 también está altamente expresado en células endoteliales activadas durante la angiogénesis [4]. En cambio, la expresión de α v β3 es débil en las células endoteliales de descanso y la mayoría de los sistemas de órganos normal [5]. En las células endoteliales activadas, el mediador de la migración a través de los receptores de la membrana basal durante la formación del nuevo buque, que es esencial para el suministro suficiente de nutrientes de la creciente tumor. La inhibición de la α v β3 mediada por células, matriz de interacción se ha encontrado para inducir la apoptosis de las células endoteliales activadas. Así, el uso de antagonistas α v β3 actualmente está siendo evaluado como una estrategia de tumor específicas contra el cáncer terapias [6, 7, 8]. Debido a la debilidad de expresión en la no activan las células endoteliales, el tratamiento con antagonistas α v β3 no afecta a los vasos sanguíneos preexistentes. La inhibición de la formación de vasos sanguíneos en el tumor utilizando modelos α v β3 bloques antagonistas, no sólo asociadas a la angiogénesis tumoral, pero en algunos casos los resultados de la regresión del tumor [9].

Sin embargo, los antagonistas α v β3 puede inducir la apoptosis no sólo de las células endoteliales activadas, pero también de α-v β3 positiva células tumorales [10], resultando en un efecto tóxico directo sobre las células tumorales. Además, el bloqueo de los receptores de las células tumorales expresaron puede reducir la propagación de invasión y de metástasis [11]. Además, α v β3 vinculante moléculas han sido utilizados con éxito a la "meta" una variedad de agentes terapéuticos para el tejido tumoral. Estas incluyen agentes quimioterapéuticos [12], cDNA-codificación anti-angiogénicos genes [13], y los linfocitos T [14].

Estos alentadores estudios experimentales ya han dado lugar a la evaluación inicial de los ensayos clínicos el uso de antagonistas α v β3 (por ejemplo, vitaxin [15] y cilengitide [16]] en pacientes con diversos tumores malignos [17, 18, 19, 20]. Actualmente dispone de las técnicas de imagen son limitados en el seguimiento de tratamiento con esta clase de fármacos. La actividad anti-tumor en general es evaluada por la determinación del porcentaje de pacientes en los que una reducción significativa en el tamaño del tumor se realiza durante un período relativamente corto de terapia ( "tasa de respuesta"). Por lo tanto, este método puede no ser aplicable para una forma de terapia que se dirige a las enfermedades de estabilización y prevención de la metástasis. Nuevos métodos se necesitan con urgencia para la planificación y el seguimiento de tratamientos dirigidos a la integrina α v β3.

Sobre la base de la ciclooxigenasa (-Arg-Gly-Asp - D Phe-Val-) [21], una variedad de radiomarcada α v β3 antagonistas de la tomografía por emisión de fotón único y tomografía por emisión de positrones (PET) se han desarrollado (para revisión ver [22, 23]]. [18 F]-Galacto RGD (arginina-glicina-ácido aspártico), una glicosilada pentapeptide cíclico, el resultado de la consiguiente optimización de seguimiento [24] sobre la base de la primera generación péptido [125 I]-3-iodo - D Tyr 4-ciclooxigenasa (-Arg-Gly-Asp - D Tyr-Val-) [25] y mostró gran afinidad y selectividad de la integrina α v β3 in vitro, los receptores específicos de acumulación de α-v β3 tumores positivos, y la alta estabilidad metabólica en un modelo murino de tumor, así como la rápida, principalmente la eliminación renal [ 26, 27]. Aquí describimos cómo [18 F]-Galacto RGD permite la cuantificación de α v β3 expresión in vivo, demuestran que la angiogénesis inducida por tumor pueden ser controlados en un modelo murino de tumor, y por primera vez, a nuestro conocimiento, demostrar que esta clase de marcadores Puede utilizarse en los pacientes no invasivo para la determinación de α v β3 expresión.

Métodos
Síntesis Tracer

Síntesis de los precursores de etiquetado y posterior etiquetado F-18 se llevó a cabo tal y como se describe [27]. Para su aplicación en los pacientes, después de cromatografía líquida de alta la fracción recogidos se evapora en seco; 0,5 ml de etanol absoluto y 10 ml de solución salina amortiguadora de fosfato (pH 7.4) se han añadido, y el producto fue aprobada a través de un filtro Millex GV ( Millipore, Eschborn, Alemania). El control de calidad del producto se llevó a cabo de acuerdo a las exigencias de las autoridades reguladoras locales.

Murino de tumor modelos

Para la evaluación in vivo, modelos xenotransplanted humanos melanoma (M21 y M21-L) y un carcinoma de células escamosas humanos modelo (A431) fueron utilizados. El M21 línea celular expresando α v β3 [25, 28] actuó como un control positivo y el M21-L línea celular, una línea celular estable variante de la M21 no transcribir el gen α v, como un control negativo [29]. Condiciones para el cultivo de células M21 y M21-L células se describen en otra parte [26]. Protocolos similares fueron utilizados para las células A431.

El protocolo experimental con animales fue aprobado por el Comité Veterinario de Medicina del Estado de Baviera; manejo de los animales se realizó de acuerdo a las normas establecidas por el Comité Veterinario de Medicina.

Con el fin de estudiar la correlación entre α v β3 expresión y de la captación de tumor [18 F]-Galacto RGD, que se inyecta por vía subcutánea ratones con mezclas de M21 y M21-L células. Experiencias piloto ha indicado que la inyección de 1,5 × 10 6 M21 células dentro de las 4 semanas conduce a la formación de tumores de un diámetro aproximado de 8 mm. Para obtener tamaño similar M21-L tumores, es necesario inyectar 6 × 10 6 células. En el estudio de los tumores con aproximadamente el 10%, 25%, 50%, 75% y M21 células, los ratones inyectados con las siguientes mezclas de M21 y M21-L células: 1,5 × 10 5 / 5,4 × 10 5, 3,8 × 10 5 / 4,6 × 10 6, 7,5 × 10 5 / 3 × 10 6, y 1,1 × 10 6 / 1,5 × 10 6. Cuatro semanas después de la inoculación, desnuda ratones fueron inyectados con 7,4 MBq de [18 F]-Galacto RGD y escaneen en el pequeño animal-PET. Posteriormente, los tumores y otros órganos de interés fueron disecados, de inmediato contó, cortado en dos pedazos y congelado para seguir workup.

Para experimentos con el modelo de carcinoma de células escamosas, de aproximadamente 10 6 A431 células fueron inyectadas por vía subcutánea en ratones desnudos. Dos semanas después de la inoculación, el 7,4 MBq de [18 F]-Galacto RGD fue inyectado, y los ratones fueron digitalizadas en el animal PET. Los animales fueron sacrificados, y los órganos de interés y, posteriormente, se diseccionaron y pesaron contado o utilizados para el análisis inmunohistoquímico.

Inmunohistoquímica

Por inmunohistoquímica investigación, congelados los tejidos tumorales de los ratones, así como de los pacientes, se seccionaron (6 μ m) y teñidas utilizando la biotina monoclonal anti-α v β3 anticuerpos LM609 (1:100; Chemicon Europa, Hofheim, Alemania). Para la tinción de la subunidad β murino, un hámster monoclonal anti-ratón de anticuerpos (1:10; Chemicon Europa) y un anti-biotina ratón hámster secundaria de anticuerpos IgG (1:200; Chemicon Europa) se utilizaron. Secciones fueron procesados por la tinción de peroxidasa (peroxidasa sustrato KIT AEC, Vector Laboratories, Burlingame, California, Estados Unidos).

"Western Blotting

El tejido del tumor congelado fue homogeneizada y extrajeron con buffer de lisis (50 mM Hepes (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10% de glicerol, 1% Tritón X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 mM Na 4 P 2 O 7, 1 mM MSF, 10 μ g / ml aprotinina, 10 μ g / ml Leupeptin). Concentración de proteínas fue determinada de acuerdo a Bradford [30] y adaptarse a los valores equivalentes utilizando buffer de lisis. Después de SDS-PAGE y transferencia, immunoblotting se llevó a cabo utilizando un policlonal de conejo anti-α v anticuerpos (1:500; Chemicon Europa) y un 125 I-etiquetados burro policlonal anti-conejo de anticuerpos IgG (1:400; 477 kBq / μ g, Amersham BUCHLER, Braunschweig, Alemania). Para el análisis, blots fueron colocados sobre una pantalla de fósforo para 2 d. Para lectura, una dinámica molecular PhosphorImager 445 SI (Sunnyvale, California, Estados Unidos) se utilizó.

Los estudios de PET con una pequeña Animal Scanner

De imágenes PET-teniendo tumor de los ratones se realizó con un prototipo a pequeña animal tomógrafo de positrones (PET Munich Avalanche Photodiode; [31]]. El animal escáner consta de dos sectores, que comprende tres módulos cada detector, que giran alrededor de los animales para la adquisición completa de las proyecciones en una rebanada transaxial (30 pasos angulares). Cada módulo consta de ocho pequeños (3,7 × 3,7 × 12 mm3) lutetium-oxy-orthosilicate cristales leído por arrays de fotodiodos de avalancha. Lista modo se reconstruyen utilizando datos estadísticos, incluidos los métodos iterativo espacialmente dependientes de la línea de propagación función. Reconstruido resolución de la imagen es de 2,5 mm (anchura completa a la mitad como máximo) transaxial en un campo de visión de 7,5 cm, y el trozo es de 2 mm de espesor. Noventa minutos después de la inyección de aproximadamente 7,4 MBq de [18 F]-Galacto RGD, los animales fueron colocados en el interior de la propensos tomógrafo, y un trozo transaxial tumor a través de la región se midió para 480 s

Paciente de estudios

El protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética de la Klinikum Rechts der Isar (Protocolo S1], y dio a cada paciente y el consentimiento informado por escrito antes del estudio (Protocolo S2]. Nueve pacientes fueron digitalizadas (cinco mujeres y cuatro varones, la edad, y 26-75), que sufrió tanto de melanoma maligno con metástasis a los ganglios linfáticos (etapa IIIb; pacientes 1-3), el melanoma maligno con metástasis a distancia (etapa IV, 4 pacientes Y 5), condrosarcoma (6 pacientes), sarcoma de tejidos blandos (paciente 7), metástasis óseas de carcinoma de células renales (8 pacientes), o villonodular sinovitis de rodilla (paciente 9). La selección de los pacientes se centraba en el melanoma y sarcoma porque existe considerable evidencia de que estos tipos de tumores expresar α v β3.

El diagnóstico previo a la digitalización se hizo por biopsia (pacientes 6-8), por la TC (pacientes 1, 2, y 4-8), por la RM (paciente 9), y / o por [18 F] fluorodeoxiglucosa ([18 F] FDG)-PET (pacientes 1-4 y 8). Tras la digitalización, el diagnóstico fue confirmado por cirugía y estudio histopatológico de la muestra resectioned (pacientes 1, 2, 5, 6, 8, y 9) o por combinación de análisis morfológico de imágenes, [18 F] FDG PET, y la clínica del paciente Datos y de la historia (pacientes de 3, 4 y 7).

Por inmunohistoquímica, la muestra especímenes (pacientes 1, 2, 5, 6, 8, y 9) fueron broche de congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -70 ° C hasta que se realizó la tinción. Se tomaron muestras de tejido en el plazo de 1 semana después de la digitalización de las regiones del tumor con la máxima absorción de traza. Microscopía Óptica evaluación de la densidad de α-v β3 influjo positivo microvasos se realizó como se describió anteriormente [32]. En pocas palabras, las zonas con mayor densidad de α-v β3 influjo positivo microvasos se identificaron utilizando el escaneo de aumento. Posteriormente, α-v β3 influjo positivo microvasos se contaron en tres campos adyacentes microscópicas × 40 usando un lente de aumento y 10 × ocular, correspondiente a un área de 0,588 mm 2. Determinación de la densidad microvessel fue realizada por un patólogo superiores (MS), que estaba cegado por los resultados de la correspondiente normalización de la captación de valor (SUV) análisis de la acumulación de trazador. Entonces la correlación entre los valores medios del buque y las correspondientes SUVs se analizó.

PET se realizó mediante un escáner PET ECAT Exact (Siemens-CTI, Knoxville, Tennessee, Estados Unidos). Después de la inyección de 144-200 MBq de [18 F]-Galacto RGD, tres scans de emisión (a partir de 7 ± 2,7 min, 10,5 ± 37 min, y 79 ± 18,4 min post inyección [pi]) del cuerpo y del tallo, Si fuera necesario, de tumor de las regiones fuera del cuerpo tallo se obtuvieron. Para un paciente, sólo una exploración a partir 120 min. PI se llevó a cabo. Atenuación de la decadencia y de la corrección de las imágenes fueron reconstruidas por medio de una expectativa de subconjuntos ordenados maximización algoritmo. La acumulación de [18 F]-Galacto RGD se evaluó mediante el cálculo de la media SUV normalizado al cuerpo del paciente peso de acuerdo a la siguiente fórmula [33]: (mide la concentración de actividad [Bq / ml] x peso corporal [kg]) / inyectado Actividad [Bq]. El axial rebanada de la lesión con la máxima actividad de la acumulación fue elegido por estimación visual, de una región de interés, con un diámetro de 15 mm fue seleccionado sobre la lesión, y la media resultante SUV se utilizó para profundizar el análisis. Para las lesiones de menos de 2 cm de diámetro, de una región de interés, con un diámetro de 10 mm y se utilizó el análisis se basó en la máxima SUV más que significa SUV, con el fin de minimizar los efectos de volumen parcial, que podría llevar a una subestimación de la SUV.

Dosimetría cálculos se basan en el programa MIRDOSE 3,0. Los datos de los seis pacientes fueron analizados mediante la selección de regiones de interés con un diámetro de 1,5 cm en la fuente de órganos (pulmón, hígado, bazo, riñones, músculos, vejiga, intestino, y el corazón [ventrículo izquierdo]). Mediciones de la actividad (en Becquerels por centímetro cúbico) se realizaron para los tres scans consecutivos (tiempo medio pi ± desviación estándar, 7 ± 2,7 min, 10,5 ± 37 min, y 79 ± 18,4 min, respectivamente), utilizando una monoexponencial aptos para el cálculo de los Tiempos de residencia. El volumen de la fuente órganos de pulmón, el hígado, el bazo y los riñones se mide por volumetría CT (Siemens, Forchheim, Alemania) en cuatro pacientes. Por la otra fuente de órganos en estos cuatro pacientes y todos los órganos en los otros dos pacientes, la normalización de los valores del volumen de la fuente de órganos adaptados a la situación del paciente de peso corporal se utilizaron.

Métodos estadísticos

Todos los datos cuantitativos se expresan como media + / - una desviación estándar. La correlación entre los parámetros cuantitativos se evaluó mediante análisis de regresión lineal y el cálculo del coeficiente de correlación de Pearson. Significación estadística fue probado mediante el uso de análisis de varianza (ANOVA).

Resultados
Correlación con la absorción de Tracer α v β3 Expresión

Hemos demostrado anteriormente, utilizando un modelo murino de tumor en el que las células tumorales son o bien α v β3-positivos (melanoma humano M21) o α-v negativo (melanoma humano M21-L), que [18 F]-Galacto RGD muestra de receptores específicos de acumulación En la α-v β3 positivos de tumor [26]. Aquí se estudió la correlación de [18 F]-Galacto RGD absorción con el nivel de α v β3 expresión. Hemos inyectado células tumorales mezclas que contienen cantidades cada vez mayores de α-v β3 positivo M21 células por vía subcutánea en ratones desnudos. Transaxial imágenes de los ratones después de 4 semanas de inoculación de células y 90 minutos después de la inyección de trazador utilizando un prototipo de pequeña animal escáner PET [31] mostraron aumento de la absorción en el marcador tumoral que corresponde con el porcentaje de los receptores de las células positivas (Figura 1 Ay 1 B) .

Hemos validado estos resultados cualitativos mediante la determinación de la cantidad relativa de la subunidad α v en la disecados tumores a través de Western blot (Figura 1 C). Estos datos se correlacionaron con el tumor / fondo cocientes resultantes de los análisis cuantitativos de las imágenes PET (Figura 1 D), así como con el tumor / músculo cocientes resultantes de la biodistribución análisis llevado a cabo después de que el estudio de PET (Figura 1 D) . Ambos análisis mostraron una correlación significativa entre [18 F]-Galacto RGD y relativos α v expresión, lo que confirma el análisis cualitativo por inmunohistoquímica.

La sistemática diferencia entre tumor / fondo y tumor / músculo ratios se debe al hecho de que la región de interés utilizada para definir el tumor en la región de imágenes PET siempre contienen no sólo tumor, pero también tejidos normales con bajos [18 F] Galacto RGD-absorción, tales como el músculo y pulmón. Esto se debe a la limitada resolución espacial de la PET escáner, que no permite una distinción clara entre el tumor y el tejido normal. En consecuencia [18 F]-Galacto RGD absorción por el tejido tumoral se debe subestimarse, y el tumor / fondo ratio será menor que el tumor / músculo ratio. Además, el tejido de muestreo se realizó 30 minutos después del inicio de la PET scan. Liquidación de la radiactividad del tejido muscular durante este período de tiempo también aumentar sistemáticamente el tumor / músculo ratio en comparación con el tumor / fondo ratio calculado a partir de las imágenes de PET.

Al correlacionar el peso del tumor con la relativa α v expresión, se observó una tendencia no significativa a menor α v expresión en tumores de mayor tamaño (r = 0,34, p = 0,09). Esto es probablemente relacionados con la presencia de las regiones necróticas en tumores de mayor tamaño, que no demuestran α v expresión. Por lo tanto, se puede descartar que la correlación positiva entre la expresión y α v [18 F]-Galacto RGD se debe a la captación sistemática de las diferencias en el tamaño de los tumores.

La determinación no invasiva de α v β3 Expresión de Células endoteliales

Para determinar si el PET con [18 F]-Galacto RGD no invasiva permite la determinación de α v β3 expresión en las células endoteliales activadas, hemos utilizado xenoinjertos tumorales A431. A431 células no expresan α v β3, pero inducir la angiogénesis cuando subcutánea extensa trasplantados en ratones desnudos. [34]. Tinción inmunohistoquímica de secciones usando un tumor monoclonal anti-humano α v β3 anticuerpos confirmó que el tumor de células no expresan esta integrina (Figura 2 A). Por el contrario, la tinción con un anticuerpo policlonal contra el murino β3 demostrado expresión de la subunidad β3 en las células endoteliales de los vasos tumorales. Desde α IIb β3, la única que contiene una mayor integrina subunidad β3, se manifestó principalmente en las plaquetas, se puede excluir que la tinción depende de este receptor. Así, en este caso, la tinción de la subunidad β3 se correlaciona con α v β3 expresión.

Transaxial imágenes de ratones con tumor de 90 min después de la inyección de [18 F]-Galacto RGD mostró un contraste en el tumor de flanco derecho del ratón, lo que refleja α v β3 orientada trazador acumulación en las células endoteliales de la vasculatura tumoral (Figura 2 B). Además, hemos demostrado trazador de receptores específicos de acumulación en el sitio del tumor mediante la inyección de 18 mg de la pentapeptide la ciclooxigenasa (-Arg-Gly-Asp - D - Val-Phe) por kilogramo de ratón 10 minutos antes de la inyección de trazador. Después de bloquear la acumulación de seguimiento, se encontraron aproximadamente 25% de la actividad inicial en el tumor (0,28 ± 0,05% de la dosis inyectada por gramo frente a 1,07 ± 0,33% de la dosis inyectada por gramo).

Estudios en seres humanos

Para la evaluación inicial en seres humanos, imágenes de nueve pacientes (cinco con los melanomas malignos, dos con sarcomas, uno con metástasis óseas de carcinoma de células renales, y una con sinovitis villonodular), con aproximadamente 185 MBq de [18 F]-Galacto RGD. Para todos los pacientes, rápido, principalmente la excreción renal se observó, lo que resulta en la eliminación de seguimiento rápido de la sangre y de bajo trazador de concentración en la mayoría de los órganos. Además de los riñones (SUV = 5,5 ± 3,7; min 79), la más alta concentración de actividad se encontró en el bazo (SUV = 2,5 ± 0,5; pi min 79), hígado (SUV = 2,4 ± 0,5; pi min 79), y el intestino ( SUV = 2,1 ± 0,8; 79 min pi). En las lesiones tumorales, trazador acumulación mostró gran heterogeneidad, con los SUVs que van desde 1,2 a 10,0. El SUV en el villonodular sinovitis fue de 3,2. La radioactividad se mantiene en el tejido del tumor durante más de 60 minutos (Tabla 1], mientras que en todos los demás órganos de una disminución de la concentración de actividad se observó en el tiempo. Tumor / la sangre y el tumor / músculo ratios 79 min pi fueron 3,8 ± 2,6 y 8,8 ± 6,0, respectivamente. Aunque para un paciente con melanoma múltiples lesiones fueron detectadas por el [18 F] FDG scan, que indica las células tumorales viables, no se encontró acumulación de actividad utilizando [18 F]-Galacto RGD (Figura 3 A). Para otros pacientes, sin embargo, los patrones de absorción similares se observaron para [18 F] FDG y [18 F]-Galacto RGD (Figura 3 B). El metabolito análisis de las muestras de sangre 10, 30, y 120 min pi mostró en la fracción soluble en más de 96% intacto trazador (n = 4) a lo largo de todo el período de observación y confirmado nuestros datos preclínicos [27]. Una dosis de radiación efectiva de 18,0 ± 3,2 μ Sv / MBq se calculó sobre la base de los datos de pacientes (n = 5). La más alta dosis absorbida se encontró en la pared de la vejiga urinaria (0,20 ± 0,04 mGy / MBq).

Tinción inmunohistoquímica de las secciones obtenidas de tejido del tumor después de la cirugía usando un anti-α v β3 anticuerpos mostró α v β3 expresión en las células endoteliales de la vasculatura tumoral (6 / 6), y dos pacientes de expresión en las células del tumor, como así (2 / 6) ( Figura 4]. La densidad de α-v β3 positivo buques intraindividually mostró grandes variaciones, y entre los casos individuales. Microscopía Óptica cuantificación reveló uno (inflamación de la rodilla debido a la operación anterior) y 35 (sarcoma de tejidos blandos de la rodilla, el mismo paciente) α v β3-positivas buques por campo microscópico. Además, en los seis casos bajo análisis, la densidad de immunohistochemically determinado α v β3-positivas buques se asoció significativamente con la acumulación de traza determinada por el análisis de SUV (r = 0,94, p = 0,005).

Discusión

Recientemente, hemos demostrado que los péptidos RGD radiomarcada permitir la vigilancia específica de los receptores α v β3 de expresión en modelos murinos tumor [24, 25, 26, 27, 35]. Aquí hemos traducido estos resultados a la clínica y, por primera vez, a nuestro conocimiento, de imágenes no invasiva demostrado α v β3 expresión en pacientes con tumores malignos. Además, hemos demostrado que la actividad de acumulación en el tumor se correlaciona con la densidad de receptores, determinado por inmunohistoquímica y Western Blot. Esto indica que la determinación no invasiva de α v β3 expresión es factible. Además, hemos demostrado en un modelo de carcinoma de células escamosas de que la sensibilidad de la PET es la imagen adecuada a la expresión de α v β3 en la vasculatura tumoral. Esto indica que con PET [18 F]-Galacto RGD puede aplicarse a estudio α v β3 expresión durante la angiogénesis.

La correlación entre [18 F]-Galacto RGD captación en el tumor y α v expresión muestra una considerable dispersión. Esto se debe probablemente a varios factores. Como para cualquier sonda de imagen, captación de tumor [18 F]-Galacto RGD no es sólo influenciada por la expresión de la integrina α v β3, sino también por factores inespecíficos como la perfusión y de la permeabilidad vascular. Además, la captación de traza heterogénea dentro de un tumor, por ejemplo, debido a la presencia de áreas necróticas, influirá en la correlación entre [18 F]-Galacto RGD α v captación y expresión, ya que por separado muestras fueron utilizados para las mediciones de seguimiento de la absorción y de la evaluación cuantitativa V α expresión. Por último, el presente estudio evalutated [18 F]-Galacto RGD captación sólo a la hora, 90 min pi de imágenes de la dinámica de [18 F]-Galacto RGD acumulación en el tejido del tumor y de traza cinética de modelado puede permitir una mejor evaluación cuantitativa Α v β3 de expresión por la imagen PET, y este enfoque debe ser evaluado en modelos animales, así como en los pacientes. No obstante, la correlación significativa entre la captación de [18 F]-Galacto RGD a la hora después de la inyección y α v β3 expresión es muy importante para los estudios clínicos, ya que sugiere que las estimaciones de α v β3 niveles de expresión se puede obtener desde la simple de todo el organismo PET Scans.

Se ha demostrado que la integrina muy doblados conformación fisiológica y tiene baja afinidad por los ligandos biológicos, como el fibrinógeno y vitronectin. Inside-out-en y fuera de señalización suponen un switchblade-al igual que la apertura a una amplia estructura con alta afinidad por los ligandos endógenos, así como los antagonistas de la integrina (sinopsis para ver [36]]. El interior-out es inducida por la activación de cambios conformacionales de la membrana de las regiones proximales de la subunidad α y β (por ejemplo, por las proteínas intracelulares como talin). Fuera-en la señalización es desencadenada por Mn 2 +, que se define por cuaternario reordenamientos una vía para la comunicación de la ligando sitio de unión a la citoplasmáticos segmentos proximales. Sin embargo, también se informó de que la ciclooxigenasa (-Arg-Gly-Asp - D - Val-Phe), además de unirse a la alta afinidad conformer, puede obligar a la conformación de baja afinidad cuando se utiliza a concentraciones muy por encima de su disociación constante, resultando en una activación similar encontradas como Mn 2 +. La concentración nanomolar radiotrazador utilizado en nuestro enfoque es de aproximadamente 10.000 veces inferior a la que informó de la activación de la conformación de baja afinidad. Así, con PET [18 F]-Galacto RGD se espera que proporcione la información no sólo acerca de la expresión de α v β3, sino también sobre el estado funcional de esta integrina.

El glicopéptido [18 F]-Galacto RGD mostró alta estabilidad metabólica en los pacientes y rápido, principalmente la eliminación renal, por lo que en buena tumor / ratios de antecedentes y, por lo tanto, imágenes de alta calidad. Por otra parte, este hallazgo confirma la ventaja general de la glicosilación enfoque [24, 26, 37, 38, 39] en el diseño de péptidos basados en marcadores de imagen con propiedades favorables para aplicaciones clínicas. Otro enfoque para optimizar la farmacocinética se basa en la conjugación de polyethyleneglycol [40, 41, 42, 43, 44, 45]. Se ha demostrado que tales polyethyleneglycolated péptidos también mejorar la farmacocinética y la retención de tumor. Sin embargo, una comparación directa de marcadores resultantes de las diferentes estrategias aún no se ha llevado a cabo.

La correlación entre la captación regional de seguimiento en la lesión y la densidad de α-v β3 positivo confirma que los buques de esta técnica permite no sólo la visualización, sino también la evaluación cuantitativa no invasiva de la integrina expresión. Curiosamente, nuestro estudio demostró alta entre ambos - y intraindividual diferencias en la acumulación de trazador en los diferentes lesiones, lo que indica una gran diversidad en la expresión del receptor. Este hallazgo demuestra el valor no invasivo de las técnicas apropiadas para la selección de los pacientes que entran en los ensayos clínicos de α-v β3 terapias de orientación. Esto se destacó además por el hecho de que, en algunos casos, no [18 F]-Galacto RGD captación se encontró, a pesar de las células tumorales viables ser detectado a través de un [18 F] FDG scan.

Además, las imágenes de PET con [18 F]-Galacto RGD puede aplicarse para evaluar el éxito de bloqueo α v β3 por agentes terapéuticos, y así ofrecer la información esencial para la dosis y la programación de la dosis de antagonistas α v β3. Se necesitan más estudios para demostrar el impacto de esta nueva técnica como un nuevo indicador pronóstico en el cáncer. Sin embargo, la primera evidencia del valor pronóstico está dado por Gasparini et al. [46], que encontraron α v β3 expresión en la vasculatura tumoral "puntos calientes" a ser un importante factor pronóstico predictivo de supervivencia libre de recaída en los dos ganglios negativos y los pacientes con ganglios positivos.

Α v β3 se encuentra también en las células endoteliales durante la cicatrización de heridas, en la reestenosis, en la artritis reumatoide, y en las placas psoriásicas. Así, radiomarcada RGD péptidos pueden ser utilizados para caracterizar no sólo a los tumores malignos, sino también las enfermedades inflamatorias. Más recientemente, hemos demostrado en un modelo murino para cutáneas de hipersensibilidad retardada que [18 F]-Galacto RGD permite la evaluación no invasiva de α v β3 expresión en los procesos inflamatorios [47]. Nuestros datos preliminares de una sinovitis villonodular muestran que α v β3 expresión en las células endoteliales en esta lesión puede ser monitorizada en pacientes. En conjunto, estos resultados indican que [18 F]-Galacto RGD también podría convertirse en un nuevo biomarcador de la actividad de la enfermedad en los procesos inflamatorios.

La principal ventaja de la PET en los procesos de imagen molecular es su alta sensibilidad combinada con una alta penetración de la radiación gamma resultantes de la descomposición de positrones. Por lo tanto, de imágenes PET permite la cuantificación de las concentraciones regionales de la radiactividad en los estudios en humanos. La óptica de la imagen tiene un enfoque aún más elevado de sensibilidad, pero adolece de la escasa penetración de la luz en la mayoría de los tejidos. Esto se traduce en una muy limitada capacidad para llevar a cabo de imágenes tomográficas y de cuantificar la señal óptica. Así, la imagen óptica se limita actualmente a los estudios preclínicos en ratones, mientras que el PET se puede realizar en preclínicos, así como en los estudios clínicos. La resonancia magnetica ofrece una alta resolución espacial y puede combinar imágenes morfológicas y funcionales, pero tiene aproximadamente 1.000 veces menor sensibilidad en comparación con el PET. Así, la PET es la técnica más apropiada para la determinación no invasiva de los procesos moleculares en pacientes en la actualidad. Obviamente, el paciente es expuesto a la alta energía de los rayos γ durante este procedimiento. Sin embargo, sobre la base de nuestras estimaciones de las dosis de radiación, la dosis de radiación efectiva para un [18 F]-Galacto RGD exploración está en el mismo rango que los de un [18 F] FDG scan, se aprobará un examen de rutina en la clínica en muchos países [48 ]. En estudios preclínicos, la resonancia magnética dirigida diferentes agentes de contraste han sido evaluadas, usando ya sea anti-α-v β3 anticuerpo conjugado polimerizado liposomas [49] o [50] nanopartículas, nanopartículas o vinculados con una α v β3 peptidomimetic antagonista [51]. En esos estudios, en función del agente de contraste y el modelo animal utilizado, una media de la intensidad de la señal de resonancia magnética mejora aproximadamente entre el 20% y el 120% se encontró, un pronunciamiento que aún no se ha confirmado en estudios clínicos. En nuestro estudio los pacientes utilizando [18 F]-Galacto RGD y PET, de 9 veces más altos que la actividad de acumulación, en promedio, se encontró en el tumor que en el músculo, más que indica la actualidad superior propiedades de este radiotrazador de imágenes moleculares. Además, la evolución reciente de la combinación de PET con la tomografía computerizada o la de combinar las posibilidades futuras de PET con resonancia magnética permitirá correlación de estos procesos con la morfología correspondiente.

Para mejorar aún más la retención de tumor α v β3 radioligands, multímeros RGD péptidos se presentó recientemente. Nuestro grupo ha desarrollado diferentes estructuras de multímeros de serie con hasta ocho RGD unidades conectadas a través de diferentes espaciadores [40, 41, 42]. Estos péptidos RGD multímeros mostró una mayor afinidad in vitro vinculante y la mejora de la acumulación y el tumor tumor / fondo ratios en comparación con los roedores monomérico compuestos. Estos datos y los datos de otros grupos [52, 53, 54] indican que el ligando de multímeros enfoque puede ser utilizado para la optimización del rendimiento de péptido basado en marcadores. Sin embargo, los estudios en pacientes será necesario para demostrar el potencial de este enfoque en entornos clínicos.

En resumen, esta nueva clase de trazador PET puede ofrecer conocimientos sobre los procesos moleculares durante el desarrollo de tumores y en la difusión preclínicos, así como centros clínicos, y será una herramienta muy útil en la planificación y el control de novela α v β3-terapias dirigidas.

Apoyo a la Información
Aprobación del Comité de Ética
(1,4 MB PPT).
Formulario de consentimiento del paciente
(4,2 MB PPT).

Damos las gracias a W. Linke, C. Bodenstein, J. Carlsen, Blechert B., y C. Schott por su excelente asistencia técnica. El RDS PET-ciclotrón y equipo, especialmente M. Herz, Dzewas G., y C. Kruschke, se agradece. Damos las gracias a Cheresh DA de la Scripps Institute, La Jolla, California, para el suministro de líneas celulares de melanoma M21 y M21-L. Este trabajo fue apoyado económicamente por la Fundación Sander (número de concesión 96.017.3) y con una donación de la Münchner Medizinische Wochenschrift. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.