PLoS Medicine, 2005; 2(3): (más artículos en esta revista)

Epítopo inmunoterapia de células T CD4 + induce una población de células T con actividad reguladora

Biblioteca Pública de la Ciencia
Adrienne Verhoef, Clara Alexander, Barry A. Kay, Mark Larché
Resumen
Antecedentes

Los péptidos sintéticos, en representación de las células T CD4 + epítopos, derivados de la secuencia primaria de las moléculas de alergenos se han utilizado para bajar de regular la inflamación alérgica en personas sensibilizadas. El tratamiento de las enfermedades alérgicas con péptidos pueden ofrecer importantes ventajas sobre el tratamiento con moléculas de alergenos nativos debido a la reducción de posibilidades de enlaces cruzados IgE vinculados a la superficie de mastocitos y basófilos.

Métodos y resultados

En este estudio abordamos el mecanismo de acción del péptido inmunoterapia (PIT), en cat-alérgicas, pacientes asmáticos. Cell-división de seguimiento de los tintes, la mezcla de células de experimentos, fenotipificación superficie, y las mediciones de citoquinas fueron utilizados para investigar la inmunomodulación en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) después de la terapia. Proliferativa de las respuestas a PBMCs extracto de alergeno se redujo significativamente después del PIT. Esto se asoció con perfiles modificados de citoquinas general se caracteriza por un aumento de la interleucina-10 y una disminución en la producción de interleuquina-5. Aisladas células CD4 + después de PIT pudieron reprimir activamente alérgeno-específicas de las respuestas de proliferación de pretratamiento CD4 neg PBMCs en co-experimentos de la cultura. PIT se asoció con un aumento significativo de la superficie expresión de CD5 en ambos CD4 + y CD8 + PBMCs.

Conclusión

Este estudio proporciona evidencia de la inducción de una población de células T CD4 + con supresor / actividad reguladora siguientes PIT. Además, sobre regulación de los niveles de la superficie celular CD5 puede contribuir a la disminución de la reactividad a los alergenos.

Introducción

El papel central de las células T en la patogenia de las enfermedades alérgicas está bien establecida [1]. A través de la producción de interleuquina (IL) -4, IL-5, IL-13 y, alérgeno-específicas T helper (Th) 2 células de IgE directa síntesis, el crecimiento de eosinófilos / diferenciación, y la inducción de hiperreactividad de la vía aérea [2, 3]. Hasta Recientemente, se supuso que la base de la enfermedad alérgica es un desequilibrio en las células Th respuesta a determinados alergenos, como manifiesta un predominio de citocinas Th2 más de citoquinas Th1. Sin embargo, la inmunosupresión también puede ser una consecuencia normal de una respuesta inmune protectora, que sirve para limitar la excesiva respuestas que conducen a la inmunopatología [4]. El papel de regulador de células T (T reg) en el mantenimiento de la homeostasis de la población es cada vez más conocidos en nuestro medio. El término T reg se utiliza para describir una variedad de fenotipos de células T funcionales que exhiben características comunes. Varios estudios han descrito la dependencia de T reg función de la célula-célula contacto. En algunos casos se demostró que la regulación dependerá de la IL-10 y / o transformación de la secreción del factor de crecimiento β [5, 6, 7, 8, 9].

Reglamento de la respuesta inmune puede ser atribuible a ambos de origen natural (timo-derivados, o "naturales") y también de regulación células efectoras ingenuo o células T supresoras que han adquirido la actividad (adaptación células reguladoras) [10, 11]. Administración terapéutica de corto, secuencias de péptido soluble, en ausencia de señales inflamatorias, puede resultar en la presentación de inmaduros o silente células presentadoras de antígeno (APC). Inmaduros humanos alogénico las células dendríticas (CDs) inducida no proliferan, la IL-10-la producción de células CD4 + T con propiedades reguladoras [12], mientras que péptido-T humanos específicos reg fueron inducidos tras la administración de antígeno-pulsado inmaduros países en desarrollo in vivo [13 , 14]. Los países en desarrollo la producción de IL-10 fueron capaces de suprimir inflamación de las vías aéreas en un modelo murino de asma [15]. Así, en parte inmaduro o "estado estacionario" países en desarrollo, que circulan en la linfáticos, pueden interactuar con las células T en un tolerogenic medio, en ausencia de un tratamiento concomitante con estímulos pro-inflamatorias tales como el reconocimiento de patrones de activación del receptor [16].

Otro mecanismo para limitar la respuesta inmune puede ser la reducción de la sensibilidad a las señales afines. Sobre regulación de CD5, un supresor de señalización de células T [17], se ha asociado con células reguladoras que surgen como consecuencia de la competencia por el espacio y los recursos [18]. En esas condiciones, la represión era la que falta antígeno específico y estar mediados por células que no exhibió ninguna de las características de "profesional" T reg. Recientemente, Hawiger y colegas emitido antígeno para el estado de los países en desarrollo a través de DEC-205 molécula. Tras afines interacción con estas células, de antígenos específicos de las células T que no se expresaron y mejorar los niveles de CD5 [19]. Crónica de bajo nivel de exposición de antígenos en la periferia también se ha demostrado que el resultado en anergia en las células CD8 + que se asoció con incremento en la expresión de CD5, que ilustra aún más el papel de CD5 en la regulación de la función de células T [20].

En modelos animales, la administración de dosis bajas de péptido es un mecanismo bien establecido para la inducción de la T reg que pueden surgir como consecuencia de la presentación por el estado de países en desarrollo y "no profesional" vehículos blindados [21, 22, 23, 24]. Del mismo modo, la administración de péptidos solubles alérgica a individuos asmáticos se ha demostrado que el resultado notablemente en la reducción de las reacciones cutáneas a la inyección de alergenos [25, 26, 27], la reducción de hiperreactividad de vía aérea [27], y las mejoras en las puntuaciones de los síntomas nasales después de alergeno desafío [28] . Los cambios en la reactividad clínica se asoció con una disminución de citocinas Th1 y Th2 y el aumento de la producción de IL-10 [25, 26]. En el presente trabajo, nos ocupamos de la hipótesis de que dosis bajas de terapia péptido en las personas alérgicas a los resultados en hyporesponsiveness antígeno-específicos asociados a la inducción de una población represivas de los linfocitos T CD4 +, junto con la regulación de las aguas superficiales en los niveles de antígeno CD5 - Las células T específicas.

Métodos
Pacientes y diseño del estudio

Los individuos que fueron gato alérgicas y asmáticas fueron reclutados, diagnosticados, y se evaluó como se describe en detalle en otra parte [29]. El estudio recibió la aprobación previa del Comité de Ética del Royal Brompton y Harefield Hospitales del Servicio Nacional de Salud Trust (Londres, Reino Unido). Escrito, el consentimiento informado fue testigo se obtuvo de todos los pacientes. Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se obtuvieron de los pacientes que participaron en dos estudios (estudio de diseño abierto) el empleo de la inmunoterapia de péptidos sintéticos cortos derivados de la secuencia de los principales alergenos de gato Felis domesticus Alergeno 1 (d vil 1). Los estudios emplean diferentes regímenes de dosificación con el fin de evaluar los efectos en dosis clínicas y mecanicista resultados. El primer estudio se realizó en ocho pacientes (denominado en adelante Grupo 1) de los que recibieron dosis de vil d 1 péptidos (0,1, 1, 1, 5, 10, y 25 μ g) un total de 42,1 μ g de cada péptido, mientras que el segundo estudio participaron 12 pacientes (de ahora en adelante el Grupo 2), que recibió un total de 291 μ g (1, 5, 10, 25, 50, 100, y 100 μ g) de cada péptido. Los péptidos son sintetizados por la química Fmoc, purificado por HPLC, y se presentó como liofilizado sólidos (Centro de Biotecnología Avanzada, Imperial College London, Reino Unido). Péptidos se reconstituye con solución salina fisiológica estéril y se vació en frascos estériles para uso único del paciente (Laboratorios Nova, Leicestershire, Reino Unido). Péptido secuencias fueron los siguientes: EICPAVKRDVDLFLTGT, LFLTGTPDEYVEQVAQY, EQVAQYKALPVVLENA, KALPVVLENARILKNCV, RILKNCVDAKMTEEDKE, KMTEEDKENALSLLDK, KENALSLLDKIYTSPL, LTKVNATEPERTAMKK, TAMKKIQDCYVENGLI, SRVLDGLVMTTISSSK, ISSSKDCMGEAVQNTV, y AVQNTVEDLKLNTLGR.

Parámetros clínicos y medidas de resultado péptido asociado a la intervención de los donantes en los cuales se obtuvieron muestras de PBMC se describen en detalle en otra parte [27, 28]. En pocas palabras, en el primer estudio de la inmunoterapia de péptidos (PIT) resultó en la mejora no específica, la hiperreactividad bronquial, ya que una significativa (p = 0,02) una mayor concentración de histamina se necesita para inducir a una reducción del 20% en el volumen espiratorio forzado en 1 s. medido Además, una reducción significativa (p = 0,03) en la magnitud (área en milímetros cuadrados) de la fase tardía reacción cutánea se observó después del tratamiento. En el segundo estudio, el tratamiento se asoció con una reducción en la magnitud de la reacción asmática tardía inducida por alergenos inhalados desafío, junto con una disminución significativa en las medidas de resultado nasal (número de sneezes, obstrucción nasal, y el peso de la secreción nasal; todas las mediciones A los 15 min post-desafío, p = 0,02).

PBMC Culturas

PBMCs fueron aisladas de muestras de sangre venosa, por gradiente de densidad de centrifugación (Histopaque-1077; Sigma Chemicals, Poole, Reino Unido) y criopreservados. Todos los experimentos se realizaron en la pre-y post-PIT PBMCs de la misma paciente de forma individual, los experimentos, a fin de reducir la variación inter-experimento dentro de los solteros. Antes de cultivo in vitro, se PBMCs descongelado, lavado, y etiquetados con carboxyfluorescein diacetato succinimidyl ester (CFSE) (Molecular Probes, Eugene, Oregon, Estados Unidos), de la siguiente manera: 2,5 × 10 6 cada uno de los pre-y post-PIT PIT PBMCs se resuspendió en 0,5 ml de RPMI-1640 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), y 0,5 ml de 1 μ M CFSE añadido bajo constante, suave agitación, de lograr un final CFSE concentración de 0,5 μ M. Después de 10 min, 1 ml de suero humano AB (Sigma, Poole, Reino Unido) fue añadido a rescindir el etiquetado, y las células fueron lavadas dos veces. Las células se resuspendió en 2,5 × 10 6 células / ml de medio completo (RPMI-1640 complementado con L - Glutamina y 5% de suero humano AB) y chapada a 5 × 10 5 células / así en el 96-así-parte inferior plana placas de cultivo (Nunc, Merck Eurolab, Lutterworth, Reino Unido) en 200 μ l de volumen final, en las siguientes cultura Condiciones: no, estimulado con 30 μ g / ml toda gato alergeno (generoso regalo de Laboratorios Leti, Madrid, España) y estimulado con placa determinada α-CD3 / α-CD28 (10 / 1 μ g / ml; BD Pharmingen, Cowley, Reino Unido).

Para los experimentos de la represión, PBMCs se separaron en CD4 + y CD4 neg poblaciones. Cantidades limitadas de la sangre periférica se dispone de estudio de los pacientes. Por lo tanto, por razones de economía, agotado PBMCs-CD4 (CD4 neg) que queda después de la selección de células CD4 + fueron utilizados como blanco las células en todos los ensayos de represión. Para cada paciente, 20 × 10 6 cada uno de los pre-y post-PIT PBMCs fueron etiquetados con α magnetica cuentas CD4 (MACS; Miltenyi, Bisley, Reino Unido) y ordenados positivamente a una pureza media del 94%. Neg CD4 antes y después de la PIT células fueron etiquetados con CFSE como se describe más arriba, mientras que las células CD4 + antes y después de la PIT células T fueron etiquetados con PKH-26 (Sigma) de la siguiente manera: las células se resuspendió en diluyente C (Sigma) en No más de 10 7 células / ml, y un volumen igual de una PKH-26 de dilución (1 μ M) fue agregado para llegar a una concentración final de 0,5 μ M. Después de 2 min, la reacción se detuvo con la adición de 1 ml de suero humano, y las células fueron lavadas dos veces. Las células fueron cultivadas en las siguientes combinaciones: antes y después de la PIT neg células CD4 por sí solo, antes de la PIT CD4 neg más antes y después de la PIT CD4 +, y después de la PIT CD4 neg más antes y después de la PIT CD4 + ( Neg células CD4 en 0,5 × 10 6 células / y así las células CD4 + en 0,125 × 10 6 células / así en el 96-así-parte inferior plana placas de cultivo de tejidos, para alcanzar una proporción de 4:1). Todos se cultivaron en la ausencia o presencia de alergenos de gato (30 μ g / ml) durante 1 semana humidificado en una incubadora a 37 ° C gaseados con 5% de CO 2 en el aire.

Citometría de Flujo

Para determinar los cambios en la proliferación de las subpoblaciones de células T asociados a PIT, las células se recuperaron después de 1 semana de la cultura, lavada dos veces, y manchados por 30 min a 4 ° C, con una combinación de α CD4-CD8 + α PE-Cy, o α-CD45 PE. Los controles utilizados fueron isotipo IgG 2a ratón-PE, mouse IgG 1-PE, y el ratón IgG 1-Cy. La media de la intensidad de fluorescencia (IMF) se determinó por FACS (FACScan, BD Pharmingen), de al menos 2 × 10 4 eventos dentro de la puerta de linfocitos. En experimentos de la represión, en la medida de la proliferación como se midió de arriba a la CFSE con etiqueta de lectura adicional de la población, sin tinción de anticuerpos. Los porcentajes de CD4 + CD25 + células T, CD4 + células CD5 +, CD8 + o células CD5 + no se realizaron mediciones de las células por doble tinción con α-Cy CD4 + CD25-FITC α, α-Cy CD4 + α CD5-PE, o α-Cy CD8 CD5 + α-PE. Los controles utilizados fueron isotipo IgG ratón 1-Cy y ratón IgG 1-FITC (todos los anticuerpos de BD Pharmingen).

Las mediciones de citoquinas

Cultura sobrenadantes de 100 μ l se obtuvieron de los pozos de 48 h tras el comienzo de la cultura. Citocinas se midió por citometría talón gama Th1/Th2 kit (BD Pharmingen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un total de seis citocinas se midieron simultáneamente. Los datos de la IL-5, IL-10, y el interferón (IFN) - γ se muestran. Se determinaron las concentraciones de citocinas mediante citometría talón matriz de análisis de software (BD Pharmingen). La sensibilidad de los ensayos fue de 2,4 pg / ml para IL-5, 2,8 pg / ml para IL-10, y el 7,1 pg / ml para IFN-γ.

Análisis de Datos

FACS superficie celular de datos y CFSE-PKH-26 mezcla experimento proliferación datos fueron adquiridos con Cellquest (BD Pharmingen), y los eventos en vivo dentro de la puerta de linfocitos se interpretaron utilizando software Winmdi 2,8 (Scripps Research Institute, Http://facs.scripps.edu/software.html ). CFSE proliferación de datos de subconjuntos de células T fueron adquiridas con Cellquest, y los acontecimientos dentro de los CD4 +, CD8 +, CD45RO + puerta o analizado con la proliferación Asistente ModFit LT módulo en el software (Verity Software House, Topsham, Massachusetts, Estados Unidos). Porcentaje proliferación se define como la fracción de la población inicial que ha proliferado en el transcurso de la prueba.

Análisis Estadístico

Para el análisis estadístico de los datos se analizaron utilizando la normalidad de Shapiro-Wilks prueba. Normalmente distribuyen datos se analizaron mediante la prueba "t" pareada (paramétrico). No normal de los datos se analizaron utilizando la prueba de los rangos con signos de Wilcoxon (no paramétrico). El análisis fue realizado por un estadístico independiente (Turnstat, Reading, Reino Unido).

Resultados
PIT Resultados en la inhibición de la Cat-alergenos-inducida proliferación de CD45RO +, CD4 +, CD8 + y subconjuntos de células T

El efecto de la PIT en la proliferación celular de subconjuntos de células T se evaluó mediante la combinación de CFSE etiquetado con la tinción de la superficie celular. Como se muestra en la Figura 1 A, la mayoría de los alergenos de gato de las células T específicas residido en el CD45RO + (memoria) de células T población. La proliferación de esta población se inhibió marcadamente siguientes PIT (Figura 1 A-1 D]. Limited alérgeno-específicas de la proliferación se detectó en la CD45RO - (ingenuo) la población, pero esto parece menos sensibles a los efectos del PIT. Los datos de los nueve individuos probados mostraron una reducción similar en el post-PIT respuesta proliferativa (Figura 1 E, con una media de la proliferación antes de la PIT [20,3%] se redujo después de los PIT [5,8%], p = 0,004; antes de la gama PIT 7,9 % -41,8%, Después de los PIT rango 0% -16,7%). Proliferación en ausencia de un estímulo fue menos del 2% en todos los casos y fue restada. Proliferación de la placa determinada α-CD3 / α-CD28 (10 μ g / ml y de 1 μ g / ml, respectivamente, como una mezcla) dio lugar a media pre-PIT proliferación de las células T CD45RO + de 64,2% y posterior a la proliferación de PIT 60,1% (datos no presentados).

El efecto de la PIT en CD4 + y CD8 + poblaciones también se trató. Ambos CD4 + y CD8 + subconjuntos proliferado a todo gato alergeno. CD4 + después de los PIT proliferación de las células T se redujo significativamente (p = 0,016; Figura 2 A), a pesar de un ligero aumento en la proliferación de un paciente (media pre-PIT PIT después de los CD4 proliferación se redujo de 5,4% a 2,1% [ Pre-PIT rango 0% -12,7%; después de los PIT rango de 0% -7,3%]). Una reducción similar se observó para los linfocitos T CD8 + (p = 0,031; Figura 2 B datos de los siete pacientes disponibles para el análisis). Post-PIT CD8 + proliferación obtuvo una mayor reducción (media pre-PIT PIT después de los CD8 + proliferación se redujo de 8,0% a 2,5% [pre-PIT rango 1,8% -20,8%; después de los PIT rango 0,3% -4,7% ]).

Modulación de la secreción de citoquinas después de la inmunoterapia de péptidos

Con el fin de caracterizar la modulación de citoquinas de las respuestas siguientes PIT, la cultura sobrenadantes fueron recolectados después de 48 h. Citocinas se midieron simultáneamente por citometría de flujo. La mayoría de los pacientes muestran aumento de la secreción de IL-10, si bien este cambio no alcanzó significación estadística. La secreción de IL-5 se redujo significativamente después de los PIT (p = 0,02; Tabla 1]. La secreción de IFN-γ tiende a ser reducido a raíz de PIT, pero se observó heterogeneidad.

PIT Conduzca a la inducción de una CD4 + T Cell Población con Suppressor Actividad

Para identificar las poblaciones de células T supresoras de la actividad y tratar de distinguir entre la represión y la activa supresión clonal como posibles mecanismos PIT siguientes, antes y después de la PIT los linfocitos T CD4 + fueron aisladas y su efecto sobre la proliferación de CD4 neg fracción medido ( Figura 3]. Dos del ciclo de la célula de seguimiento de los tintes, la CFSE y PKH-26, fueron empleadas para separar visualmente el objetivo (CD4 neg; CFSE) de la efector (CD4 +; PKH-26) las poblaciones, por citometría de flujo. PIT dio lugar a un 69% de reducción (14,7% antes de la proliferación PIT versus 4,6% después de la proliferación PIT) en la proliferación de las células T CD4 neg población un representante para el paciente muestra en detalle (Figura 3 Ay 3 B). Cuando antes y después de la PIT los linfocitos T CD4 + se añadieron a CD4 neg PBMCs (en una proporción de 1:4), una marcada reducción en la proliferación de gato-alergeno-específicos CD4 neg pre-PIT células T se observó cuando co - Cultivadas con post-PIT (Figura 3 E; proliferación 7,9%), pero no con el pre-PIT los linfocitos T CD4 + (Figura 3 C; proliferación 17,7%), lo que indica que después de la PIT los linfocitos T CD4 + alberga un supresor de la población. Como después de los PIT CD4 neg proliferación de las células T es mínima, además de la post-PIT los linfocitos T CD4 + no tiene un mayor efecto supresivo sobre esta población celular (Figura 3 F). Además, la eliminación de los linfocitos T CD4 + de post-PIT PBMCs no causó el agotamiento de la población PBMC a proliferar (Figura 3 B), lo que sugiere que las células antígeno-específicos, en el post-tratamiento de la población ya se había dictado anérgicos in vivo como Resultado de PIT, o que éste posea la capacidad para reprimir activamente respuestas en sí mismas. Se realizaron experimentos similares en otros cuatro pacientes. Un resumen de los resultados de los cinco pacientes se muestra en la Figura 3 G. La inhibición de la proliferación de las células CD4 + después de los PIT células T varió de 64,0% a 19,6%, con una media de 47,5%.

Caracterización fenotípica de las células T reguladoras candidato inducida después de los PIT

T celulares de superficie que se sabe están asociados con la inducción de la tolerancia, como el CD25 y CD5, se compararon antes y después de la PIT PBMC de descanso en un intento de facilitar más información sobre la naturaleza de los supresores de la población. No se encontró una variación significativa en las células CD4 + CD25 + el número de células (media pre-PIT después de los PIT proliferación 20,5% -17,9%; datos no presentados). Sin embargo, cuando se determinó CD5 expresión en ambos CD4 + y CD8 + células, un aumento significativo de las IFM en ambas poblaciones se observó (p = 0,016 y 0,047, respectivamente). Figura 4 Ay 4 B, muestran aumentos de la expresión CD5 en CD4 + Y de células CD8 + (IFM expresión de CD5 en las células CD4 +: pre-PIT media, 465,5 [gama, 290.3-908.5]; después de los PIT media, 559,7 [gama, 302.5-1241.8]; gama de post-cambio porcentual en el PIT IFM, el 4% -37%; IFM expresión de CD5 en las células CD8 +: pre-PIT media, 110,9 [gama, 55.3-345.8]; después de los PIT media, 149,2 [gama, 60.6-352.2]; gama de post-PIT Cambio porcentual en IFM, el 7% -118%). El aumento de IFM como resultado no sólo de una disminución en el número de células CD5 baja y un aumento en las células CD5 + en ambas poblaciones, pero a partir de un aumento de la expresión CD5 en el CD5 + y células, tal como se muestra en la Figura 4 y C 4 D por un representante del paciente.

El efecto sobre la proliferación de PIT, los patrones de secreción de citoquinas, el fenotipo de los subconjuntos de células T, y la capacidad de represión no parece ser dependiente de la dosis total administrada de péptido en los dos grupos de tratamiento.

Discusión

Tras PIT, la proliferación de las células CD4 +, CD8 +, CD45RO + y células T de memoria se redujo después de la cultura con toda la caspa de gato extracto de alergeno. No específico del receptor de la célula T (TCR) con ligadura anti-CD3/CD28 no fue afectado, lo que implica que sólo el gato-alergeno-específica de células T ha sido blanco de PIT. La reducción de la proliferación se observó principalmente en la diferenciación de memoria (CD45RO +), en lugar de la población de células T ingenuas, la última muestra mínima división celular.

Si bien la función de los linfocitos T CD4 + en la patogénesis de las enfermedades alérgicas está bien establecido, el de los linfocitos T CD8 + está menos definido. Varios informes sugieren que las células T CD8 + pueden ser activadas en el proceso de asma. De las células CD8 + tanto lavado broncoalveolar y de sangre periférica de donantes atópica se encontraron para producir IL-4 e IL-5 en muestras de lavado bronquial y biopsias [30, 31]. Además, las personas con enfermedad atópica severa tienen altas frecuencias de Dermatophagoides pteronyssinus 1-específica de células T CD8 + que secretan un número significativamente mayor de IL-4, IL-5, IL-13 y que los no atópicos personas [32]. Aquí hemos demostrado que los linfocitos T CD8 + proliferan notablemente a alergenos cat in vitro, incluso en ausencia de los linfocitos T CD4 +. En el contexto de los estudios anteriores, es probable que estas células puede contribuir a la patogénesis de la enfermedad. Por lo tanto, la inducción de la falta de respuesta de los linfocitos T CD8 + debería tener un resultado terapéutico positivo en la enfermedad alérgica.

Perfiles de citoquinas de gato-alergeno-estimulado PBMCs se establecieron después de la terapia péptido. Los niveles de IL-2 e IL-4 fueron en general por debajo del límite de detección de las pruebas empleadas. PIT no tuvo ningún efecto sobre la secreción del factor de necrosis tumoral α (datos no presentados). La producción de IL-5, una citoquina considera especialmente importante en el asma, se redujo significativamente después de PIT. En aproximadamente la mitad de los pacientes hubo reducciones en las dos citocinas Th1 y Th2, como ha sido descrito previamente [26]. Hemos observado resultados similares en un estudio no publicado del PIT para el veneno de abeja, hipersensibilidad. La mayoría de los pacientes mostraron una mayor producción de IL-10 después de PIT, de acuerdo con nuestras observaciones anteriores. Sin embargo, en el presente estudio esta no alcanzó significación estadística, en contraste con un informe anterior. Aumento de la producción de IL-10 se ha asociado con la protección de los síntomas de alergia en los dos, naturalmente, los individuos expuestos, como los apicultores y en los individuos que reciben inmunoterapia del veneno de abeja, [33]. En contraste, la producción de IL-10 en relación con la exposición a alergenos de gato y la protección no está bien establecido. Un efecto protector de altas dosis de la exposición natural a los alergenos de gato (lo que resulta en una "respuesta Th2 modificados") ha informado [34, 35]. Woodfolk y colegas demostraron elevados de IL-10 en la producción de los individuos que muestra una "modificación del Th2" perfil en el que gato-alergeno-específicos IgG4 parece proteger de la enfermedad [36]. En su estudio, de determinadas regiones de la molécula vil d 1 (carboxilo terminal de la cadena 2) parece estar relacionada con la presentación por HLA-DRB1 * 0701 y se asociaron con preferencial inducción de IL-10. Por razones técnicas, péptidos de esta región no se incluyeron en la preparación utilizada en el presente estudio. La inclusión de esos péptidos, en el futuro, los estudios pueden mejorar la eficacia de la vacuna.

En el presente estudio se evaluó la producción de citocinas en las células de sangre periférica. La producción local de citoquinas en tejidos blanco de alergenos pueden proporcionar una imagen más precisa de los efectos de la inmunoterapia con péptidos o alergenos nativos / extractos alergénicos. Por ejemplo, en un estudio relacionado con este tema un importante aumento en el número de cutáneo CD4 + IFN + células γ (p = 0,03), pero no en las células CD4 + IL-10 + células, se observó en el alergeno-desafió biopsias de piel [27]. Del mismo modo, un aumento significativo en el número de IFN-γ mRNA (+) células (p = 0,03) se encontró en las biopsias nasales de los pacientes inscritos en su conjunto-el polen de hierba-inmunoterapia juicio, en ausencia de modificaciones significativas en IFN-γ Correspondiente por la secreción estimulada PBMCs in vitro [37]. Así, en la localización de las células in vivo por alergeno desafío puede revelar patrones de inmunomodulación que difieren de los cambios en la sangre de la misma persona. Por esta razón, se debe tener precaución al interpretar los cambios en los perfiles de citoquinas en diferentes tejidos después de la inmunoterapia.

Estamos ante la posibilidad de que los cambios en la proliferación de las células T y la secreción de citocinas puede estar relacionado con la inducción de una población de T reg o supresor de las células T, similar a la observada tras la intervención péptido en modelos murinos [38]. PBMCs se separaron en CD4 + y CD4 neg poblaciones. CD4 + células aisladas de la sangre después de los PIT pudieron reprimir activamente a la proliferación de pre-tratamiento de las células CD4 neg. La selección de neg células CD4, en lugar de células CD4 +, como los objetivos se debe a limitaciones en el número de celdas disponibles. No obstante, los resultados obtenidos indican la inducción de regulador y supresor de los linfocitos T CD4 + siguiente PIT. Curiosamente, la eliminación de las células CD4 + de la post-PIT PBMC población no se ha traducido en una inversión de la hyporesponsiveness alérgeno-específicas en el pre-PIT CD4 neg población. Esta observación sugiere que, además de la supresión activa de las células CD4 +, la durabilidad de los efectos de la terapia también puede ser detectado. Las explicaciones de tales observaciones pueden incluir los siguientes: (i) la supresión clonal de algunos antígenos específicos de células CD4 neg, (ii) la inducción de anergia en estas células durante la fase de tratamiento, o (iii) la presencia de un supresor de la población CD4 neg . En apoyo de la última posibilidad, de reglamentación los linfocitos T CD8 + Recientemente se han descrito [39]. Estudios de identificación de alergenos específicos de CD4 y CD8 células T será necesaria para hacer frente a esas cuestiones. En futuros estudios será de interés para identificar la subpoblación o subpoblaciones de células CD4 y CD8 responsables de los efectos supresores, mediante la eliminación de las células T candidato de la pre-y post-tratamiento de células T CD4 + poblaciones antes de co-cultura.

Ningún aumento en el número de CD4 + CD25 + células se observó en PBMCs siguientes PIT, en contraste con los estudios de inmunoterapia con alergenos en su conjunto [40, 41]. De hecho, el número de células CD25 brillante disminuyó significativamente después de la terapia péptido (datos no presentados). Además, CD4 + CD25 + T células obtenidas antes y después del tratamiento en relación con PIT estudio no difieren en su capacidad para reprimir los alérgenos específicos de la proliferación de las células T efectoras y la producción de IL-13, argumentando en contra de una de las funciones principales de este tipo de regulador celular Péptido en la terapia [42]. "Creemos que los resultados PIT en la activación de células T en ausencia de señales inflamatorias, posiblemente a través de la presentación de inmaduros vehículos blindados, o incluso por vecinos de las células T. Bien caracterizado humanos de los modelos in vitro han demostrado que sí es posible inducir anergia de células T después de la incubación con péptidos afines en la falta de vehículos blindados profesionales [43, 44]. Recientemente, y Apostolou von Boehmer informó de la inducción de la hyporesponsiveness antígeno-específica, mediada por células reguladoras, tras continua, de baja dosis péptido administración en ratones [21], una observación que apoya nuestro actual y los anteriores hallazgos clínicos. Además, Prakken y colegas han demostrado la inducción de IL-10-T de secretar péptidos reg siguientes oral en pacientes con artritis reumatoide. Estas células pueden igualmente representar una adaptación de la población inducida T reg [45].

Si bien la expresión CD25 se considera un marcador de un funcionalmente diferenciados de la población T reg (siempre que las células no se han activado recientemente), CD5 expresión de los niveles de células T puede ser un indicador de una función reguladora [18]. CD5 ha demostrado ser un regulador negativo de TCR de señalización, de influir en el destino de timocitos en desarrollo [17]. En la periferia, las células T CD5 neg muestran una mayor proliferación de disparo TCR [46]. Por el contrario, el aumento de los niveles de la membrana de CD5 se correlaciona con una disminución de la respuesta de células T antígeno a la orientación de los eventos de señalización [47].

En el estudio actual, los niveles de CD5 fueron significativamente elevados directamente en la ex vivo, no CD4 + y CD8 + células T, después de la terapia péptido. Los aumentos fueron leves, lo que probablemente se relaciona con la baja frecuencia de los precursores de las células blanco. Curiosamente, los aumentos observados en los linfocitos T CD8 + se debe en parte a una reducción en el tamaño de las CD8 + T cell CD5 neg población. Una clara CD8 + CD5 neg población de células T que representa el 3% -10% del total de células T CD8 + donantes sanos en la población ha sido descrito anteriormente [48], y parece ser el principal productor de lymphotactin (XCL-1) [ 49]. Dado que el tamaño medio de las CD8 + CD5 neg poblaciones de células T en los pacientes asmáticos alérgicos en nuestro estudio es sustancialmente mayor (23,2% del total de los linfocitos T CD8 +), es tentador especular que se trata de una prueba más de una respuesta inmune dysregulated Asociados con las enfermedades alérgicas. Esta observación está de acuerdo con los datos de lymphopenic ratones que desarrollaron la enfermedad con emaciación cinética acelerada siguientes adoptivos transferencia de las células T expresan bajos niveles de CD5, mientras que las células se hi CD5 de protección [18]. De acuerdo con estos resultados, los niveles de la superficie CD5 en células T humanos también parece que se correlacionan con la función inmune, como el CD5 neg población se incrementó en los receptores de trasplante de médula ósea, así como en pacientes con SIDA avanzado [50, 51]. Sin embargo, como se conoce relativamente poco acerca de la función de CD5 en la tolerancia humana de células T, se requieren nuevas investigaciones para determinar la importancia de nuestra búsqueda de las enfermedades alérgicas en. Cómo aislar d 1-células T específicas deben producir información valiosa sobre la relevancia funcional de la mayor expresión de CD5 alérgeno-específicas de las células.

A nuestro entender, esta es la primera demostración de que PIT CD4 + induce una población de células T que suprime activamente antígeno inducida proliferación de las células T efectoras. El uso de la doble etiquetado claramente con tintes de color permite la evaluación del efecto de las células T CD4 + subconjunto de la proliferación de CD4 neg (incluidas las células CD8 +, células asesinas naturales, las células B, monocitos y basófilos) mediante citometría de flujo. Si bien la doble etiquetado se ha utilizado ampliamente para realizar un seguimiento de la migración de células en modelos animales [52], su aplicación en humanos in vitro de la proliferación de las células T ha experimentos, a nuestro conocimiento, no se ha informado previamente. Single-color etiquetado de las distintas poblaciones humanas PBMC se ha utilizado para caracterizar, aislar y clonar maní-alergeno-específica de células T [53], y para determinar las frecuencias de los precursores recordar antígeno-específica de las células T [54]. Medición de la proliferación a través de la CFSE tiene ventajas adicionales que requieren de relativamente bajo número de células y permitir adicionales fenotípica (celulares de superficie) o parámetros funcionales (intracelular de la secreción de citoquinas), que se estudió en forma paralela, en distintas subpoblaciones [54].

En conclusión, nuestros datos indican que las dosis bajas de ambos objetivos PIT CD4 + y CD8 + y células T de memoria induce un supresor de la población activa de la reglamentación y las células T CD4 + en el compartimento. Supresor de la actividad también puede residir en el compartimento de CD4 neg. Péptido tratamiento dio lugar a una heterogénea modulación de alergenos específicos de las respuestas de citoquinas PBMC in vitro, en general, se caracteriza por la inducción de IL-10 y IL-5 represión. Por último, modesta pero consistente se han observado aumentos en la superficie CD5 expresión en ambos CD4 + y células T CD8 +, una observación que puede estar vinculada a la inducción de antígeno-específicos hyporesponsiveness. La capacidad de modular antígeno-específica de células T in vivo función tiene importantes implicaciones para el tratamiento y la prevención de la alergia, autoinmunes, y las enfermedades relacionadas con la allograft.

Apoyo a la Información

Estos estudios fueron financiados por el Asma del Reino Unido, el Consejo de Investigación Médica (Reino Unido), la Asociación Médica Británica, y la Royal Brompton y Harefield Hospitales Comité Fiduciario de Investigación Clínica. ML es una Asma del Reino Unido, Investigador Asociado Superior. Los autores desean agradecer a la Prof NA Mitchison, Prof Askonas B., y el doctor Robinson DS para examen constructivo del manuscrito. Los autores agradecen al Dr E. Fernández-Caldas y Laboratorios Leti por el generoso regalo de la caspa de gato y extracto de alergeno a la Sra J. Turner para el análisis estadístico. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.