AIDS Research and Therapy, 2005; 2: 1-1 (más artículos en esta revista)

VIH-1, que confiere resistencia ARNsi cosuppression de correceptores CCR5 y CXCR4 por un bispecific vector lentiviral

BioMed Central
Joseph Anderson (lacrosse@colostate.edu) [1], Ramesh Akkina (akkina@colostate.edu) [1]
[1] Dept Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, Colorado 80523, USA

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Resumen
Antecedentes

RNA de interferencia (RNAi) mediada por ARN interferentes pequeños (siRNAs) ha demostrado ser un muy eficaz mecanismo de silenciamiento de genes con un gran potencial para el VIH / SIDA, la terapia génica. Trabajo previo con siRNAs contra celulares correceptores CCR5 y CXCR4, ha demostrado que en la regulación de estas moléculas de superficie podría impedir la entrada del VIH-1 y conferir resistencia viral. Desde monoespecíficos siRNAs dirigidos a los distintos correceptores son insuficientes en la protección contra ambos trópico de células T (X4) y los monocitos trópico (R5) cepas víricas simultáneamente, bispecific construye con doble especificidad son obligatorios. Para una efectiva terapia de largo alcance, la bispecific construcciones tienen que ser estable transduced VIH-1 en las células diana a través de la integración de vectores virales.

Resultados

Para lograr este objetivo, lentiviral vectores de la incorporación de CCR5 y CXCR4, dos de siRNAs corto horquilla diseño se construyeron. El CXCR4 ARNsi fue impulsado por un promotor U6 mientras que el CCR5 ARNsi fue impulsado por un promotor H1. Un promotor CMV impulsada EGFP reportero gen es, además, incorporarse en la construcción de bispecific. Alta eficiencia en la transducción coreceptor expresando Magos y Ghost líneas celulares con la consecuente reglamentación de las respectivas correceptores se logró con lentiviral vectores. Cuando el ARNsi expresando transduced células fueron retados con el trópico X4 y R5 del VIH-1, que demostró marcada resistencia viral. VIH-1, la resistencia también se observó en bispecific lentiviral vector transduced primaria PBMCs.

Conclusiones

Ambos correceptores CCR5 y CXCR4 podría ser simultáneamente objeto de la regulación hacia abajo por un único vector lentiviral combinatoria incorporar respectivos anti-coreceptor siRNAs. Estable en la regulación de los correceptores protege a las células contra la infección por ambas X4 y R5 trópico VIH-1. Estable en la regulación de las moléculas celulares que ayuda en la infección por VIH-1 será una estrategia eficaz para el VIH a largo plazo de la terapia génica.

Antecedentes

El VIH / SIDA sigue siendo un importante problema de salud pública en todo el mundo con millones de personas actualmente infectadas y de las nuevas infecciones están en aumento. Dado que no son vacunas eficaces disponibles en la actualidad para la prevención, la adopción de nuevas terapias deben desarrollarse. Aunque combinatoria terapias HAART, como han demostrado ser eficaces en la prolongación de la vida, que no permita una cura completa. Otras limitaciones son la terapia HAART con el desarrollo de virus mutantes resistentes a los medicamentos y la toxicidad después de la terapia prolongada. Intracelular de inmunización por estrategias de la terapia génica ofrece un prometedor enfoque alternativo para el control y la gestión de la enfermedad del VIH. Una serie de enfoques anteriores que implicaba la utilización de proteínas transdominant [1 - 3], señuelos [3 - 7], y las ribozimas [5, 8 - 12] ha demostrado promesa inicial, pero no estuvieron a la altura de la utilidad práctica en el suministro de una protección adecuada. Con el descubrimiento de que el fenómeno de la interferencia por ARN opera en células de mamíferos y es altamente efectiva en el selectivo de silenciamiento génico, potente nuevo ARN interferentes pequeños (ARNsi) se han convertido en moléculas disponibles para añadir al arsenal anti-VIH [13].

RNAi es un potente mecanismo de post-transcripcional silenciamiento génico. Mediada por siRNAs secuencia específica, que puede regular de manera eficaz en la expresión de celulares ya sea viral o de ARN objetivo moléculas selectiva por la degradación de mRNAs [13 - 16]. Mecanismo de destrucción implica una endonucleasa presentes en el complejo RISC, que se guía por el componente antisentido ARNsi de la meta para el reconocimiento. Varios informes han demostrado que la entrega de siRNAs por transfección de plásmidos o presynthesized codificación siRNAs en células cultivadas pueden inhibir eficazmente las infecciones de VIH-1 [17 - 26]. Antiviral efectos de la ejecución de estos métodos son sólo transitorios, debido a la degradación y la eventual dilución de siRNAs durante la división celular. Para el VIH estrategias de terapia génica para tener éxito en el largo plazo, es necesario que ARNsi de codificación de los transgenes se mantenga a largo plazo y expresó en un virus susceptible de células objetivo. En este sentido, lentiviral vectores han demostrado ser muy eficaces en la transducción de genes de alta eficiencia y sostenido de la expresión génica.

Una serie de enfoques anteriores usando ya sea sintéticas o siRNAs plásmido han expresado construye con éxito logrado viral transcripciones y efectiva inhibición viral. De éstos, algunos anti-VIH-1 siRNAs, como siRNAs contra tat, tat-rev se había introducido en lentiviral vectores y su eficacia se ha demostrado tanto en líneas celulares y primaria de las células T y macrófagos [27, 28]. También se prometedores datos obtenidos en los experimentos que muestran que anti-rev siRNAs contra el VIH-1 fueron funcionales en conferir resistencia viral diferenciadas en células T y macrófagos derivados de lentiviral transduced CD34 + células progenitoras hematopoyéticas [29].

Además de la orientación viral transcripciones, muchos estudios incluida la nuestra también investigaron la eficacia de siRNAs abajo en la regulación de la célula hospedadora moléculas necesarias para la infección por VIH-1 [18, 21, 23, 24, 30, 31]. Una de las ventajas en la orientación de las moléculas celulares es que la eficacia será más amplio espectro en contra de todas las clados del virus y la frecuencia de mutantes de escape será inferior. Down regulación de los principales receptores de la superficie celular CD4 y la consecuente inhibición de la infección por VIH-1 se muestran utilizando sintéticas siRNAs. Sin embargo, desde CD4 es una molécula de superficie celular esencial para la función inmunológica, no se trata de un objetivo práctico de terapia genética para el VIH. Receptores de quimioquinas CCR5 y CXCR4, desempeñan papeles críticos como correceptores para la entrada viral durante la infección con el trópico R5 macrófagos y células T trópico X4 del VIH-1 en las cepas víricas, respectivamente [32, 33]. Por lo tanto son adecuados a los objetivos para ARNsi mediada por la reglamentación. Desde ambos R5 y X4 cepas virales están involucrados en la patogénesis de enfermedades, es importante tener en cuenta el bloqueo de los dos correceptores respectivos en el desarrollo de terapias eficaces. En un segmento de la población humana, una forma natural de 32 pb supresión en el gen CCR5 resultados en la pérdida de este importante coreceptor lo que confiere resistencia a la infección por el VIH [34 - 36]. Individuos homocigotos o heterocigotos para esta mutación siendo fisiológicamente normal. Con respecto a la CXCR4 coreceptor, se constató que se prescindible para el desarrollo de las células T y en la maduración murino estudios [37]. Estos hallazgos sugieren que la CCR5 y CXCR4 son prometedores objetivos terapias para el VIH.

Sobre la base de esta lógica, los recientes trabajos de síntesis con siRNAs demostrado que las regulan, ya sea CCR5 o CXCR4, se protegen las células de X4 o R5 cepas del VIH-1, respectivamente, en el nivel de entrada viral [18, 21, 23, 24]. Aunque estable expresión de un anti-CCR5 ARNsi se logró utilizando un vector lentiviral en un estudio, en la regulación de CCR5 solo en la cara de una infección por VIH-1 es insuficiente [31]. Por lo tanto, hemos experimentado con sintéticas bispecific combinatoria construcciones orientadas a la vez CCR5 y CXCR4, y han demostrado su eficacia en cultivos celulares [24]. Para avanzar más, nuestros estudios actuales se orientan hacia la construcción de un único bispecific vector lentiviral expresando CCR5 y CXCR4, dos siRNAs. El uso de este combinatoria construir, aquí mostramos alta eficiencia de transducción, en la regulación simultánea de los dos correceptores resultante en la resistencia del VIH-1.

Resultados y Discusión
Coreceptor abajo por un reglamento bispecific vector lentiviral

Nuestro objetivo principal en estos estudios es la introducción de CCR5 y CXCR4, dos siRNAs en un solo lentiviral construir para lograr su expresión estable en transduced células. Lentiviral vectores ofrecen ventajas sobre los sistemas convencionales de vectores retrovirales ya que pueden dividir a la transducción, así como nondividing células y son menos vulnerables a las transgén silenciar [44 - 47]. La transferencia de vectores VIH-7-GFP-XHR (denominado XHR) figura un breve horquilla de tipo anti-CXCR4 ARNsi impulsado por una Pol-III U6 promotor seguido de un corto horquilla anti-CCR5 ARNsi impulsado por un promotor Pol-III , H1. Aguas abajo, el reportero de genes, EGFP está impulsada por un promotor CMV. El control de las buenas prácticas agrarias independientes de vectores, el VIH-7-GFP, que figura sólo el reportero gen EGFP (Fig 1].

Magos-CXCR4 células que expresan constitutivamente CXCR4 en la superficie celular cuando transduced con el control de vectores o XHR vector ha demostrado el 97% y 83%, respectivamente, EGFP expresión, medida por FACS análisis indicando alta eficiencia de transducción (Figura 2A y 2C]. Para determinar si se había reducido CXCR4 regulados por los respectivos ARNsi XHR en la construcción, la transduced células fueron analizadas para CXCR4 superficie expresión. La superficie de los niveles de CXCR4 se redujeron significativamente en XHR transduced células (73% inferior), en comparación con las células transduced con el control de vectores (Figura 2B y 2D], lo que indica la eficacia de la CXCR4 ARNsi sobre su objetivo. Del mismo modo, para determinar las actividades de la lucha contra el CCR5 en la ARNsi XHR vector, transduced Ghost R5 células que expresan constitutivamente CCR5 fueron evaluados. Como se observa en la Fig 3A y 3C, los altos niveles de transducción (84% y 83%) se observaron en Ghost-R5 células ni con el control de vectores o XHR vector, respectivamente. Cuando las células se analizaron transduced de expresión CCR5, una dramática disminución de la expresión CCR5 fue visto en XHR células (72%) en comparación con el control de vectores transduced células (Fig 3B y 3D]. Estos resultados han demostrado que la bispecific lentiviral vector XHR regula de manera eficiente por los dos objetivos de CCR5 y CXCR4 en las células respectivas.

Expresión de siRNAs y abajo regulación de CCR5 y CXCR4, transcripciones

Para confirmar que en la regulación de ambos correceptores CCR5 y CXCR4, como se ha visto por FACS análisis se debe a la reducción de los niveles de los mRNAs correspondientes, vector transduced células se analizaron por RT-PCR. Como control interno, GAPDH mRNA También se ha analizado. XHR vector transduced células mostraron una considerable reducción en los niveles de transcripción de las dos CCR5 y CXCR4, en comparación con no transduced y control de vectores GFP transduced células. Los niveles de mRNA GAPDH control se mantuvo sin cambios en todas las muestras (Fig 4]. Para validar la expresión de cada uno de los siRNAs en transduced Magos-R5 Ghost CXCR4 y las células, ARN celular fue analizado por el norte de análisis de su presencia. Como los controles internos, la presencia de constitutivamente expresado miARN ARN-16 se analizaron en paralelo. Como era de esperar, los niveles comparables de miARN-16 RNAs (22 pb de longitud) fueron detectados en el control de vectores transduced las buenas prácticas agrarias, así como en XHR vector transduced células (Fig. 5A]. ARN correspondiente a CXCR4 y CCR5 shRNAs (en representación de la 21nt antisentido de cada capítulo shRNA) se observaron en XHR transduced GFP, pero no en el control de vectores transduced células (Fig. 5B].

Bispecific ARNsi vector no induce interferón

Moléculas de ARN de doble varados durante más de ~ 30 bp se sabe que inducen la vía de interferón en respuesta a infecciones virales. Como siRNAs son por lo general compuesto de 19-24 pb de longitud, que no se espera que activar ese tipo de respuesta que media no específicos en la regulación de celular o viral mRNAs. Sin embargo, datos recientes han demostrado que en algunas circunstancias, podrían inducir determinadas siRNAs variable de activación de los niveles de interferón [48 - 50]. Para descartar esa posibilidad con el presente siRNAs, buscamos upregulation de fosforilados por PKR-occidental blot. PKR es una proteína quinasa que se activa a través de la fosforilación en presencia de dsRNA y participa en la respuesta de interferón. Nuestros resultados han mostrado que los niveles de fosforilados PKR permanecer sin cambios en XHR transduced células similares a los simulacros y las buenas prácticas agrarias vector transduced células. En cambio, los niveles elevados de fosforilados PKR puede verse en el poli I: C transfectadas las células utilizadas como controles positivos (fig. 6]. Estos datos se excluye la posibilidad de que el interferón no específicos de activación por la combinatoria lentiviral construir.

Resistencia de ARNsi transduced células a la infección por VIH-1

Para determinar si el reglamento de los principales correceptores, CCR5 y CXCR4, traducido a resistencia a los virus, transduced Magos-R5 Ghost CXCR4 y las células fueron retados con X4 (NL4-3) y R5 (BaL1)-trópico cepas de VIH-1, respectivamente. Viral niveles de antígeno p24 en diferentes días post-desafío se determinó por ELISA para cuantificar los niveles de resistencia del VIH-1. Más de un 10 veces en la reducción de los niveles de antígeno viral fue visto con ambas XHR transduced Magos-CXCR4 y Ghost-R5 células, en comparación a los no transduced y las buenas prácticas agrarias independientes vector transduced células (fig. 7]. Hubo un ligero aumento en la producción viral en las células XHR transduced en los días 5 a 7. Esto puede ser debido a nontransduced y / o de bajo ARNsi expresando las células que producen el virus. Seguidamente, pretendemos determinar si la XHR vector de expresión de CCR5 y CXCR4 es eficaz siRNAs en células fisiológicamente relevantes para la terapia génica. En consecuencia, PBMCs transduced fueron retados con vectores de la misma manera que el anterior. A 3 veces el nivel de la inhibición, se observó en los días 3, 5 y 7 (Fig. 8]. Estos resultados XHR establecido que el vector es también eficaz en la enseñanza primaria en la inhibición de las células VIH-1. Aunque claramente significativa, los niveles de virus de la inhibición no eran tan dramáticas como se ha visto con los Reyes Magos y Ghost líneas celulares. Los niveles observados de inhibición viral en PBMC primaria son similares a los observados en un reciente informe [31]. Niveles más bajos de protección en PBMCs probablemente debido a los niveles inferiores de transducción. Los estudios futuros que tienen como objetivo aumentar la eficiencia en la transducción de primaria de los linfocitos y macrófagos pueden superar este obstáculo.

En resumen, nuestros estudios han demostrado por primera vez que un único vector lentiviral se podrían utilizar para ofrecer dos diferentes estable siRNAs dirigidos a dos compañeros de celda de la superficie del receptor de las moléculas y lograr la protección contra ambos X4 y R5 trópico VIH-1 cepas víricas. El corto horquilla diseño permite la utilización de un único promotor para transcribir tanto el sentido y anti-sentido capítulos de cada uno de los siRNAs. Ningún promotor se observó interferencia entre la conducción U6 promotor de la transcripción y el CXCR4 ARNsi H1 promotor de conducción desde el CCR5 ARNsi cantidades comparables de los siRNAs puede verse en transduced células. Además, el interferón posible inducción por la combinatoria construir también fue descartado.

Una de las principales ventajas de utilizar un combinatoria lentiviral orientados a la construcción de los dos correceptores es que la infección con cualquiera de las cepas víricas se pueden prevenir en el paso de la entrada con lo que se elimina la posibilidad de la integración proviral y latencia viral. Dado el éxito con el actual bispecific construir, otras construcciones novela podría ser diseñado y experimentado con los que se incorporan siRNAs dirigidos tanto a los celulares, así como los objetivos viral. Basado en el diseño empleado aquí, es posible introducir más de dos siRNAs en un solo construir en el futuro. Sin embargo se debe tener precaución mientras que la incorporación de múltiples siRNAs en un solo construir porque existe la posibilidad de que más de expresión de los extranjeros siRNAs en una celda puede tener efectos indeseables, como saturado el complejo RISC endógeno y la consiguiente toxicidad. Esta posibilidad tiene que ser a prueba de largo alcance en experimentos in vivo. Anteriormente han introducido un monoespecíficos ARNsi orientados a rev VIH-1 en las células progenitoras hematopoyéticas CD34 a través de lentiviral vectores y derivados transgénicos in vitro de macrófagos y células T in vivo [29]. Los transgénicos células resultaron ser aparentemente normal mientras notablemente resistentes a la infección por VIH-1.

No se esperan efectos nocivos por el estable tumbar de la CCR5 coreceptor in vivo ya que las personas que alberga a 32 pb en la correspondiente supresión de genes son fisiológicamente normales [34, 35]. Aunque el reglamento CXCR4 en células T maduras que circulan en la periferia no contienen ningún insuperables malos efectos, esto puede tener inconvenientes posibles en un establecimiento de células madre debido a su papel en la celda realojamiento en la médula ósea [51, 52]. Además, los últimos estudios de perfiles de expresión génica indicaron algunos efectos fuera de la meta por siRNAs [53]. Por lo tanto, en el presente orientadas a la construcción de combinatoria tanto CXCR4 y CCR5 coreceptor moléculas deben probarse cuidadosamente in vivo en un sistema como el SCID-hu mouse modelo para evaluar su eficacia y la posible toxicidad en células diferenciadas antes de que se pueden utilizar para la terapia génica En sujetos humanos. Esos experimentos están actualmente en curso.

Conclusiones

Para el VIH / SIDA, las estrategias de terapia génica para tener éxito, la necesidad de nuevas moléculas que aprovechar. En este sentido, ofrece un gran potencial siRNAs. La explotación de estos prometedores candidatos a regular hacia abajo esencial correceptores celulares a través de la utilización de vectores lentiviral largo plazo facilita la derivación de resistentes a los macrófagos y las células T que son los principales objetivos para el virus. Nuestros resultados muestran por primera vez que la expresión de CCR5 y CXCR4, dos siRNAs es posible en combinación con el uso de vectores lentiviral. Coreceptor específicas siRNAs estable transduced con la bispecific vector lentiviral mostraron un marcado resistencia contra ambos trópico de células T y monocitos trópico infección por VIH-1 en líneas celulares y primaria PBMCs. El nuevo desarrollo de vectores bispecific muestra prometedor para la aplicación potencial en vivo.

Materiales y Métodos
Plásmido vector lentiviral y construcción

Anteriormente caracteriza siRNAs contra CCR5 y CXCR4, se utilizaron en la generación de la bispecific vector lentiviral [23, 24, 30]. Una tercera generación de vector lentiviral columna vertebral se emplean para obtener el bispecific construye. Los dos cis-actuando elementos, a saber, la central que consta de ADN colgajo cPPT y CTS (para facilitar la importación nuclear de la preintegration complejo viral) y el WPRE (para promover las exportaciones nucleares de las transcripciones y / o aumentar la eficiencia de polyadenylation de transcripciones ), Se han diseñado para mejorar el rendimiento del vector [38, 39]. Un cassette de expresión ARNsi orientación CXCR4, bajo el control de la Pol-III U6 fue promotor de la amplificación de PCR plásmido pTZ-U6 +1 descrita por Castanotto et al [40]. Este casete fue clonado en pHIV-7-vector de transferencia de las buenas prácticas agrarias en el sitio BamHI BamHI inmediatamente aguas arriba del gen EGFP-CMV. Este cassette contiene una restricción MluI MluI sitio abajo de la CXCR4 ARNsi secuencia para su posterior clonación de la H1 promotor impulsado CCR5 ARNsi cassette. La H1-cassette de expresión CCR5 ARNsi También se generó como se ha descrito anteriormente utilizando el plásmido pSUPER (Oligoengine, Seattle, WA). Secuenciación y la confirmación de los candidatos fue realizada por clones Laragen Inc (Los Angeles, CA). La transferencia de vectores que contienen las inserciones U6-X4 ARNsi y H1-ARNsi CCR5 que se denomina pHIV-XHR-GFP.

De cultivo celular y la producción de vectores

293T células PBMCs y se mantuvieron en los medios de comunicación MEDM complementado con 10% de SFB. Magos-CXCR4 células obtenidas de la SIDA y de reactivos de referencia del Programa se han mantenido en los medios de comunicación como ha sido descrito previamente [41, 42]. Ghost-R5 células obtenidas de la SIDA y de reactivos de referencia del Programa se han mantenido en los medios de comunicación como ha sido descrito previamente [43]. Para generar lentiviral vectores, quince microgramos de vector de transferencia de las buenas prácticas agrarias ya sea con-sola o junto XHR fueron transfectadas con 15 ug pCHGP-2, 5 ug pCMV-Rev, y 5 ug pCMV-293T en VSVG células en el 60% confluency en 100 mm cultura Platos utilizando un kit de transfección de fosfato de calcio (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Seis horas después de transfección, se intercambió medio fresco. Sobrenadantes de cultivo de células que contienen el vector se colectaron a los 24, 36, 48, y 60 horas después de transfección y mancomunados. Vector sobrenadantes se concentraron por ultracentrifugación y más tarde con ajuste en 293T células por medio de análisis de las buenas prácticas agrarias FACS expresión.

Lentiviral vector de transducción y análisis FACS

Magos-CXCR4 y CCR5-Ghost células fueron sembradas en placas de 6 y 24 horas antes de la transducción, 5 × 10 5 células por así. Las células se transduced con vectores lentiviral en un moi, de 10, en presencia de 4 ug / ml polybrene por 2 horas. Por transducción de PBMCs, las células fueron aisladas de la sangre por todo el Histopaque ® -1077 (Sigma-Aldrich), y luego cultivadas en el CD3 y CD28 placas revestidas de anticuerpos. Tres días después de la estimulación, PBMCs se transduced a un moi, de 20, en presencia de 4 ug / ml polybrene. PBMC de transducción se repitió al día siguiente. Setenta y dos horas después de transducción de ARNsi con vectores que contienen lentiviral, FACS se realizó un análisis para determinar los niveles de expresión de la superficie celular CCR5 y CXCR4. No transduced y transduced células se tiñeron con anticuerpos conjugados con proceda PE-Cy 5 (Pharmingen, San Diego, CA), es decir, anti-CXCR4 para Magos-CXCR4 y las células de lucha contra el CCR5 de las células CCR5-Ghost. Transducción de la eficacia se determinó mediante ensayo EGFP expresión. FACS análisis se realizó en el Beckman Coulter Epics XL ADC usando el software para el análisis.

Del Norte para el análisis de expresión shRNA

ARN total fue extraído a partir de la no-transduced y transduced Magos-CXCR4 y CCR5-Ghost células por medio de la ARN-STAT-60 reactivo (Tel-Test, Friendswood, TX). Los pequeños ARN's, <200 nt, fueron separadas y concentradas usando las mirVana mirVana ™ miARN Aislamiento Kit (Ambion, Austin, TX). Veinte microgramos de los pequeños RNAs se hibridó durante la noche a 37 ° C utilizando la mirVana mirVana ™ miARN Detección Kit (Ambion) con γ-32 P etiquetados sondas hacerse utilizando el mirVana mirVana ™ & Probe Kit Marker (Ambion). Las sondas son complementarias a las líneas antisentido CCR5 y CXCR4 de siRNAs. Hibridación reacciones fueron procesados de acuerdo con el protocolo del fabricante y ejecutar el 15% de poliacrilamida-urea geles de TBE. Geles fueron expuestos a rayos X película. Una sonda complementaria de miARN-16 se suministra con el kit de detección de miARN se utilizó como control interno.

Western Blot análisis de fosforilados PKR

Lisados de células de la no transduced y transduced células se ejecute el 10% de poliacrilamida-SDS-TBE geles. Las proteínas fueron immunoblotted en Immobilon ™ - P membranas (Millipore, Bedford, MA) e incubadas con anticuerpos específicos para fosforilados-PKR (Sigma-Aldrich), mientras que los anticuerpos anti-actina (Sigma-Aldrich) se utilizó para detectar celulares actina como internos Control. Un segundo anticuerpo, cabra anti-IgG de conejo conjugado con phophatase alcalina (Promega, Madison, WI), se añadió. Un sustrato reactivo alcalino phophatase, Western Blue (Promega), se utiliza para visualizar las bandas.

RT-PCR

ARN total fue extraído a partir de la no-transduced y transduced células. Primers específicos para CXCR4 (avance: 5'-ggaggggatcagtatatacacttc e invertir: 5'-cgccaacatagaccaccttttc) y CCR5 (avance: 5'-caaaaagaaggtcttcattacacc e invertir: 5'-cttgctcgctcgggagcctc) (IDT, Coralsville, IA) se utilizan para determinar los niveles de transcripción al tiempo GAPDH (avance: 5'-ctgagaacgggaagcttgtcatcaa e invertir: 5'-gcctgcttcaccaccttcttgatg) los cebos se utilizaron como control interno. - Un paso reacciones de RT-PCR se realizaron con la Superíndice III ™ One-Step RT-PCR kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las reacciones se ejecutan en geles de agarosa al 1% y apropiado bandas se visualizaron con luz UV.

VIH-1 Challenge

Para determinar si la baja regulación de la transcripción CCR5 y CXCR4, los niveles de la superficie celular y expresión inhibió la infección por VIH-1, no transduced y transduced células fueron retados con NL4-3 (X4-trópico) y BaL-1 (R5-trópico) de las cepas VIH-1, a un moi de 0,01, según lo descrito anteriormente [24]. Viral sobrenadantes se recogieron todos los días de infectados Magos-Ghost-CXCR4 y CCR5 de las células p24 ensayo. ELISA se utilizó para determinar los valores p24 empleando un Coulter-p24 kit (Beckman Coulter, Fullerton, CA). PBMC reto para los experimentos, no transduced y transduced células fueron infectadas con NL4-3 y Bal-1 cepas de cultivo de células y sobrenadantes se recogieron en los días 1, 3, 5, y 7 después de la infección para medir los niveles de p24.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autor de contribuciones

JA llevado a cabo todos los experimentos. RA fue responsable de la elaboración y la aplicación experimental del proyecto.

Agradecimientos

El trabajo que aquí con el apoyo de subvenciones NIH AI50492 y AI057066 a RA Esta labor también se ha visto facilitada por la infraestructura y los recursos proporcionados por el Centro de Colorado para la Investigación del SIDA Grant P30 AI054907. Damos las gracias a Karen Helms para ayudar en el análisis y la FACS William Trigo para la lectura crítica del manuscrito. Damos las gracias a NIH SIDA Investigación y Reactivos de referencia Programa de muchos reactivos y proporcionar líneas de células utilizadas en este trabajo.