AIDS Research and Therapy, 2004; 1: 2-2 (más artículos en esta revista)

Lentiviral transducción de Tar ribozyme señuelos y CCR5 en las células progenitoras CD34 + y derivación del VIH-1 resistentes a los macrófagos y las células T

BioMed Central
Akhil Banerjea (akhil@colostate.edu) [1], Ming-Jie Li (mili@coh.org) [2], Leila Remling (remling@colostate.edu) [1], Juan Rossi (jrossi@coh.org) [2], Ramesh Akkina (akkina@colostate.edu) [1]
[1] Dept. Microbiology, Immunology and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, Colorado 80523, USA
[2] de la División de Biología Molecular, Instituto de Investigación Beckman de la Ciudad de la Esperanza, 1450 East Duarte Road, Duarte, California, 91010, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Los enfoques basados en el RNA antivirales contra el VIH-1 se encuentran entre las más prometedoras a largo plazo de la terapia génica. Estos incluyen las ribozimas, aptamers (señuelos), y los pequeños ARN interferencia (siRNAs). Lentiviral vectores son ideales para este tipo de los inhibidores de transducción de ARN en las células madre hematopoyéticas, debido a su capacidad de la transducción de no dividir las células y su relativa a refractiveness silenciamiento génico. El objetivo de este estudio es la introducción de un paciente con VIH-1 Tar aptamer ya sea sola o en combinación con un anti-CCR5 ribozyme + CD34 en las células progenitoras hematopoyéticas el VIH a través de un vector lentiviral basado para obtener progenie viral resistente a las células T y macrófagos.

Resultados

Alta eficiencia y sostenido de la transferencia de genes en las células CD34 + se lograron con las construcciones de vector lentiviral albergar tanto Tar Tar señuelo señuelo o en combinación con CCR5 ribozyme. Células transduced con estas construcciones diferenciadas normalmente en los linfocitos T in vivo en tu / liv injertos de ratones SCID-hu, y en los macrófagos in vitro en presencia de factores de crecimiento apropiados. Cuando desafió in vitro, la diferenciadas macrófagos y los linfocitos T mostraron un marcado la resistencia contra la infección por VIH-1.

Conclusiones

Viral transgénica resistente a los macrófagos y las células T que expresan el VIH-1 Tar aptamer ya sea sola o en combinación con un anti-CCR5 ribozyme se podía obtener por lentiviral transducción de genes de las células progenitoras CD34 +. Estos resultados muestran por primera vez que la expresión de estos anti-VIH-1 en combinación transgenes no interfieran con thymopoiesis normal y, por tanto, han sentado las bases para su aplicación en la base de células madre de la terapia genética para el VIH / SIDA.

Antecedentes

Humanos macrófagos y los linfocitos T son las principales células de acogida para la replicación del VIH-1. La infección inicial se establece por los macrófagos trópico virus (R5) que utiliza el receptor de quimiocinas CCR5 y CD4 para conseguir participar en un huésped susceptible de células. Durante las últimas etapas de la enfermedad, las células T trópico virus (X4) que usan CXCR4 como coreceptor predominan [1, 2]. Dado que el VIH-1 correceptores desempeñar un papel fundamental durante las primeras interacciones de células virales, que son objetivos atractivos para muchos enfoques antiviral. A 32-base pair supresión en el gen CCR5 se encuentra en un segmento de la normal Europea y Norte América población prestados sus macrófagos resistentes a la infección por R5-tropismo del VIH-1 [3]. Dado que estos individuos carecen de un funcional CCR5 son aparentemente normal, este gen ha sido blanco de numerosos investigadores para conferir resistencia del VIH-1. MuLV Uso de los vectores de la entrega de genes, ribozimas o enzimas de ADN dirigidas contra CCR5 fueron previamente demostrado inhibir la entrada del VIH-1 tanto in vitro como in vivo en ratones SCID-hu modelo [4 - 6]. Eficacia de siRNAs abajo en la regulación de la CCR5 coreceptor y de ese modo prevenir la entrada del VIH-1 fue también descrito recientemente [7, 8].

Las proteínas reguladoras Tat y Rev codificadas por el genoma viral son indispensables para el VIH-1, la expresión génica y la replicación. La proteína Tat interactúa con el RNA abultados de la región transactivation elemento de respuesta (Tar), presentes en la 5'-end de todas las transcripciones del VIH-1 [1]. En ausencia de Tat, sólo a corto ineficaz transcripciones se generan. Tat se sabe también de interactuar con factores celulares como ciclina T1 y dependientes de ciclina quinasa (Cdk9). Desde Tat juega un papel fundamental en la replicación del virus, es un objetivo ideal. Efectiva inhibición de la replicación del VIH-1 fue mostrada anteriormente por el uso de señuelos ARN específicos Tar y ribozimas [9 - 11]. Además, siRNAs dirigidos contra Tat También se comprobó que muy potente en la inhibición de la replicación del VIH-1 en líneas celulares cultivadas en PBMCs y [12, 13]. Sin embargo, el desarrollo de resistencia viral y la generación de mutantes de escape son los posibles obstáculos para la eficacia a largo plazo de estas construcciones como, por ejemplo, las recientes conclusiones de Boden et al [14]. Estos obstáculos se pueden superar mediante el uso de la combinatoria construye contra objetivos múltiples en el genoma viral, así como los objetivos que ayudar celular en la infección y la replicación viral.

Progenitoras hematopoyéticas CD34 + células madre (HPCs) son ideales para objetivos transducing anti-VIH, como los genes que dan lugar a las células T y macrófagos, que son los principales objetivos viral. La mayoría de los trabajos anteriores con anti-VIH ARN ribozimas y señuelos empleados convencionales derivados MuLV vectores retrovirales a la transducción de estas células [5, 6, 11]. Sin embargo, la eficiencia de la transducción de genes por estos vectores es relativamente baja, ya que no están en condiciones de la transducción de no dividir celdas. Además, los transgenes transportadas por estos vectores son propensos a silenciamiento génico durante la etapa final de la diferenciación de las células, como los macrófagos y las células T [15]. Por el contrario, lentiviral vectores parecen no tener estas limitaciones [16, 17]. Sobre la base de estas ventajas, hemos utilizado la nueva generación lentiviral vectores para alcanzar un alto nivel de la transferencia de genes y sostenido de la expresión génica. Un ribozyme contra CCR5 y un señuelo Tar aptamer anteriormente demostrado inhibir el VIH-1 en las células transduced [6, 18, 19]. En anteriores estudios in vivo, basado MuLV convencionales se utilizan vectores retrovirales. Además, no se sabe si Tar señuelo es eficaz en la diferenciación in vivo timocitos. En estos estudios, nuestro objetivo es determinar la utilidad de estas construcciones cuando se introdujo en humanos CD34 + células progenitoras a través de un VIH-1 vector lentiviral basado en el VIH resistentes a derivar células diferenciadas objetivo tanto in vitro como in vivo. El uso de una diferenciación celular in vitro e in vivo sistema SCID-hu modelo de ratón, nos muestran que la expresión de Tar señuelo solo o en combinación con un anti-CCR5 ribozyme no tiene ningún efecto adverso en la diferenciación de linaje específico de células CD34 + en los macrófagos y los linfocitos T. También demuestran que las células transgénicas mostrar la resistencia al desafío del VIH-1.

Resultados
Alta eficiencia de la transducción de células CD34 + con lentiviral construye

Los primeros estudios usando retrovirus MuLV basado vectores han demostrado la eficacia de aptamers y ribozimas contra Tat, Rev, o dotación de interferir con la infección por VIH-1 [5, 6, 10, 20]. Down regulación de los CCR5 de la ribozyme utiliza aquí y su correspondiente efecto inhibidor de la infección por VIH-1 se ha descrito anteriormente [5, 6, 19]. Para ampliar aún más la utilidad de este tipo de inhibitoria ARN's, se utilizó una tercera generación de VIH-1 basada en la libre inactivar vector (Fig. 1] [21] Una población altamente enriquecido humanos de células CD34 + (90% puro) se utilizaron para vector Transductions. Un representante FACS purificada perfil de las células CD34 + se muestra en la Fig. 2A. Transducción de la eficiencia, según lo determinado por FACS para EGFP a las 48 hrs después de la transducción, mostraron niveles altos de la transferencia de genes y superó el 90% para ambos U16Tar señuelo y Tar-CCR5 construye vector (Fig. 2, panel B & C).

Tar-Tar y CCR5Rz vector transduced diferenciar células CD34 + maduros normalmente en los macrófagos

No se sabe si lentivirus transduced señuelo y Tar-Tar CCR5Rz, tendrá todos los efectos adversos en el linaje específico de la diferenciación de células CD34 + en diferentes células etapa final. Nuestros resultados mostraron que tanto el control de vectores y transduced madurado normalmente en las células y erythroid mieloide colonias y no se observaron diferencias significativas entre sus habilidades formadoras de colonias (datos no presentados). Para determinar si Tar-Tar y CCR5Rz ARN expresando CD34 + células puede dar lugar a los macrófagos maduros, mieloide colonias se combinaron y permitieron diferenciar en células adherentes en las culturas complementarse con M-CSF y GM-CSF, por un período de 7 días. Los resultados mostraron que las células derivadas de control, por sí solo vector, vector o expresar transgenes (Tar-Tar y CCR5Rz) mostraron un patrón similar de la expresión CD14 (Fig. 3, panel de A1 a A4). Los transgénicos macrófagos fueron analizadas por los niveles de expresión EGFP reportero. Como era de esperar, la nontransduced células no mostró expresión EGFP (Fig. 3, grupo B1), pero con cualquiera de las dos células transduced vector EGFP sola (grupo B2) o vector con transgenes (grupo B3 y B4) fueron fuertemente positiva (> 80% ) Para EGFP producción. RT-PCR análisis confirmó la expresión del transgen Tar. Tar productos específicos de espera tamaño (125 pb) se detectaron en ambos Tar (Fig. 4, grupo A, carril 2), y Tar-CCR5Rz (carril 3) vector transduced macrófagos. Control nontransduced macrófagos, como se esperaba, no mostró ningún producto específico (carril 1). No hay diferencia en los importes de control β-actina ARN puede verse en el correspondiente carriles (Fig. 4, panel B).

Tar-Tar y CCR5Rz transgénicos macrófagos resistir el VIH-1 desafío

Para determinar si Tar-Tar y CCR5Rz transduced in vitro de macrófagos diferenciados resistir el VIH-1 reto, que se infectaron con el VIH trópico R5-Bal-1 cepa. Cultura sobrenadantes recogidos en diferentes días post desafío se analizaron para antígeno p24 por ELISA. En comparación con unmanipulated control o control EGFP, tanto Tar y Tar-CCR5Rz expresando macrófagos mostró notable resistencia contra el desafío del VIH-1 (Fig. 5]. Pequeñas cantidades de p24 podría ser detectado en el día siete y ninguno a los nueve días de la infección y en Tar Tar-CCR5Rz transduced células.

Tar-Tar y CCR5Rz transduced células CD34 + puede dar lugar a timocitos en tu SCID-hu / liv injertos

Tu Humanos / liv injertos en ratones SCID-hu proporcionar un ambiente ideal para las células CD34 + para madurar en timocitos. Para determinar si los transgenes lentivirally expresó Tar y Tar-CCR5Rz tendría ningún efecto negativo en este proceso de diferenciación, timocitos obtenidos de SCID-hu injertos 60-70 días después de la reconstitución se analizaron EGFP expresión. Todos los ratones de los cuatro (dos de cada uno de ellos con Tar y Tar-CCR5Rz) que fueron inyectados con transduced CD34 + células fueron positivas para la presencia EGFP expresando timocitos. De los dos ratones inyectados con Tar construir un 85% mostró niveles de la reconstitución con el otro es del 33%. Para los dos Tar-CCR5Rz construir ratones inyectados, la reconstitución niveles fueron del 75% y el 30% (Fig. 6, los grupos A y B). Reconstitución se sabe que los niveles varían considerablemente de ratón a ratón sobre la base de la variable tamaño de los injertos inyectado y posiblemente debido a los diferentes números de células madre de verdad presentes en las muestras inyectadas [22, 23]. Desde vector transduced células CD34 + dio lugar a EGFP expresando timocitos en SCID-hu injertos, estos resultados sugieren que la expresión de uno o Tar-Tar CCR5Rz RNA no detectables tiene efectos deletéreos sobre la thymopoiesis medidas in vivo. FACS análisis se llevó a cabo en la biopsia por tinción de timocitos CD4 y CD8 antígenos para evaluar la presencia de diferentes subconjuntos de células. La mayoría de los timocitos (75 - 80%) manchados positivo para CD4 y CD8 (doble positivo), en consonancia con thymopoiesis normal (Fig. 7, a los grupos B, D). Similar a la de control (B), CD4 y CD8 positivos único timocitos maduros también se observan en Tar y Tar-CCR5Rz transduced timocitos derivados en SCID-hu injertos (C y D). Estos datos indicaron el desarrollo normal de las tres subpoblaciones de thymocyte Tar y Tar-CCR5Rz transduced células CD34 +. Cuando estas células se cultivaron in vitro por un período adicional de 7 días, un rápido descenso en el número de células CD4/CD8 doble positivo se observó que coincidió con un aumento correspondiente en el único positivo timocitos maduros (datos no presentados). Para determinar si los derivados transgénicos timocitos en el ratones SCID-hu conservado su capacidad para la estimulación mitogénica inespecíficos en presencia de IL-2, que se cultivaron en presencia de PHA-P durante 3 días. Aproximadamente, un aumento de 3 veces en el número de timocitos se observó tanto para el control, así como las células transduced (datos no presentados). Estas células expresó el receptor de quimiocinas CXCR4, como se espera (datos no presentados).

In vivo derivados transgénicos timocitos resistir el VIH-1 desafío

Para determinar si Tar-Tar y CCR5Rz ARN expresando timocitos mostrar resistencia a la replicación del VIH-1, FACS ordenados EGFP células positivas fueron retados con un T-tropismo del VIH-1 NL4.3 virus in vitro (Fig. 8]. Timocitos aislados de ambos grupos de ratones (Tar-Tar y CCR5Rz transduced) mostró notable resistencia al VIH-1. En contraste, el control unmanipulated timocitos producido grandes cantidades de virus (~ 8 veces más alta antígeno p24 en el día 6). Estas células control siguió produciendo virus detectable hasta el 25 días post infección (datos no presentados)

Discusión

El futuro éxito de las células madre basado en estrategias de terapia génica contra la infección por VIH-1 depende novela interferir en el aprovechamiento de los genes in vivo aplicación en el ser humano. Este colectivo exige la utilización de células madre con la transducción de genes nuevos vectores seguida de la evaluación preclínica de construcciones de genes terapéuticos en un in vivo. Para lograr este objetivo, hemos utilizado lentiviral vectores de la transducción de células CD34 + con un señuelo Tar solo o en combinación con un anti-CCR5 ribozyme que regula por un elemento esencial del VIH-1 coreceptor. Tar señuelo interfiere con un elemento esencial del VIH-1 de regulación de genes por lo tanto, la inhibición de la entrada después de los pasos de la replicación viral, mientras que el anti-CCR5 ribozyme ayuda a prevenir la entrada viral. En vista de lo anteriormente demostrado in vitro de alta eficacia de los aptamers orientados a diferentes proteínas del VIH-1 y de la alta probabilidad de que estos sean explotados para uso clínico, es esencial que sean probados a fondo en vivo. Estos experimentos marca la primera evaluación simultánea de estas construcciones en lentivirally transduced CD34 + células tanto in vitro como in vivo.

El uso de vectores lentiviral permitido mayores niveles de la transferencia de genes (> 90%) en las células CD34 + con tanto de las construcciones como ensayadas por EGFP expresión. Dos rondas de transducción con un muy concentrado VSV-G pseudotyped vector ayudado a alcanzar altos niveles de la transferencia de genes. Células siguieron expresando EGFP todo el período experimental cuando cultivados in vitro en presencia de citoquinas y factores de crecimiento, y mientras 70 días en vivo en ratones SCID-hu. La inactivación de la libre vector lentiviral empleadas aquí cis incorporado dos importantes elementos, a saber, una región y un colgajo WPRE elemento, para lograr altos niveles de EGFP expresión [21]. Además, para reducir al mínimo la interferencia promotor, EGFP reportero, Tar, y los genes CCR5 ribozyme fueron colocados bajo el control de tres diferentes promotores a saber, CMV, U6 y VA1, respectivamente [18]. Sobre la base de los altos niveles de la transferencia de genes y la expresión sostenida obtenidos, lentiviral vectores son muy adecuadas para la transferencia de genes de RNA señuelos y las ribozimas.

CD34 + células pueden ser diferenciadas en mieloide, erythroid, macrófagos y células progenie en la presencia de factores de crecimiento apropiados in vitro, y en los linfocitos T maduros in vivo en ratones SCID-hu [6, 23]. UFC ensayos in vitro arrojó niveles similares de Erythroid mieloide diferenciada y colonias, y en la cultura a largo plazo con las citoquinas, más del 90% de las células madurado en los macrófagos y expresaron CD14 de los niveles normales. Sorprendentemente, EGFP producción también se mantuvo muy elevada (> 80%) en los macrófagos transgénicos. Así lentivirus mediada Tar y Tar-CCR5Rz expresión de los transgenes no interferir negativamente con la diferenciación de las células CD34 + en diferentes linajes incluidos los macrófagos. En experimentos in vivo con ratones SCID-hu, biopsias de células analizadas entre 60 y 70 días después de que ambos mostraron engraftment Tar y Tar-CCR5Rz transduced madurado para convertirse en células progenitoras de los linfocitos T. Durante el curso normal de thymopoiesis, los precursores de células T inicialmente dar lugar a doble CD4 y CD8 positivos células inmaduras siguiendo de la etapa final de maduración en único positivo de células CD4 y CD8 [24]. Es posible que transgén expresión puede modificar selectivamente maduración de los diferentes subconjuntos de células. Nuestros resultados mostraron la presencia de los tres subgrupos en los injertos thymocyte reconstituido con transduced células en comparación con el control de las células. Además, cuando los transgénicos timocitos fueron ordenados y cultivadas in vitro, los niveles de timocitos inmaduros disminuido rápidamente con un aumento correspondiente en el único positivo de células CD4 y CD8 que demuestra su capacidad para madurar. En conjunto, estos datos establecido que transduced CD34 + células progenitoras pueden diferenciar normalmente en macrófagos maduros y timocitos lo que indica no aparente toxicidad de estas construcciones sobre la diferenciación de linaje específico.

Viral desafío experimentos demostraron que tanto Tar y Tar-CCR5Rz ARN expresando maduro T-linfocitos y macrófagos son notablemente resistentes a la infección por VIH-1. No efecto sinérgico se puede observar con la combinatoria construir más probable debido a la predominante efecto de la propia Tar señuelo por la baja moi utilizados aquí. Sin embargo, el efecto sinérgico de la combinatoria construir se ha demostrado en estudios previos que utilizaron una dosis mayor desafío [18]. En los estudios iniciales con similares construcciones utilizando MuLV basado vectores retrovirus, [6, 20], se observó una inhibición viral hasta 2 semanas después desafío en timocitos diferenciadas. Sin embargo, se produjo un importante avance viral de la tercera semana. En cambio, con el vector lentiviral emitido construcciones empleadas aquí, el virus de la producción en un desafío macrófagos y los linfocitos T se mantuvo significativamente más bajos en todo el período de observación de tres semanas. Este mejoramiento en el nivel de protección es probable debido a los mayores niveles de la transducción de genes y expresión, la disminución de los niveles de silenciamiento de transgenes en la diferenciación celular pasos, o una combinación de ambos. Aunque los niveles de inhibición viral transgénicos realizados en los macrófagos y los linfocitos T son muy importantes, pequeñas cantidades de la producción es todavía viral detectable. Esto puede ser debido a sub-óptimo de los niveles de expresión de los transgenes en una subpoblación de las células, o bien debido a la presencia de un pequeño número de los no transduced células en cultivo. Sin embargo, por encima de los resultados demostraron la eficacia de estos transgenes en un establecimiento en una combinatoria de células madre basada en la terapia génica. Debido a los resultados obtenidos allanó el camino para la explotación de este enfoque en los ensayos clínicos humanos.

Conclusiones

Alto y sostenido de la eficiencia de transducción de expresión del VIH-1 interferir genes, anti-CCR5 ribozyme y el VIH-1 Tar aptamer, se podría lograr en CD34 + células progenitoras hematopoyéticas mediante el uso de vectores lentiviral. El transduced células progenitoras diferenciadas normalmente en timocitos maduros en vivo en tu / vida de los injertos SCID-hu ratones normales y en los macrófagos in vitro. Cuando impugnada por el VIH-1, las células transgénicas mostraron un marcado la resistencia contra la infección por VIH-1. Estos resultados muestran por primera vez que la expresión de los transgenes en combinación estas no interfieran con thymopoiesis normal y, por tanto, han sentado las bases para su aplicación en la base de células madre de la terapia genética para el VIH / SIDA.

Métodos
Tar-Tar señuelo y CCR5Rz que contienen vectores lentiviral

El diseño, la estructura y la eficacia in vitro en células cultivadas de la lucha contra el CCR5 ribozyme, Tar señuelo, y Tar-CCR5Rz construcciones fueron descritas anteriormente [5, 10, 18, 19]. Estos RNAs inhibidores introducido en una tercera generación libre inactivar vector lentiviral fueron utilizados en el presente estudio [21]. La transferencia de vectores pHIV-7-GFP CMV que contiene un gen reportero impulsado EGFP se representa en la Fig. 1, grupo 1A. Dos importantes características únicas son las que actúan los elementos cis-, el VIH-1 solapa central de la secuencia y woodchuck post-transcripcional elemento regulador (WPRE) para una óptima EGFP expresión. En la transferencia de vectores pHIV-U16-Tar-GFP, la Tar señuelo bajo el control de la U6 promotor se coloca aguas arriba de la reportera EGFP (fig. 1B]. En la combinatoria construir pHIV-U16Tar-CCR5Rz-GFP, la Tar señuelo está impulsado por U6 mientras que el CCR5 ribozyme está bajo el control del promotor VA1 (Fig. 1C].

Producción de alta titered vectores retrovirales

Para generar las poblaciones de vectores, 293T células fueron transfectadas con 15 μ g de pCHGP-2 (codifica el VIH-1 gag / pol), 15 μ g de transferencia de vectores (pHIV-7 o de las buenas prácticas agrarias pHIV-U16 Tar-GFP o pHIV-U16Tar-CCR5Rz - GFP), 5 μ g de pCMV-rev y cada pCMV-G como se describe anteriormente [23]. Viral sobrenadantes se colectaron a los 24, 48 y, 72 horas después transfección, agrupados, y se concentró por ultracentrifugación [25]. Concentración de virus se resuspendió en un pequeño volumen (500 μ l), de MEDM con 10% de suero fetal bovino. El título de la preparación de vectores se determinó en células 293T, tal como se describe anteriormente con un rango de 1 a 3 × 10 8 TU / ml. Se hicieron múltiples alícuotas y almacenado a -70 ° C.

Aislamiento de CD34 + células progenitoras hematopoyéticas y de alta eficiencia de transducción de vectores

Hígado fetal humano CD34 + células progenitoras hematopoyéticas (HPC) fueron purificados por la selección positiva en la columna de un campo magnetico utilizando el directo CD34 Progenitor Cell Kit de aislamiento Miltenyi Biotech, Gladbach, Alemania, tal y como se describe en detalle anteriormente [23]. Purificada células se suspendieron en la Iscove suplementado con IL3, IL6, y el factor humano de células madre (SCF), cada una con una concentración de 100 ng / ml (R & D Systems, Minneapolis, MN) y cultivadas durante 15 horas a 37 ° C . Vector transductions se llevaron a cabo en una de 12 y placa de cultivo de tejidos utilizando 2 × 10 6 células en un moi, de 10 a 20 en un volumen final de 100 μ l de soporte de 4 μ g / ml polybrene. Después de transducción, alícuotas de células se utilizaron para llevar a cabo in vitro unidad formadoras de colonias (UFC) ensayos, la generación de los macrófagos, y para la reconstitución de tu humanos / liv injertos en ratones SCID-hu para generar células T.

UFC ensayos de la generación y de los macrófagos

Control, o vector transduced células CD34 + se permitió diferenciar en varios linajes de erythroid linajes mieloide y en un medio semisólido, (MethocultTM GF H4434, células madre Technologies, Vancouver, BC, Canadá). Este medio contiene los siguientes componentes: 1% metilcelulosa en Iscove del MDM, el 30% suero bovino fetal, 1% suero bovino albumnin, 0,1 mM 2-mercaptoetanol, 2 mM glutamina, 50 ng / ml rh factor de células madre, 10 ng / ml rh GM-CSF, 10 ng / ml rh IL-3, y 3 unidades / ml rh eritropoyetina. Una unidad formadoras de colonias (UFC) se define como aquel que tiene por lo menos 50 células después de 14 días en el medio selectivo anterior. Mielomonocítica colonias individuales se combinaron y cultivadas en MEDM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 50 ng / ml M-CSF, y de 20 ng / ml de GM-CSF, por un período de 14 días para la diferenciación en macrófagos. Las células fueron teñidas con el antígeno CD14 y analizada por FACS para determinar el rendimiento de macrófagos.

Reconstitución de la SCID-hu transduced con injertos de células CD34 + y la derivación de células T

Humanos fetal timo y los tejidos del hígado que se implantó bajo la cápsula renal de ratones SCID para generar ratones SCID-hu, tal como se describe anteriormente [26]. Control de vectores y lentivirus transduced células progenitoras CD34 + (1 x 10 6) se inyectan directamente en tu / liv injertos para la reconstitución. Ocho a diez semanas de la reconstitución, permitiendo así la diferenciación de células T, los animales fueron sacrificados y timocitos fueron aisladas de los injertos. El diferenciadas timocitos se cultivaron in vitro y comprobado por su capacidad de responder a mitogen, PHA-P y la interleukina-2. En pocas palabras, una vez que se lavaron timocitos con soporte de suero y resuspendido en Iscove's suplementado con 10% de suero fetal bovino. Aproximadamente el 2 × 10 6 células fueron chapada en un 12 y placa de cultivo de tejidos y estimulado con PHA-P (4 μ g / ml) y la IL-2 (10 U / ml) durante tres días. Las células fueron contados después de 3 días para determinar la expansión.

PCR detección de ARN de alquitrán

ARN total fue aislado de aproximadamente 1 × 10 6 control y uso de transgénicos macrófagos Qiagen RNA / DNA mini kit (Qiagen, Alemania) y sometidos a RT-PCR tal y como se describe antes [20]. En cada caso, un fragmento de 125 bp de ADN que se espera. Los siguientes se utilizaron cebadores: 1, Adelante Tar: 5'-GCAATGATGTCGTAATTTGC y 2, Tar Reverse: 5'-CTTGCTCAGTAAGAATTTTCGTC.

Infección por VIH-1 de timocitos

Timocitos derivados de tu / liv injertos de ratones SCID-hu fueron ordenados por FACS para enriquecer a las células que expresan EGFP (> 90% de pureza). Ellos se ampliaron más tarde por la estimulación de PHA-P en el medio que contiene el suero y la IL-2, tal como se describe anteriormente [6, 23]. Aproximadamente 10 6 células fueron infectadas por el VIH-1 NL4-3 en una moi de 0,001 en un volumen final de 100 μ l durante 3 horas a 37 ° C. Las células infectadas se lavaron dos veces con MEDM con 10% de suero fetal bovino y cultivadas en una placa de 12 y por 3 semanas. Sobrenadantes (0,5 ml) se recogieron en día con los medios de comunicación alternativos en cada uno de repuesto. Cantidades de virus producidos en sobrenadantes de cultivo de células se midió por el VIH-1 p24 ELISA.

VIH-1 desafío de células CD34 + macrófagos derivados

Infección con un macrófagos trópico-Bal-1 cepa de VIH-1 se realizó en una placa de 6 así. Aproximadamente el 2 × 10 6 adherente diferenciado in vitro de macrófagos fueron infectados con el virus de Bal-1 en una moi de 0,001 en presencia de 4 μ g / ml de polybrene de 6 horas. Posteriormente, de 3 ml de MEDM complementado con 10% de suero se añadió. Sobrenadantes (0,5 ml) fueron recolectados en días de cada bien por 3 semanas y se almacena a -70 ° C. Los niveles de virus en libertad se determinó por ELISA de antígeno p24.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Autor de contribuciones

AB llevado a cabo la mayoría de los experimentos. Li M JR y fueron responsables de los vectores de diseño y preparación. LR asistido en ratones SCID-hu generación, la reconstitución de células CD34 en ratones, PCR y análisis FACS. RA fue responsable de la elaboración y la aplicación experimental del proyecto.

Agradecimientos

El trabajo que aquí con el apoyo de NIH AI50492 y AI057066 subvenciones a la AR y la IA 42552 y AI2932 a JR. Esta labor también se ha visto facilitada por la infraestructura y los recursos proporcionados por el Centro de Colorado para la Investigación del SIDA Grant P30 AI054907. Damos las gracias a Jeanette Hayes-Klug para la asistencia con ratones SCID-hu cirugías, Karen Helms para ayudar con FACS y Joe Anderson para la lectura crítica del manuscrito. Damos las gracias a NIH SIDA Investigación y Reactivos de referencia Programa de muchos reactivos y proporcionar líneas de células utilizadas en este trabajo.