Journal of Inflammation (London, England), 2004; 1: 2-2 (más artículos en esta revista)

El papel de los mastocitos y tipo de fibra en la isquemia reperfusión lesiones de los músculos esqueléticos murino

BioMed Central
Susan K Bortolotto (Susan.Bortolotto @ svhm.org.au) [1], A Wayne Morrison (Wayne.Morrison @ svhm.org.au) [2], Aurora Messina (messinaa@svhm.org.au) [1]
[1] Bernard O'Brien Instituto de Microcirugía, Fitzroy Street, Fitzroy, AUSTRALIA
[2] Departamento de Cirugía, Universidad de Melbourne, St Vincent's Hospital, Melbourne, Victoria, AUSTRALIA

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Resumen
Antecedentes

Isquemia reperfusión (IR) de las lesiones músculo esquelético, es una causa importante de morbilidad posteriores al trauma y procedimientos quirúrgicos, en el que los tipos de fibras presentan diferentes tipos susceptibilidades. El grado relativo de los mastocitos mediada por lesión, en el marco de diferentes tipos de músculo, no se conoce.

Métodos

En este estudio se comparó la susceptibilidad de la rápida twitch, extensor digitorum largo (EDL), mezclado rápido / lento-twitch gastrocnemio y la predominantemente lento-twitch soleus, los músculos de la isquemia reperfusión (IR) lesión en cuatro grupos de ratones que dan refugio a diferentes Mastocitos densidades; C57/DBA mastocitos agotadas (f W / W f), su heterocigotos (W f / +) y normal littermates (+/+) y control C57BL / 6 ratones. Fin de determinar si la susceptibilidad a la lesión IR se asocia con contenido de los mastocitos y / o el tipo de fibra y / o ratón cepa. En los grupos experimentales, las extremidades traseras de los ratones fueron sometidos a 70 minutos de isquemia caliente torniquete, seguido de 24 h de reperfusión, y el músculo se evaluó la viabilidad de un nuevo conjunto de montaje en rebanadas por la nitroblue tetrazolium (NBT) ensayo histoquímico.

Resultados

La viabilidad fue notablemente superior en el f W / W f independientemente de la cepa de tipo muscular. Con respecto al tipo de músculo, la predominantemente lento-twitch soleus muscular fue significativamente más resistentes a las lesiones que IR gastrocnemio y la EDL en todos los grupos de músculos. Mast densidad celular fue inversamente correlacionada con el músculo viabilidad en todos los tipos de músculos.

Conclusión

Estos resultados muestran que en el músculo esquelético, IR lesión depende de la presencia de los mastocitos y el tipo de fibra y sugieren que la combinación de terapias preventivas pueden necesitarse para proteger de manera óptima los músculos de la lesión IR.

Antecedentes

Lesión de isquemia reperfusión es un fenómeno generalizado que afecta a todos los tejidos musculares [1, 2]. Es una causa importante de morbilidad después de las lesiones de extremidades especialmente a los vasos sanguíneos con el consiguiente necrosis muscular, la fibrosis y contractura conjunta (Volkmann la contractura). De los músculos involucrados son algunos lento-twitch 'rojo' de fibra de tipo predominantemente diseñados para la contracción isométrica para estabilizar las articulaciones, mientras que la otra rápida twitch 'blanco' de fibra de tipo músculos actuar con rapidez y destreza, como el lumbricals y flexor digitorum profundi. En la pierna la soleus es predominantemente lento-twitch, el extensor digitorum largo (EDL) de rápido twitch y el gastrocnemio se mezcla lenta / rápida twitch tipo de fibra.

Mastocitos fueron implicados en IR lesión del músculo esquelético en los estudios de nuestro laboratorio [3]. Los primeros experimentos en el músculo gastrocnemio, dio lugar a la resistencia a la lesión de IR en los mastocitos agotadas (f W / W f) los ratones [3, 4]. Más recientemente hemos demostrado que la re-engraftment de mastocitos en W f / f W ratones restaura susceptibilidad a la lesión de IR, lo que demuestra que las células desempeñan un papel central en la lesión de IR a músculo esquelético [5]. IR Nuestro modelo de lesiones de los 70 minutos posteriores torniquete isquemia de un miembro seguido de 24 h de reperfusión. A diferencia de otros modelos [6], la ampliación del período de reperfusión permite la plena manifestación de la lesión de reperfusión. Con el fin de determinar la utilidad de las terapias contra las células, es importante conocer el grado en que las células están involucradas en la lesión de IR de otros tipos de fibras del músculo esquelético. En este estudio se han seleccionado los músculos esqueléticos, representante de lento-twitch (soleus), lenta / rápida twitch (gastrocnemio) y de rápido twitch tipos (EDL), y se comparó su susceptibilidad a la lesión IR genotípicamente en cuatro diferentes conjuntos de ratones que puerto Diferentes densidades de los mastocitos en su músculo esquelético. Estos fueron los mastocitos C57/DBA agotadas (f W / W f) los ratones, los heterocigotos (W f / +) y normal littermates (+/+) y control C57BL / 6 ratones.

Métodos
Animales

Mastocitos agotado ratones, f W / W f, (f C57BL/6W × DBA/2W f) F 1; de tipo salvaje littermate, + / +, (C57BL / 6 x DBA / 2) F 1, y heterocigotos littermate, W f / +, (C57BL / 6 × f DBA/2W o C57BL/6W f × DBA / 2) híbridos F 1 se compraron de Flinders Medical Centre (Bedford Park, South Australia) Semana 6-10 años de edad (18-25 g ). Cada genotipo fue claramente identificadas por el color escudo. C57BL / 6 × C57BL / 6 (C57BL / 6) Los animales fueron adquiridos a Centro de Recursos Animales, Perth, Australia Occidental, de 10 años de edad Semana (25-30 g). Un C57BL / 6 cepa ratón grupo se incluyó como un mayor control a la C57/DBA cepa, a prueba de la cepa diferencias en la susceptibilidad a la lesión IR. Esto era importante, ya que los C57BL / 6 es el más comúnmente usado ratón cepa. No hubo diferencias significativas en los datos entre hombres y mujeres por lo que los resultados se agruparon. Los ratones se les dio alimentos y agua ad libitum, y alojados con un 12 h día / noche ciclo. La Ética Animal directrices esbozadas por el Hospital de San Vicente y Nacional de Salud y del Consejo de Investigación Médica se cumplieron en todos los experimentos.

Lesión de isquemia-reperfusión

Los ratones fueron anaesthetized por intraperitoneal (ip) de la inyección de 4% hidrato de cloral (0,1 ml/10 g de peso corporal), seguida de la inyección ip de la carprofeno analgésico para minimizar el dolor postoperatorio. Torniquete isquemia es inducida por la utilización de 2 × tamaño de 8 bandas de caucho que se describió anteriormente [5]. Durante los 70 min de isquemia, una aguja se inserta la sonda termistor subcutánea en la pierna derecha, y la extremidad posterior de temperatura se vigila y mantiene a 36 ± 1 ° C. Después de que el período de isquemia, se eliminaron las bandas y los ratones permitía a recuperarse. Después de 24 h de reperfusión a los ratones se volvieron a anaesthetized y el gastrocnemio, soleus y EDL músculos fueron cuidadosamente removidos y tratados de ambos lados contralateral y pesado, antes de que el ratón se ha sacrificado.

Coincide con la edad (12-24 Semana, 25-35 g) ratones machos y hembras de cada genotipo (W f / f W, W f / +, + / + y C57BL / 6) se agruparon en el mismo sexo, la edad y la tensión Y sometidos a isquemia caliente al mismo tiempo. Un mínimo de cuatro ratones (n = 4) de cada uno de los cuatro genotipos se utilizó.

NBT de ensayo

Nitro Blue Tetrazolium (NBT) ensayo se utilizó para determinar la viabilidad del músculo en su conjunto monturas frescas rebanadas a lo descrito previamente [5]. Ambos lados de cada rebanada de músculo fueron posteriores a la fijada en el 10% de solución salina tamponada formal (BFS) y analizado bajo un microscopio de disección de tejido viable, que se identifica por su color azul reacción producto. El porcentaje de tejido viable en el músculo tratado fue determinado por la técnica de conteo estándar punto [7] y se expresa como un porcentaje de tejido viable en el control contralateral. Por último, la media por ciento del tejido viable de tratamiento versus contralateral músculos se calculó para cada grupo, donde n = número de ratones.

Histología

Para el análisis histológico, la inmersión del músculo rodajas se fija para las 24 h en el 10% BFS, lavada con 0,1 M buffer fosfato salino (PBS) y procesado en parafina. Cinco micras secciones se redujeron, y dewaxed manchadas de Haematoxylin y eosina (H & E) para el análisis general [5].

Mastocitos tinción

Mast selectivamente las células fueron teñidas por el azul de toluidina rutina [8] y chloroacetate esterasa (CAE) métodos [9].

Densidad de los mastocitos

Una visión general del contenido de los mastocitos en los cuatro grupos de ratones de prueba se obtuvo por contar un mínimo de 100 perfiles de los mastocitos en la lengua, la piel y el corazón, así como el músculo esquelético. Uso de 100 X magnificación todos los mastocitos perfiles que caen dentro de una cuadrícula de la zona de 1,35 mm 2, pero que no tenía relación con la mano derecha y la parte inferior de fronteras fueron contados y los datos expresados como mástil células / mm 2. No hubo diferencias en el azul de toluidina o etiquetados CAE mastocitos perfil números comparables en secciones de tejidos (datos no presentados), por lo tanto, la CAE técnica fue posteriormente preferencia al uso de azul de toluidina.

Estadísticas

Los análisis estadísticos se realizaron usando el software SPSS (Paquete de Estadística para las Ciencias Sociales, versión 11.5). Todos los resultados se expresan en los medios ± error estándar de la media (SEM) de los datos agrupados donde n = número de ratones / grupo. Para la comparación entre los grupos, los medios se analizaron mediante análisis univariado de la varianza. La correlación de Pearson fue usado para probar la correlación entre el tejido y la viabilidad mastocitos perfil de los cargos. A nivel de probabilidad de p <0,05 fue adoptado para indicar la significación estadística.

Resultados
Morfológico apariencia de la etiqueta mastocitos

CAE o después de la tinción de azul de toluidina, mastocitos fueron fácilmente distinguirse de otras células, por su color rojo o púrpura manchados citoplásmica gránulos respectivamente. En general, estaban intactos, pero variaron en tamaño, y predominantemente se encuentra cerca de los nervios y vasos sanguíneos, según lo informado por otros [10].

Apariencia histológica del músculo esquelético antes y después de la lesión IR

Antes de la lesión, el aspecto morfológico de las secciones del músculo transverso littermate controles y f W / W f ratones fue similar (ver Figura 1A y 1C]. Como era de esperar, las fibras musculares se nucleadas, intacta y dispuestos en grupos. En las secciones longitudinales (no se muestra), el músculo estrías son claramente evidentes, lo que demuestra viable fibras. Después de la lesión de IR, los músculos de ratones normales littermate (Figura 1B] se infiltraron por numerosas células inflamatorias que se observan a menudo invaden las fibras musculares. Muchas fibras fueron fragmentados y apareció comido la polilla, mientras que otras fibras se condensa y disminuido. A gran aumento (no se muestra), el patrón sarcoméricas no era visible en la mayoría de las fibras y muchas fibras no contienen núcleos. En cambio, una gran proporción de fibras de f W / W f ratones estaban intactos, nucleadas, manchados amorphously y comparables en tamaño a los controles. Sorprendentemente, este tejido también contenía un exudado inflamatorio celular que se concentraba principalmente en el área intersticial (Fig. 1D].

Mastocitos densidad de los distintos órganos

La densidad de las células teñidas CAE varió entre tejidos y entre las cepas de ratón (véase el cuadro 1]. En los mastocitos repleta ratones (C57BL / 6, + / +, W f / +), la lengua y la piel tiene un alto densidad de los mastocitos que van del 31,3 al 49,9 perfiles de los mastocitos / mm 2. Músculo cardíaco tiene una cantidad significativamente menor de las células que van de 0,3 a 2,3 perfiles de los mastocitos / mm 2. En W f / f W ratones, la densidad de los mastocitos fue notablemente reducido tanto en la lengua (1,95 ± 0,42) (Figura 2] y la piel (6,73 ± 3,27). No se observaron mastocitos en W f / f W músculo cardíaco tras el cribado de un gran número de secciones (20 en los campos X 200 de aumento para cada ratón).

Mastocitos densidad de los músculos esqueléticos

El cuadro 2 muestra la densidad de los mastocitos de cada músculo esquelético tipo en cuatro diferentes grupos de ratones. En general, la lenta twitch músculo soleus había casi el doble de la densidad de los mastocitos de la EDL y músculos gastrocnemio (p <0,05). No se mastocitos en la C57/DBA f W / W f músculos esqueléticos como se esperaba. Sin embargo, era el doble de la densidad de las células normales en su comparación con sus heterocigotos littermates, sugiriendo un gen c-kit dosis efecto sobre los mastocitos densidad (p <0,05). Hubo significativamente menos mastocitos en la C57/C57 comparación con C57/DBA littermate ratones control (p <0,05), pero ninguna diferencia en la densidad de los mastocitos C57/C57 comparación con C57/DBA ratones heterocigotos.

Músculo esquelético viabilidad después de IR

De los músculos esqueléticos f W / W f ratones fueron significativamente más resistentes a la torniquete inducida por isquemia caliente / reperfusión lesiones, según la evaluación de NBT ensayo, en comparación con las otras 3 cepas de ratón, independientemente de el tipo de músculo (Fig 3]. En la W f / f W ratones el músculo soleus fue un notable 95% viable después de IR. Con respecto a los tipos muscular, la desaceleración sostenida twitch soleus muscular significativamente menor (P <0,05) en comparación IR perjuicio a la lenta / rápida gastrocnemio y el rápido EDL músculos en cada grupo. El EDL músculos gastrocnemio y mostró un grado similar de las lesiones en todos los grupos.

Correlación entre la densidad de los mastocitos y de viabilidad

Hubo una correlación inversa (factor de correlación de Pearson 0,043) entre la densidad de los mastocitos y de la viabilidad del músculo para cada tipo muscular en ratones C57/DBA.

Ratón cepa susceptibilidad

La viabilidad de los músculos de ratones heterocigotos C57/DBA fue significativamente mayor que la C57/C57 los controles (p <0,05) a pesar de que la densidad de los mastocitos es el mismo.

No hubo diferencias en la viabilidad de los músculos de la C57/C57 controles en comparación con los controles C57/DBA littermate aunque hubo el doble de la densidad de los mastocitos en este último los músculos.

Discusión

En este estudio un torniquete se colocó muy arriba en el muslo para inducir un corto cálido (36 ° C) isquemia de 70 minutos de duración, seguida de un largo período de reperfusión de 24 h, con el fin de evaluar el impacto de la lesión de reperfusión en diferentes músculos esqueléticos Y el grado en que las células mediar esta lesión. Esto difiere de otros estudios donde se extendió la isquemia y reperfusión a corto plazo se utilizan para estudiar los primeros efectos de la isquemia sobre el músculo esquelético. Con este enfoque, nos muestran que las células contribuir a la lesión de la isquemia reperfusión rápida, lenta y mixta fast/slow--twitch muscular tipos. La viabilidad de estos músculos se correlaciona inversamente con la densidad de los mastocitos y de todos los músculos mostraron una notable resistencia a la lesión de IR en los mastocitos agotado ratones. En ausencia de los mastocitos, la desaceleración de twitch predominantemente oxidativo soleus músculo es más resistente a la IR que el rápido / lento-twitch gastrocnemio y el rápido twitch EDL músculos. También demuestran que el tipo de fibra muscular, y el ratón cepa independiente, determina la susceptibilidad a la lesión IR.

La susceptibilidad de los diferentes tipos de músculo esquelético es la hipótesis de que la isquemia se refieren a su disposición diferentes metabólico, pero los datos acerca de este conflicto es. En músculos esqueléticos de ratones se componen de dos distintos tipos de fibras. En general, de lento twitch fibras tienen una alta actividad enzimática oxidativa, de alta densidad capilar y aumento del número de mitocondrias, en contraste rápido twitch fibras de alta actividad de la enzima glicolítica, la baja densidad capilar y pocas mitocondrias. Se ha sugerido que el rápido twitch músculos mostrar una mayor resistencia a la isquemia-twitch lento que los músculos a causa de su mayor potencial para mantener los niveles de ATP durante la isquemia [11]. Como alternativa, se ha propuesto que la mayor acumulación de metabolitos anaerobios durante la isquemia en el rápido twitch fibras, en comparación con la desaceleración twitch fibras, dan lugar a los radicales libres de oxígeno durante la reperfusión que los hace más susceptibles a lesiones. En nuestro estudio, la mayor parte de lento twitch músculo soleus fue consistentemente más resistentes a las lesiones de la IR slow/fast- y de rápido twitch músculos. Los datos procedentes de otros estudios son difíciles de comparar debido a la gran variedad de modelos en el uso de infrarrojos. En particular, hay una gran cantidad de variación en el periodo de isquemia, la temperatura muscular durante la isquemia y la reperfusión del período permitido para la manifestación de la lesión de reperfusión. Idstrom [12] utiliza un periodo de 2, 4 y 6 h en frío a 25 º C posterior isquemia de un miembro en ratas y una hora de reperfusión para medir los daños y la recuperación de los nucleótidos adenina. De acuerdo con nuestros datos, el orador puso de manifiesto que el rápido twitch tibialis músculos mostraron una tasa de degradación más rápida y más lenta la recuperación de estas moléculas que la desaceleración twitch soleus. Esto se atribuyó a las diferencias en la regulación de las enzimas durante la isquemia y las diferencias en el flujo sanguíneo durante la reperfusión. Woitaske et al. [13] utiliza 3 h isquemia de las extremidades traseras a un desconocido temperatura y hasta 14 días de reperfusión en ratones. El menor herido fue soleus y recuperó la función y masa más rápidamente que el músculo EDL en este período. En contraste con nuestros datos, otros grupos [6] han demostrado que después de un largo tiempo de isquemia 3 h y una breve reperfusión (2 h) de rápido twitch músculos son más resistentes a la lesión más lento-twitch músculos. Otros trabajadores afirman que la variable resultados. Rácz et al. [14] puso de manifiesto que la lentitud de los músculos twitch fueron más gravemente dañada después de 1 hora de isquemia sin embargo, el rápido twitch muscular fue más dañada después de 2 h. Sternbergh [15] utilizado un modelo in vitro de 120 min y 55 min de isquemia reperfusión a 37 ° C en las extremidades traseras de ratas. El lento-twitch soleus y de rápido twitch plantaris mostró similares grados de lesión mientras que el rápido twitch tibialis se ileso. Él llegó a la conclusión de que el tipo de fibra muscular no predecir lesiones. En el estudio de Carvalho [11] el rápido twitch muscular fue en mejores condiciones de contrato, durante los primeros 45-60 minutos de la isquemia pero ambos rápida y lenta-twitch músculos contratado a la igualdad de grados de entonces.

Recientemente hemos demostrado de manera concluyente que las células desempeñan un papel central en la lesión de IR murino soleus, EDL y músculos gastrocnemio [5]. F W / W f IR ratones resistentes fueron arraigado con médula ósea procedentes mastocitos (BMMC) de su littermates normal, y sus extremidades traseras sufrió lesiones IR 12 semanas después. La proporción de fibras en el músculo viable arraigado ratones se redujo significativamente, de nuevo a los niveles observados en sus IR susceptibles littermates. Así, de engraftment BMMC f en W / W f ratones restaura la sensibilidad de los músculos esqueléticos a IR lesión, independientemente de las demás anormalidades en estos ratones. El papel de los mastocitos no se ha considerado al investigar la susceptibilidad de los diferentes tipos de fibras musculares.

En el actual estudio, la densidad de los mastocitos fue inversamente correlacionada con la supervivencia de todos los tipos de músculo. En los cuatro cepas examinadas, los músculos de la f W / W f ratones tuvieron una mayor viabilidad. En particular, el músculo soleus viabilidad fue del 95% en los mastocitos agotado ratones que indica que una gran cantidad de lesiones fue mediada por mastocitos. El músculo gastrocnemio y EDL viabilidad fue de 76% y 65%, respectivamente, en la ausencia de los mastocitos, lo que indica que otros factores, posiblemente relacionadas con el tipo en el músculo contribuyen a la lesión IR. La demostración de que los músculos de la C57/C57 y C57/DBA cepas de ratones se ven afectados por igual por IR, aunque éste figura dos veces la densidad de los mastocitos, indican que también hay un componente genético a la lesión IR.

Nuestros datos apoyan la hipótesis de que existe una línea de base a nivel de susceptibilidad a la isquemia inducida por la lesión que se puede atribuir a la cepa del ratón y el tipo de fibra muscular. Mastocitos independiente exacerbar IR lesiones clínicamente relevante durante un ampliado reperfusión. Estos resultados predicen que los mastocitos terapias sería beneficioso muscular a través de los diferentes tipos de protección y que además puede adaptarse a los tipos específicos de los músculos. Es evidente que los mastocitos son los ratones agotado modelo deseable para estudiar los efectos de la IR en el tipo de fibra muscular. Alternativamente, la soleus es el músculo más adecuado para estudiar la función de los mastocitos, ya que tiene el menor tipo de fibra componente efecto.

Abreviaturas

BFS, solución salina tamponada formal; CAE, chlororacetate esterasa; EDL, extensor digitorum largo; IR, la isquemia reperfusión; NBT, nitro azul tetrazolio; NOS II, óxido nítrico sintasa II; f W / W f, mastocitos agotado ratones; W / W V, mastocitos ratones deficientes.

Contribuciones de los autores

SKB realizó la experimentación con animales, estudios de viabilidad muscular, la densidad de los mastocitos y de redactar el manuscrito original. WAM participado en el diseño del estudio. AM participó en el diseño del estudio y análisis morfológico realizado. Todos los autores siempre aportación intelectual, participó en la preparación del manuscrito y han aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Sra Xiao Lian-Han de expertos para la asistencia técnica y la Sra Wang Wei por su ayuda en los análisis estadísticos. También queremos dar las gracias a Asoc. Prof Prue Hart y su grupo lo que nos permite establecer nuestro propio mastocitos agotado ratón colonia. Esta labor fue apoyada por el Consejo Nacional de Salud e Investigaciones Médicas.