Journal of Inflammation (London, England), 2004; 1: 4-4 (más artículos en esta revista)

Eficiencia en la prestación de pequeños ARN de interferencia inhibición de la expresión de IL-12p40 in vivo

BioMed Central
A Marion Flynn (marion.a.flynn @ may.ie) [1], David G Casey (Dcasey@fsl.gov.ie) [1], Stephen M Todryk (stephen.todryk @ clínica-medicine.oxford.ac. Uk) [1], Bernard P Mahon (bpmahon@may.ie) [1]
[1] Instituto de Inmunología de la Universidad Nacional de Irlanda, Maynooth, Co Kildare, Irlanda

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Resumen
Antecedentes

La interferencia por ARN es un evolutivo conservadas mecanismo de respuesta inmune que puede ser utilizado como una herramienta para ofrecer nuevos conocimientos sobre la función de genes y estructura. La capacidad de suministrar los pequeños RNA de interferencia para modular la expresión génica in vivo pueden proporcionar nuevos enfoques terapéuticos para enfermedades actualmente intratables.

Métodos

In vitro, la orientación ARNsi IL-12p40 se entregó a la línea de células murinas macrófagos (J774A.1) encapsulado en un liposoma con un IL-12 que induce agente (LPS/IFN- γ), en un número de puntos temporales. Los controles incluyen una variedad de las especies no ARNsi reactivos específicos. Sobrenadantes fueron analizados para la producción de citoquinas de las células mientras que se retiraron de mRNA de perfiles.

In vivo, la orientación ARNsi IL-12p40 se entregó a la cavidad peritoneal murino en una terapéutica de moda, después de endotoxina (LPS) desafío. Las células de la cavidad peritoneal fueron eliminadas por el lavado y analizadas por citometría de flujo. Los niveles de IL-12 en el lavado y en el suero, fueron también examinadas por ELISA.

Resultados

En este informe, muestran que la IL-12p40 ARNsi pueden específicamente silencio macrófagos expresión de mRNA de IL-12p40 e IL-12p70 proteína in vitro. Hacemos extensivo este resultado para demostrar que la entrega de encapsulados en liposomas ARNsi orientación IL-12p40 murinos a la cavidad peritoneal puede modular estímulo inflamatorio in vivo. Además, ARNsi específicos pueden ser utilizados terapéuticamente después de endotoxina reto de reducir tanto la local y la respuesta inflamatoria sistémica. Así, la entrega de ARNsi pueden usarse para producir específica no permanente inhibición de la expresión de la proteína endógena.

Conclusión

In vitro silenciamiento de la IL-12p40 utilizando ARNsi en determinadas dosis conduce a desmontables específicos de la IL-12p70 producción de proteínas sin inducir a los interferones tipo I. Además, la orientación ARNsi murino IL-12p40 se puede usar terapéuticamente para contrarrestar una respuesta inflamatoria in vivo.

Antecedentes

RNA de interferencia (RNAi) es una secuencia evolutiva conservados específicos de silenciamiento de ARN encontró como un mecanismo de lucha contra la respuesta viral en los invertebrados, plantas y células de mamíferos [1]. Aunque el mecanismo de silenciamiento no es totalmente conocido, la premisa básica de RNAi descansa en la capacidad de la doble varados RNA (dsRNA) específicamente para degradar homóloga ARN mensajero (ARNm). El RNAi vía se activa en células de mamíferos por la presencia de dsRNA o en la presencia de corto 19-22nt dsRNA denomina fragmentos de moléculas pequeñas de ARN interferentes (ARNsi). ARNsi activar un moléculas de ARN inducida por silenciar complejo (RISC) que relaja el ARNsi duplex [2]. La especificidad de locus degradación se guía por el antisentido capítulo de la unwound ARNsi, seguido de capítulo ARNsi sentido vinculante a los complementos de mRNA sitio de división por RISC. La división de la línea ARNsi sentido y objetivo mRNA resultados en la auto-producción de nuevas amplificar ARNsi intermediarios que siguen objetivo degradación de mRNA en una forma dependiente de ATP [3, 4]. Este fenómeno significa que las dosis bajas de ARNsi puede ser más eficaz que la terapia antisentido. Además, este método es preferible a la genética y las terapias antisentido, en el que se ARNsi no hereditarios y no requiere adenoviral vectores, que limitan la eficacia y aceptabilidad para uso en niños.

RNAi puede ser aprovechado como una herramienta para ofrecer nuevos conocimientos sobre la función de genes y estructura. La capacidad de suministrar los ARNsi para modular la expresión génica in vivo pueden proporcionar nuevos enfoques terapéuticos para enfermedades actualmente intratables. Al igual que otras nuevas tecnologías genéticas, ARNsi gen de supresión se enfrenta a varias limitaciones metodológicas in vivo. Entre ellas están la eficiencia en la prestación de ARNsi a las células diana [5, 6], no putativo de los efectos específicos de control duplexes [7 - 9] y el potencial Terapéutico de los problemas virales vectores de expresión [10]. Un camino para superar estos obstáculos es entregar no hereditarios ARNsi duplex en un modelo y sistema de seguimiento de la influencia en la inflamación inducida experimentalmente. Este enfoque constituiría un método que permite la detección rápida de lo que se han denominado "druggable" objetivos [11].

La interleucina-12 (IL-12p70) es una citoquina con un bien caracterizado función pro-inflamatorias [12] que se ha señalado como un objetivo de intervención terapéutica [13 - 15]. Bioactivos IL-12p70 es un heterodimer formado por una cadena pesada (p40) y una cadena de luz subunidad (p35), codificadas por dos genes cuya expresión está reglamentado de manera independiente en el nivel transcripcional [16]. La subunidad p35 es constitutivamente expresada en niveles bajos en la mayoría de tipos de células, pero es hasta reguladas en la activación de células. En contraste, el gen IL-12p40 se encuentra bajo estricto control transcripcional sólo se expresa en los macrófagos y otras APC después de la activación de productos microbianos [17]. La producción de IL-12p70 se ve reforzada por el IFN-γ IFN consenso a través de la secuencia de la proteína de unión [18], sino por la reducción de la IL-10 [19].

IL-12p70 tiene efectos pleiotrópicos sobre las células diana, pero la función principal es como citoquinas pro-inflamatorias en contra de la inmunidad mediada por células microbianas insulto. En particular, la IL-12p70 actúa sobre las células NK T y al aumento de producción de citoquinas, proliferación, y la citotoxicidad, las funciones que se hacen evidentes varias horas después de la exposición a infecciones de agentes [19]. El IFN-γ producido posteriormente, potencia la presentación antigénica funciones importantes en la limpieza de agentes infecciosos. Estas funciones incluyen el aumento de co-molécula estimulante de expresión, de la fagocitosis, y la producción de oxígeno y nitrógeno reactivo intermedias [19, 20]. Sin embargo, la IL-12p70 de protección no siempre es beneficiosa o, de hecho, una variedad de condiciones patológicas, incluyendo sepsis, se asocian con la IL-12 impulsado por la patología [21, 22]. Además de la bien caracterizada papel de la IL-12p70, ahora se sabe que la subunidad IL-12p40 también es biológicamente activo. Esta subunidad puede actuar para antagonizar la función heterodimer [23], o pueden tener un papel directo más amplio, menos dependiente de la IL-12p70 [24, 25].

Con el fin de explorar la viabilidad de la terapéutica interferencia por ARN, hemos utilizado específicamente a la ablación ARNsi IL-12p40 expresión in vitro e in vivo. Este enfoque extiende el poder de interferencia de ARN para la expresión de genes en estudios de animales vivos sin el uso de la ingeniería genética, el ADN plásmido reportero sistemas [2, 26] retrovirales [27, 28] o lentiviral ARNsi vectores de expresión [29] y abre el camino para Explorar el uso de ARNsi en humanos para el tratamiento de la enfermedad. Nuestros resultados ofrecen una descripción de ARNsi mediada la represión de un gen endógeno inmune in vivo y describir un nuevo enfoque de investigación y terapéuticos de la inhibición de genes específicos de un importante celular y respuesta inmunológica.

Materiales y Métodos
Ratones y líneas celulares

Mujeres ratones BALB / c (Harlan Limited, Bicester, Reino Unido) y la IL-12p40-gen interrumpido ratones (IL12p40 - / -) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) se mantuvieron bajo las directrices del Departamento de Salud de Irlanda y el local Comité de bioética. Todos los ratones fueron 12-14 semanas de edad en el inicio de los experimentos y sacrificado en la terminación. La línea de células murinas macrófagos (J774A.1) se utilizó para investigar el silenciamiento de las citocinas IL-12p40 la expresión de los genes.

Preparación de ARNsi

ARNsi oligonucleótidos con el siguiente sentido y antisentido secuencias fueron diseñados desde el repositorio GenBank: número; NM_008352, Mus musculus interleucina 12 ter (IL12b), ARNm. IL-12p40 ARNsi 5'-C CUC CAC UGU CCU dTdT GAC ACG-3 '(sentido) y 3'-GAG G dTdT UGG ACA GGA CUG UGC-5' (antisentido); Mutant ARNsi 5'-C CUC CAC GAC UUC CCU dTdT ACG-3 '(sentido) y 3'-UGG dTdTG GAG AAG GGA CUG UGC-5' (antisentido); GFPsiRNA 5'-GGC UAC GUC CAG GAG dTdT CGC CAC-3 '(sentido) y 3'-dTdT AGO CCG CAG GUC CUC GCM UGG-5 '(antisentido). El antisentido de la IL-12p40 ARNsi duplex (As.RNA) también se utilizó como control para experimentos in vivo. Cada capítulo fue complementaria de ARN deprotected de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para la producción de la IL-12p40 ARNsi duplex, sentido y antisentido ARNsi ramas se mezclan en proporciones equimolar y tratados por calor a 95 ° C durante 1 min seguido de recocido a 37 ° C durante 1 h, y permite enfriar lentamente la noche a la mañana a la oficina Temperatura. Todos los ARNsi oligonucleótidos fueron sintetizados comercialmente (Dharmacon, Lafayette, CO) utilizando 2'ACE protección química.

In vitro ARNsi injerencia

Semi-confluente J774A.1 células fueron cultivadas en el 1 × 10 5 células / ml en antibiótico libre, el 8% (v / v) de endotoxina-fetal baja RPMI-suero de ternera (Gibco-Invitrogen, Paisley, UK), que contiene L-glutamina ( Sigma, Poole, Reino Unido) 12-16 h antes de transfección. Por ARNsi transfections 3 μ l de un 20 μ M ARNsi duplex (objetivo o control) solución se mezcla con 47 μ l de Opti-mem (Gibco-Invitrogen). En un segundo tubo de 3 μ l de oligofectamine (Gibco-Invitrogen) se mezcla con 12 μ l de Opti-mem y incubados a temperatura ambiente durante 15 min. Soluciones se combinaron para 40 min y llevados a un volumen final de 100 μ l. La expresión de mRNA de IL-12p40 e IL-12p70 proteína fue inducida por la adición de 1 μ g / ml E. LPS coli serotipo 0111: B4 (Sigma) y 10 ng / ml rIFN-γ (Pharmingen, San Diego, CA.), De los últimos 12 h de cada cultura post ARNsi transfección.

ARN aislamiento y semi-cuantitativos de RT-PCR (sqRT-PCR)

Total RNA celular J774A.1 fue aislado de las células de experimentos in vitro con el reactivo TRIZOL (Gibco-Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante y cuantificados por espectrofotometría. ARN transcrito fue inversa, y 100 ng de ADN complementario producto amplificado por PCR a lo descrito previamente [51] utilizando el 60 ng de genes específicos de los primers río arriba y río abajo. Murino β-actina producto se utilizó para normalizar las muestras de RNA. Condiciones de PCR incluyó una pre-incubación a 95 ° C durante 5 min seguido de 35 ciclos de amplificación (95 ° C, 1 min, 1 min a temperatura, 2 min a 72 ° C, y un final de 10 min a 72 ° C) . Aguas arriba y aguas abajo primers para IL-12p40 han sido específicamente diseñado para el flanco IL-12p40 ARNsi región de orientación; sentido, 5'-AAACAGTGAACCTCACCTGTGACAC-3 '; antisentido, 5'-TTCATCAGCAAGTTCTTGGGCG-3'. Productos de la PCR se visualizaron por UV iluminado electroforesis en gel de agarosa.

In vivo ARNsi injerencia

Control de ratones (BALB / c & IL12p40 - / -) recibió 200 μ l Opti-mem intra-peritoneal (ip), que contiene oligofectamine solo. Además LPS control positivo ratones recibió 1 μ g E. Coli LPS. Para cada administración experimental, 10 μ l ARNsi dúplex (IL-12p40 o controles en la concentración equimolar) fueron premezclado con 40 μ l de Opti-mem. Por separado, el 6 de μ l de oligofectamine se mezcla con 24 μ l de Opti-mem y incubados a temperatura ambiente durante 15 min. Estas soluciones se mezclan a temperatura ambiente durante 40 min. Para co-inyección de experimentos, estos se combinaron con LPS (1 μ g / ratón) y formulado como anteriormente. Para silenciar terapéutica, los ratones recibieron 1 μ g LPS, en la ausencia de ARNsi duplex, 1 h antes de la administración del ARNsi (IL-12p40 o controles) que el anterior. A varios tiempos, la sangre, las células o el lavado peritoneal se tomaron muestras de líquido para su ulterior análisis.

Peritoneal Lavage y preparación de suero

Peritoneal células fueron cosechadas por lavado de la cavidad peritoneal con 1 ml de PBS estéril. Esto fue centrifugada 5 min a 400 g, lavado sobrenadante fue retirado para su análisis y las células analizadas por citometría de flujo. Suero fue preparado por punción cardiaca. Sueros y lavado sobrenadantes se analizaron sin demora o el almacenamiento.

Citometría de Flujo

Análisis fenotípico de las células ARNsi transfección se realizó con un FACScalibur ™ con software asociado Cellquest ™ (Becton Dickinson, San Jose, CA). Adelante secundarios y se midió la dispersión de lavado peritoneal preparativos a los 12, 24 y 48 h en respuesta a la entrega simultánea de IL-12p40 ARNsi y LPS, y a las 24 h para los ratones que recibieron terapéutica IL-12p40 ARNsi post LPS administración. Superficie celular marcador análisis de CD11b, CD14, CD40, CD80, CD86, F4/80 y MHC clase II por J774A.1 células se realizó según lo descrito anteriormente [52], el control de muestras incluidas las células incubadas con isotipo corresponde, directamente conjugados, el control de anticuerpos Según corresponda.

Análisis de la producción de citoquinas

La producción de citocinas de los experimentos in vitro fue ensayada mediante inmunoensayos disponibles en el comercio para ratón IL-12p70, IFN-γ, IFN-β, IL-10, e IL-4 (Pharmingen). Mouse IL-12p40 en la sangre y el líquido de lavado peritoneal fue ensayada mediante murino IL-12p40 ELISA (R & D de sistemas, Abingdon, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis estadístico

Utilizó un modelo lineal se utilizó para determinar la importancia de la producción de citoquinas entre los grupos; después de la prueba no se realizaron los análisis. El estudiante t de los ensayos se utilizó para determinar la importancia de diferentes intensidades fluorescentes obtenidos por citometría de flujo.

Resultados
IL-12 p40 ARNsi derriba expresión de IL-12 in vitro

Para investigar el silenciamiento de la expresión génica de citocinas in vitro, los macrófagos de murino como línea celular se J774A.1 transfectadas transitoriamente con la orientación ARNsi IL-12p40, por el momento, los puntos se muestra en la Fig. 1 (24, 48, 72 h). Estas células fueron estimuladas por la final 12 h de cada experimento, con LPS e IFN-γ (LPS/IFN- γ), un protocolo que induce IL-12p70 [30]. Transfección con IL-12p40 ARNsi dado lugar a una importante represión de mRNA p40 y la consiguiente pérdida de la IL-12p70 detectables en el sobrenadante de cultivo celular (Fig. 1A, 1B, 1C]. Una reducción de la IL-12p40 ARNm se observó a las 24 h, pero fue más pronunciada silenciar a las 48 h. Transfección durante 72 h con la IL-12p40 ARNsi fue inferior a 24 o bien 48 horas, como la IL-12p40 mRNA expresión IL-12p70 y la síntesis de proteínas comenzó a recuperarse en este momento (Fig. 1A y 1C]. Así ARNsi silenciamiento se transitorios en este sistema. Control ARNsi transfections incluido ARNsi de la IL-12p40 sin transfección agente (desnudo ARNsi), ARNsi de la IL-12p40 en la 10 ª y 11 ª bases se invirtió (mutante ARNsi), y la orientación ARNsi GFP, una proteína que no se producen en forma natural J774A.1 células. Estos siRNAs control no indujo IL-12p40 expresión mRNA (Fig. 1B]. Nuestros resultados muestran la secuencia específica de ARNsi mediada por la inhibición de la IL-12p40 mRNA síntesis in vitro a las 48 h de incubación ARNsi posterior (Fig. 1A]. ELISA confirmó el ARNsi mediada por silenciamiento de la IL-12p70 la expresión de la proteína (Fig. 1C], que refleja el considerable inhibición de la IL-12p40 la síntesis de ARNm (p <0,001, en comparación con el grupo LPS/IFN- γ). No sobrenadantes de las células, o las células incubadas con el control de siRNAs, no mostró IL-12p70 la producción de proteínas. Represión de la IL-12p70 fue transitoria, con la recuperación de los niveles en el tiempo restante de puntos. ARNm de perfiles de expresión de citoquinas inflamatorias, el IFN-β, IL-12p35, IL-23p19, IL-6, IL-10 e IFN-γ en IL-12p40 o controlar las células silenciado, no mostró no específicos ARNsi silenciar a las dosis empleadas (Tabla 1]. Control ARNsi emitido por el mismo protocolo no indujo mRNA para IFN-β, IL-12p35, IL-23p19, IL-6, IL-10 e IFN-γ. Del mismo modo, las células transfectadas con IL-12p40 ARNsi no mostró modulación de los niveles de proteína de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, y TNF-α (resultados no presentados). Uno de citoquinas no siguió este patrón. Aunque IL-12p40 ARNsi transfección de los macrófagos estimulados no dar lugar a una reducción detectable de IFN-γ mRNA (Cuadro 1 y Fig. 2A], una reducción detectable de IFN-γ proteína se observó (Figura 2B]. Esta discrepancia entre el IFN-γ mRNA y de la detección de proteínas puede reflejar el papel de la IL-12p40 en la regulación post-transcripcional de la secreción de IFN-γ [31] y está en consonancia con el calendario de IFN-γ la síntesis de proteínas y previamente observados en la secreción de LPS impugnada IL-12p40 - / - ratones in vivo [32].

Silenciamiento de IL-12p40 reduce LPS/IFN- γ impulsado la activación de macrófagos in vitro

Para determinar si el silenciamiento IL-12p40 había efectos más amplios sobre los macrófagos, la expresión de la activación / co-estimuladora marcadores CD40, CD80, CD86, MHC clase II y fue examinado después de la exposición simultánea de las células J774 a LPS/IFN- γ y el control, ya sea O IL-12p40-específicas ARNsi. La expresión de CD14, un componente de la maquinaria LPS reconocimiento también fue examinado. LPS/IFN- γ estimulación solos (24 h) produjo un aumento de CD40, CD86 y la expresión de MHC clase II (Tabla 2], pero no tuvo ningún efecto sobre CD80 o CD14 como se esperaba. IL-12p40-específicas ARNsi no activar macrófagos en la ausencia de LPS/IFN- γ (Tabla 2]. En presencia de LPS/IFN- γ, IL-ARNsi orientación 12p40 impedido incremento en la expresión de CD40 y CD86, lo que sugiere que silenciar IL-12 interfiere con la activación de macrófagos. La expresión de CD80, CD14 y CMH clase II no fueron afectadas (Tabla 2]. En cambio, Mut.siRNA no impide que las células CD86 upregulation cuando fueron estimulados con LPS/IFN- γ, sino más bien como consecuencia un aumento de expresión, lo que sugiere que esta secuencia puede contribuir a la activación de los macrófagos no visto con IL-12p40 específicas ARNsi. La expresión fenotípica de los macrófagos y los marcadores CD11b se F4/80 sin cambios en todos los experimentos, no se observaron diferencias significativas en los niveles de apoptosis entre los grupos (datos no presentados).

ARNsi orientación IL-12p40 LPS impulsado específicamente reduce la inflamación in vivo

Hemos investigado la posibilidad de silenciar la IL-12 por la interferencia de ARN in vivo, utilizando una bien establecida modelo murino de inflamación peritoneal impulsada LPS [33, 34]. La entrega de LPS ip dado lugar a un aumento activado ataque de las células fagocíticas detectables a los 12, 24 y 48 h de lavado, en comparación con los controles (Fig. 3A grupos de I & II). Este efecto se redujo en IL-12p40 - / - ratones. Simultánea entrega de un control irrelevante ARNsi (GFPsiRNA) o un mutante IL-12p40 ARNsi (Mut.siRNA) dúplex que contiene dos desajustes a la IL-12p40 secuencia específica no tiene influencia en LPS impulsado por la inflamación. Asimismo, un control que fue el ARNsi antisentido funcional de los duplex (As.siRNA) no produjo una reducción significativa en el nivel de ataque de las células fagocíticas activadas. Sin embargo, la entrega de IL-12p40 ARNsi reducido drásticamente los niveles de inflamación (Fig. 3A] a los 12, 24 y 48 h. Entrega de encapsulado ARNsi no dio lugar a un aumento en la muerte celular de las células peritoneales (apoptosis o necrosis), en comparación con los controles en los puntos de tiempo seleccionado (datos no presentados).

Control wildtype e IL-12p40 - / - ratones no mostraron respuesta inflamatoria a los reactivos de transfección ARNsi sola (Fig. 3]. LPS impugnada wildtype ratones, ratones y co-El reto del control siRNAs muestran una típica respuesta de las células inflamatorias en la cavidad peritoneal con el aumento del número de células fagocíticas activado, a las 24 h (19,8%, 16,8%, 22,01%) y 48 h (22,53% , 17,95% 16,64%) en comparación con el control sin ratones (2,17% y 3,46%). Resultados similares fueron observados en ratones co-desafió con LPS y As.siRNA a las 24 y 48 h (18,9% y 23,64% respectivamente). Sin embargo, los ratones co-administra LPS y específicos IL-12p40 ARNsi mostradas reducido número de células activado (6,3%), reflejando la reducción de la respuesta inflamatoria en LPS visto desafiado IL-12p40 - / - ratones (7,3%) a las 24 h. Sin embargo, la modulación de la respuesta inflamatoria en el LPS-IL-12p40 ARNsi impugnada ratones no permanentes. Un aumento activado ataque de las células fagocíticas (11,10%), se observó a las 48 h, aunque los niveles siguen siendo inferiores a la LPS impugnada ratones BALB / c (22,53%), (Fig. 3A y 3C]. Así, ARNsi mediada por silenciamiento de la IL-12p40 mRNA en este modelo tiene una importante, pero no permanentes efecto en la capacidad de mediar una respuesta al desafío LPS in vivo.

ARNsi orientación de las citoquinas proinflamatorias IL-12p40 se puede utilizar como una intervención terapéutica contra la inflamación impulsado por los productos microbianos

Con el fin de explorar la posibilidad de utilizar a los ARNsi en un contexto más terapéutica y sobre la base de las conclusiones anteriores, hemos entregado IL-12p40 ARNsi por inyección directa en la cavidad peritoneal, 1 h post LPS desafío. La administración de IL-12p40 ARNsi puesto desafío LPS (Fig. 3B I-VI), dio lugar a una disminución en el número de células fagocíticas activado, (4,22%) a las 24 h, en comparación con los ratones que recibieron sólo LPS (16,64%), el control SiRNAs (Mut.siRNA y GFPsiRNA) o As.siRNA, (25,03%, 17,07% y 12,63% respectivamente). Estos datos demuestran que la IL-12p40 ARNsi se puede utilizar terapéuticamente a silencio específicamente una citoquina impulsada respuesta inflamatoria in vivo, de ser entregado a su debido momento.

En experimentos paralelos, los efectos locales y sistémicos de ARNsi mediada por silenciamiento se evaluaron. IL-12p40 ARNsi emitido co-administrado con LPS o post LPS insulto, a la vez locales y sistémicos efectos antiinflamatorios (Fig. 4]. Control de ratones BALB / c dado ARNsi transfección reactivos sola, mostraron bajos niveles de IL-12p40 la expresión de la proteína en la sangre y muestras de lavado peritoneal (103 pg / ml y 75 pg / ml, respectivamente). Sin embargo, los ratones con LPS impugnada, o co-desafió con LPS y control siRNAs (GFPsiRNA, Mut.siRNA) (Fig. 4] mostró un aumento significativo de IL-12p40 proteína detectada en el suero y lavado tanto en comparación con el control (p <0,05 ). As.siRNA hizo entrega de una reducción de suero de IL-12p40 proteínas, pero sólo cuando se administra por razones terapéuticas (fig. 4B]. Sorprendentemente, la entrega de IL-12p40 ARNsi entregado a la simultánea, o 1 h post LPS administración, se tradujo en una reducción significativa en los niveles de IL-12p40 detectó proteína de suero en todas las muestras y lavado peritoneal en comparación con LPS sola (p <0,05, En cada caso) (Fig. 4]. Entrega de control negativo siRNAs no mostraron esa reducción. Nuestros hallazgos demuestran que el bien diseñado secuencia específica ARNsi puede proporcionar un importante efecto terapéutico y obtener locales y la protección contra la inflamación sistémica.

Discusión

La capacidad de suministrar los pequeños RNA de interferencia para modular la expresión génica in vivo pueden proporcionar nuevos enfoques terapéuticos para enfermedades actualmente intratables. Inicialmente in vitro demuestran que la IL-12p40 ARNsi específicamente silenciada su homólogo ARNm para silenciar transitoria de la proteína IL-12p40 y la consiguiente desmontables de IL-12p70 expresión. Este enfoque no se meta otras citoquinas proinflamatorias (IL-6, IL-23, IL-10, TNF-α), de ARN inducida por silenciamiento génico, ni control ARNsi inducir estas citoquinas o interferón tipo I en las concentraciones empleadas. Además, demuestran que este enfoque puede ampliarse in vivo demostrando que el silenciamiento de la IL-12p40 resultados en el no permanente represión de la IL-12 en un modelo murino de inflamación peritoneal. Tal silenciamiento es evidente en la reducción de los niveles de IL-12 a nivel local detectables en lavado peritoneal y sistémicamente en la sangre. Por último, ARNsi demostrar que se puede usar terapéuticamente después de la apertura de una respuesta inflamatoria a desmontables IL-12 y la expresión para reducir la observó infiltrado inflamatorio visto en este modelo.

IL-12 es un factor clave en la temprana respuesta inflamatoria y en el posterior desarrollo de las respuestas de tipo 1 [35]. Una variedad de señales pueden estimular macrófagos resulta en una mayor superficie expresión de CD40 y el CD86 miembro de la familia B7, así como la activación de la célula del mecanismo de los antimicrobianos [20, 36]. En este sentido, ponen de manifiesto que el silenciamiento de la IL-12p40 interfiere con la activación mediada por la endotoxina, medida por CD40 y CD86 expresión, similar a la observada en la IL-12p40 - / - ratones en el que los macrófagos adoptar el denominado M2 perfil [37]. En conjunto, estos datos apoyan la hipótesis de que la IL-12p40 tiene un papel central en la conducción de polarización de los macrófagos, y la regulación de la intrínseca capacidad de responder a la injuria inmunológica [30, 37]. La polarización de CD4 + células T hacia la producción de citoquinas tipo 1 o tipo 2 después de las respuestas inmunológicas insulto es controlado por una serie de factores, incluyendo la naturaleza de la inmunógeno, la vía de la inmunización, la APC y el entorno reglamentario de citoquinas en el lugar de Estimulación de células T [38, 39]. IL-12 induce la secreción de IFN-γ por NK CD4 + y células T, la promoción del desarrollo y la diferenciación de las células Th1 de Th0 precursores [40, 41]. Th1 células desempeñan un papel importante en la resolución de las infecciones por organismos intracelulares, IL-12 influye en el curso de la bacteriana, viral, parasitaria y de las infecciones al alterar el equilibrio de las células Th1 y Th2 en favor de la producción de IFN-γ [42, 43] . La capacidad de silencio transitoriamente IL-12 puede ser una útil herramienta de investigación para diseccionar el desarrollo de la respuesta inmune polarizada en una variedad de enfermedades infecciosas.

Aunque IL-12p40 como un componente de la IL-12p70 se sabe que tienen un papel directo en la activación de los macrófagos [36, 44], recientemente ha quedado claro que la IL-12p40 tiene un papel independiente de la heterodimer [24]. IL-12p40 actúa como un antagonista de la IL-12p70 función [23], pero tiene también una incidencia directa efector función [25, 45]. En particular, la IL-12p40 juega un papel en los macrófagos, pero no de Nagorno-Karabaj o el reclutamiento de células T inflamatorias y quimiotaxis a los sitios [25, 45]. El silenciamiento de la IL-12p40, y la posterior disminución de la inflamación visto en vivo durante el presente estudio apoya un papel más amplio para IL-12p40 en el reclutamiento de macrófagos a los sitios de la inflamación inducida por estímulos microbianos. Silenciamiento de IL-12p40 in vitro en que no se haya silenciando no específicos de la IL-12p35, IL-23p19, IL-10, TNF-α, IL-6 o IFN-γ mRNA. Sin embargo, el silenciamiento de la IL-12p40 por ARNsi hizo lugar a una reducción de la producción de IFN-γ detectados por ELISA. Reglamento de la producción de IFN-γ por los macrófagos no se ha estudiado de forma exhaustiva, sin embargo se ha demostrado que en algunos tipos de células IL-12 promueve la localización nuclear de IFN-γ mRNA y post-transcripcional ejerce el control de la secreción de IFN-γ [31]. Nuestras observaciones son consistentes con este hallazgo y sugieren que la IL-12 puede ejercer el control post-transcripcional de IFN-γ la producción de proteínas en los macrófagos.

No específicos de estimulación inmune es un efecto secundario negativo de los oligonucleótidos antisentido y vectores de expresión enfoques basados en vivo [8, 46]. Recientemente Sledz et al., (2003) han encontrado que en algunas condiciones de transfección ARNsi resultados en IFN-mediada activación de la vía de JAK-STAT y mundial upregulation de IFN-estimuló genes. Para demostrar la especificidad de la represión de genes, y no IFN activación de la respuesta inmune en nuestro estudio, tres ARNsi duplexes se diseñaron de acuerdo a Semizarov et al. [46]. Hemos empleado tres tipos de control siRNAs; un mutante IL-12p40 ARNsi (Mut.siRNA) con dos mutaciones puntuales en la 10 ª y 11 ª de nucleótidos de la IL-12p40 ARNsi duplex, un irrelevante ARNsi duplex (GFPsiRNA) [26] y también Antisentido de la ARNsi duplex (As.siRNA). En las concentraciones empleadas en este estudio no hemos visto no específicos de control de silenciamiento ARNsi y, en particular, no inducción de IFN-β.

La capacidad de silencio mediador inflamatorio in vivo tiene consecuencias para la aplicación de enfoques ARNsi en enfermedades inflamatorias como la sepsis, síndrome de distrés respiratorio agudo, y de células T mediada por enfermedades autoinmunes en que la supresión de transientes de la expresión de genes inflamatorios podría resultar beneficiosa para [47]. Se demuestra que la entrega de encapsulados en liposomas ARNsi IL-12p40 dirigidos a la cavidad peritoneal puede murino moderado estímulo inflamatorio in vivo. Hasta la fecha ha habido muy pocas manifestaciones de ARNsi eficacia in vivo. Se ha demostrado que la inyección intravenosa de Fas ARNsi específicamente redujo Fas mRNA y los niveles de expresión de la proteína Fas en hepatocitos de ratón [6]. Más recientemente Sorensen et al, informó ARNsi mediada por la proteína TNF-α ablación in vivo [48]. Utilizando la misma técnica de entrega, nuestro estudio amplía enormemente el uso de ARNsi farmacéutica como herramienta para el descubrimiento de fármacos mediante la demostración de que la entrega ip endógeno inhibe la expresión de genes que afectan a los niveles detectables de citoquinas tanto a nivel local como sistémico, lo que alteró la maduración y activación de células inflamatorias en el insulto. Esto apoya las conclusiones de Song et al, que mostraron que el tratamiento con Fas ARNsi 2 días antes de mitogen desafío derogado hepatocitos y necrosis infiltración inflamatoria resultando en la reducción de las concentraciones séricas de las transaminasas [6]. Hemos investigado si la IL-12p40 específicas ARNsi podría utilizarse terapéuticamente después de endotoxina reto de reducir tanto la local y la respuesta inflamatoria sistémica. Nuestros resultados muestran la entrega de la IL-12p40 ARNsi locales y sistémicos proporciona efectos antiinflamatorios IL-12p40 en los niveles de proteína. Así, la entrega de ARNsi pueden usarse para producir concreto, no permanentes, la inhibición de la expresión de la proteína endógena después de la exposición al insulto inflamatorio.

La simplicidad de este enfoque proporciona un medio rápido para dilucidar novela druggable objetivos anteriormente en intratable inflamatoria y enfermedades mediadas inmunológicamente. Es importante señalar que la transitoria y específica silenciamiento de la proteína productos puede resultar ventajosa. Permanente silenciamiento de genes mediante el uso de ADN plásmido reportero sistemas [2, 26] retrovirales [27] o lentiviral vectores de expresión [29] tiene una serie de desventajas. Permanente silenciamiento de los mediadores inmunes pueden dejar de acogida susceptibles a la infección posterior, o crear potencialmente patológico hiper-respuesta. Además, hay problemas de seguridad no resueltos relacionados con la integración y la acogida de genes de células de transformación que hará que estos enfoques menos aceptable para su uso en niños. El uso de los no hereditarios ARNsi emitido por liposomas evita estos problemas y abre el camino para la exploración de la utilización de ARNsi en humanos para el tratamiento de la enfermedad.

Nuestros resultados muestran que las moléculas sintéticas ARNsi emitido por inyección intra-peritoneal no se ven afectados por las actividades de suero derivado exonuclease [49] y no requieren modificaciones estructurales o la estabilización de las modificaciones [50] con el fin de tener un eficiente efectos locales y sistémicos en el objetivo de genes . Este método es eficaz, no permanente, técnicamente simple, y evita algunos de los efectos secundarios de la entrega y otros enfoques silenciamiento génico.

Conclusiones

Hemos demostrado in vitro que la IL-12p40 ARNsi específicamente silenciada su homólogo ARNm para silenciar transitoria de la IL-12p40 y la consiguiente desmontables de IL-12p70 expresión. A las dosis empleadas, y esto se concreta en que no se haya detectables inducción de los interferones tipo I. Silenciamiento de la IL-12p40 por ARNsi hizo lugar a una reducción de la producción de IFN-γ detectados por ELISA. Estos resultados se extendieron in vivo. Silenciamiento de la IL-12p40 resultados en el no permanente represión de la IL-12 en un modelo murino de inflamación peritoneal. ARNsi Mostramos que se puede usar terapéuticamente después de la apertura de una respuesta inflamatoria para silenciar la expresión de IL-12 y observar una reducción en el infiltrado inflamatorio peritoneal.

Conflicto de Intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones del autor

BPM dirigido el estudio y diseño experimental. DGC y MAF diseñado ARNsi moléculas y los cebos, y ejecutado el procedimiento experimental. SMT participó en el diseño experimental. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

David Casey es financiado por Enterprise Ireland, Bernard Mahon es un Wellcome Trust / Junta de Investigación en Salud "Sangre Nueva" compañeros (GR054236).