Análisis de la fosforilación de calor humano shock factor 1 en las células experimentando un estrés

Fosforilación convertido en un importante mecanismo después de la traducción que es muy adecuado para efectuar un cambio rápido en la actividad de un factor de transcripción en respuesta a una señal extracelular [1, 2]. Durante los períodos de estrés físico o químico, la transcripción de genes que codifican cytoprotective choque térmico o de las proteínas de estrés (HSPs) se incrementa. Esta mayor expresión está mediada principalmente por el calor shock factor 1 (HSF1) en células de vertebrados o por un factor homóloga (HSF) en células de vertebrados no. HSF/HSF1 está continuamente presente en las células, pero sólo se activa cuando las células experimentan un estrés. Se sabe que a largo HSF/HSF1 es hyperphosphorylated hincapié en las células [3 - 5].

Activación de HSF1 humanos se produce en por lo menos dos pasos. Un primer paso en la formación de resultados factor homotrimers que son capaces de unirse denominada elemento de choque térmico (HSE) secuencias de los genes presentes en hsp pero fundamentalmente la falta de actividad transcripcional. En un segundo paso, estas HSF1 homotrimers se convierte en una forma competente transcriptionally [6 - 8]. En células expuestas al calor, la adquisición de ADN HSE vinculante actividad se observó a preceder hyperphosphorylation de HSF1 [9]. Este resultado sugiere que hyperphosphorylation podría desempeñar un papel regulador en el segundo paso que hace que la activación del factor de transactivation competentes. Varias observaciones adicionales son compatibles con la hipótesis de que hyperphosphorylation de HSF1 es necesaria para la mejora o la inducción de la transcripción de la competencia: (i) En la medida de esto fue examinado, todas las condiciones que dieron lugar a la activación de HSF1 también hyperphosphorylation inducida por el factor de . (Ii) Por el contrario, los compuestos tales como salicilato, la indometacina, menadiona y peróxido de hidrógeno que sólo eran capaces de desencadenar el primer paso de activación HSF1 tampoco pronta factor hyperphosphorylation [8, 10, 11]. (Iii) Inhibidores de Ser / Thr proteína cinasas reducido, y los inhibidores de la Ser / Thr fosfatasas mayor, HSF1 actividad [11 - 17]. A los inhibidores de investigados se comprobó que no afectan HSF1 ADN vinculante actividad [11] (ver también [18]].

Hasta la fecha, el estrés inducido por la fosforilación de HSF/HSF1 no ha sido ampliamente analizado. Sin embargo, la fosforilación de Ser ²³⁰ del humano HSF1 se informó de calor para contribuir a la activación del factor transcripcional por el mejoramiento de su competencia [19]. También se propuso que la fosforilación de Thr ¹⁴² de humanos HSF1 pueden ser esenciales para la actividad de factor [20]. Además, varios HSF/HSF1 residuos cuyo factor de la actividad de fosforilación reprimidos se identificaron [9, 21 - 30]. En humanos HSF1 estos residuos son ³⁰³ Ser, Ser ³⁰⁷ y Ser ^363. En el presente estudio se trató de combinar la mutagénesis sistemática de los análisis físicos y de proporcionar una amplia contabilidad de la fosforilación de HSF1 en calor-subrayó células.

En quimérico factor de la serie LEXA-(humanos) HSF1 el ADN vinculante de dominio (residuos 1-78) de las 529-de residuos humanos HSF1 polipéptido es sustituido con el de la serie LEXA represor bacteriana (residuos 1-87) [7]. HSF1 serie LEXA-que se conoce de anteriores estudios que se han regulado de manera similar como HSF1 [7]. Transactivation por la serie LEXA-HSF1 fue evaluada por doble luciferase ensayo de las células co-transfectadas con un firefly luciferase genes de respuesta a la serie LEXA-HSF1 (serie LEXA-fLUC) y un constitutivamente expresado Renilla luciferase genes (pRL-CT o pRL-CMV). Reportero actividad se expresó como la relación de luciérnagas y Renilla luciferase actividades. Para permitir la identificación de mutantes de la serie LEXA-HSF1 con pequeñas alteraciones funcionales, transactivation ensayo de la sensibilidad necesaria para detectar cambios en la actividad de factor de transcripción. Para saber si el ensayo tiene esta capacidad en el marco del elegido condiciones experimentales, 96-así culturas fueron transfectadas con diferentes cantidades de expresión construir la serie LEXA-HSF1 (Figura 1A]. En cantidades inferiores a 2 ng / cultura, la actividad de reportero incrementaron proporcionalmente a la cantidad de expresión construir transfectadas. Por lo tanto, en estas bajas concentraciones de ADN cambios en la serie LEXA-HSF1 actividad fueron determinados que se refleja en cambios proporcionales en reportero de la actividad. La mayor parte posterior transfections se llevaron a cabo con 0,5 ng o menos expresión de la construcción de 96 pozos por la cultura. Transfección con 0,5 ng de la construcción de la serie LEXA-HSF1 dado lugar a un aumento del 30% en el total de HSF1 concentración estimado por la mancha occidental, un día después de transfección (Figura 1B]. Suponiendo un típico transfección eficiencia de 20-40%, este resultado implica que las células transfectadas, en promedio, expresó cantidades comparables de la serie LEXA-HSF1 y endógenos HSF1. Por lo tanto, en estas condiciones, en virtud de la cual un HSF1 forma exógena o no se sobreexpresa sólo mínimamente, el regulador ha tropezado el exógenos HSF1 forma es probable que sea similar a la que los factores endógenos a los que está expuesto. Se trata de una partida de varios estudios anteriores relativas a la fosforilación HSF1, entre ellos uno de nuestro propio grupo [28], en la que los estudios exógenos HSF1 formas se sobreexpresa sustancialmente. Un conocido resultado de esa sobreexpresión es que una parte considerable de los factores exógenos como el ADN acumula vinculante trimers en ausencia de un estrés [7]. En los bajos niveles de expresión en la construcción de los ensayos de transfección utiliza en la presente, este resultado no se produce (como se documenta, por ejemplo, el experimento se muestra en la Figura 3A].

Sustitución de los mutantes de la serie LEXA-HSF1 o de la serie LEXA-FLAG HSF1 (FLAG-etiquetados serie LEXA-HSF1) que se prepararon en conjunto abarcan todos los 92 Ser, Thr y Tyr HSF1 residuos de la secuencia presente en la serie LEXA-HSF1. Transactivation ensayos se llevaron a cabo para comparar la transcripción de la mejora de habilidades de los mutantes y de los padres en las células factores que o bien se habían expuesto a un 44 ° C/30 min tratamiento térmico o no han sido sometidos a tratamiento térmico. Cabe señalar que este tratamiento térmico dado lugar a un mínimo de la muerte de la célula. Los resultados revelaron que la mayoría de los mutantes mantuvo el fuerte calor inducibility de los respectivos padres factor (Tabla 1]. Nueve mutantes (destacado) tenía una actividad inducida que fue inferior a la de los padres por el factor promedio de más de dos desviaciones estándar (2 × 10,3%). Cinco de estos mutantes fueron sólo ligeramente afectada, pero cuatro mutantes, S326A/T328A, T400A / S (403/404), S (457/458/461) y un T511A/S513A, ha reducido sustancialmente las actividades. S326A/T328A mutantes y T511A/S513A se expresaron a los niveles normales. Sin embargo, mutante T400A / S (403/404) acumulados a un nivel sensiblemente inferior, y mutante S (457/458/461) A fue cleaved proteolytically (mancha occidental datos no presentados). Estos resultados sugieren la posibilidad de que la fosforilación de los residuos 326, 328, 511 y / o 513 que desempeñan un papel importante en la activación de HSF1 por estrés térmico. S mutantes (303/307) y un S307A fueron alrededor de 150% y 50%, respectivamente, más activos que los padres factor de las células a un tratamiento térmico (Tabla 1].

En una primera serie de experimentos, las culturas transfectadas el día anterior con la construcción de expresión-FLAG HSF1 se pre-equilibrio con ³² PO ₄ y, a continuación, a un tratamiento térmico de 45 minutos a 44 ° C. Immunoprecipitated exógenos HSF1 se utiliza un anti-FLAG resina. En un manchado, de alta resolución Tris-Tricine gel SDS-PAGE (Figura 1C], inmune-aislados HSF1 apareció como dos bandas y una fuerte migración de más lento difuso región que figura entre los más fosforilados formas (que son también más intensamente radiomarcada; datos No se muestra). Proteínas de la última región (véase el brazo en la Figura 1C] fue sometido a la tripsina o la tripsina y quimotripsina digestión. Phosphopeptides fueron separados por HPLC, tentativamente identificados por espectrometría de masa (MALDI-MS) y confirmado por regular y / o secuenciación radioquímica. En posteriores experimentos, sin etiqueta de péptidos, purificado FLAG-etiquetados HSF1 digeridos con tripsina, tripsina y quimotripsina, o endoproteinases Glu-C o AspN fueron analizados por espectrometría de masas en tándem (LC / MS / MS). Estos análisis dio lugar a una identificación inequívoca de phosphoserines en las posiciones 121, 230 *, 292, * 303, * 307, 314, 319, 326, 344, 363 *, 419, y 444 de la secuencia HSF1 (Cuadro 2; informó anteriormente * Sitios). No fosforilados Thr o se descubrieron residuos de Tyr. Este análisis contempla> 90% de la secuencia HSF1. No se obtuvo información acerca de los residuos 176-184, 202-206, 225-227, 241-256, 270-284 y 427-432.

Con base en los resultados de la antes descrita alanina escanear HSF1 residuos 326, 328, 511 y / o 513 se consideraron posibles sitios para la fosforilación de reglamentación. De estos residuos Ser sólo ³²⁶ se encuentran en realidad en fosforilados HSF1 del calor de las células conmocionado. No todos los residuos que fueron identificados como objetivos de la fosforilación por espectrometría de masa y / o la secuencia ha sido sustituida por separado en la anterior alanina scan. Para descartar la posibilidad de que un efecto de la sustitución de un fosforilados de residuos ha sido enmascarado o de alguna otra manera modulada (en el caso de Ser ³²⁶⁾ por otras sustituciones presente en el mismo mutante, solo sustituciones se prepararon y examinaron en el transactivation ensayo. Todas las sustituciones de fosforilados serines excepción de la sustitución S326A mostradas calor inducido por actividades comparable a la de los padres factor (Tabla 1, la parte inferior). La S326A es sólo la sustitución de aproximadamente un 40% tan activo como factor de la matriz (35-55% en cada uno de los experimentos). Para comprobar si la sustitución de la Ser ³²⁶ afectados no sólo calor, sino también inducido químicamente inducida HSF1 actividad, la actividad de la mutante S326A fue probado en células expuestas a CdCl _2. Inducción por CdCl ₂ resultó ser igualmente afectada por la inducción de calor (Figura 1D]. Tenga en cuenta que este fenotipo reducción de la actividad no se debía a una reducción del nivel de acumulación de los mutantes como lo demuestra el anti-FLAG mancha occidental muestra en la Figura 1E. Secuenciación de nucleótidos de toda la secuencia de codificación-S326A confirmó que no contenía ninguna mutación adicional. Por otra parte, una segunda copia de mutante S326A obtenidos en un experimento de mutagénesis tenido una similar alteración de la actividad inducida por el estrés como la copia original.

Un phosphopeptide de anticuerpos (en adelante, pSer ³²⁶ anticuerpo) está dispuesta a vigilar específicamente la fosforilación de la Ser ^326. Calor inducida global de las tasas de fosforilación de HSF1 (es decir, la fosforilación de todos los sitios web disponibles), de los específicos de fosforilación de Ser factor de ³²⁶ y oligomerización se compararon en el experimento se muestra en la Figura 2 (grupos AyB). Culturas o bien no fueron sometidos a tratamiento térmico o de un tratamiento térmico a 44 ° C por 5, 10, 15 o 30 min. HSF1 trimerization fue evaluada por los nativos HSF1 anti-blot. Como mejor visto por los siguientes a la desaparición de la forma monomérica, la mayoría HSF1 o se está en proceso de convertirse en oligomeric dentro de los 5 minutos de tratamiento térmico (Figura 2A]. Para el examen general y ^326-Ser específico de fosforilación, HSF1 se immunoprecipitated utilizando anticuerpos pSer ^326. Immunoprecipitated HSF1 (Figura 2B, "ip" carriles), y en extracto HSF1 ( "lisado" carriles) fueron detectados por el anti-occidental HSF1 blot. Para mejor resolver HSF1 diferentes especies, la electroforesis se continuó hasta los 50 kDa marcador había emigrado a finales del gel (sólo en la región que contiene HSF1 formas, es decir, de alrededor de 70 kD proteína de tamaño, se muestra en la Figura 2B]. Los resultados sugirieron que este células contiene una pequeña cantidad de HSF1 que podrían immunoprecipitated por el pSer ³²⁶ anticuerpo ( "ip", primer carril). Tenga en cuenta que, como se hubiera podido esperar, el más rápido cambio del immunoprecipitated HSF1 forma más lenta de lo que fue el más rápido especies presentes en el extracto (compare 0-min "ip" y "lisado" carriles). Tras el tratamiento térmico de las células, las cantidades de HSF1 precipitatable de extractos pSer ³²⁶ por el aumento de anticuerpos alrededor de 3 veces (véase infra cuantificación "ip" carriles). Este aumento es esencialmente completa después de sólo 5 minutos de tratamiento térmico. En general fosforilación como revelado por un desplazamiento de más rápido-lento-a la migración de especies HSF1 producido más lentamente y continuó durante todo el curso de 30 minutos de tratamiento térmico ( "lisado" carriles). Un cambio gradual comparable a la desaceleración de la migración de las especies también se observó para pSer ^{326-contienen} especies HSF1 ( "ip" carriles). Así, el tratamiento térmico al parecer como resultado un aumento sustancial en el nivel de fosforilación de la Ser ^326. Este aumento de la fosforilación se produjo sobre tan rápidamente como factor de oligomerización y precedidos de fosforilación de la mayoría de los otros sitios.

Calor inducido por fosforilación de la Ser ³²⁶ fue confirmada por un segundo experimento, en la que HSF1 fosforilados en Ser ³²⁶ fue detectado por anti-occidental pSer ³²⁶ blot. Debido a la baja avidez de los anticuerpos, HSF1 necesarios para ser enriquecido antes de la mancha occidental. Las grandes culturas (en placas de 100 mm) fueron transfectadas con pequeñas cantidades de expresión construir FLAG-HSF1. Un día después, la mitad de los cultivos fueron sometidos a tratamiento térmico a 44 ° C durante 30 min, y con etiquetas HSF1 se immunoprecipitated usando un anti-FLAG resina. Inmune-aislados material fue luego analizada por el oeste blot utilizando pSer ³²⁶ y FLAG anticuerpos (Figura 2C]. El pago de la FLAG-HSF1 del calor de las células tratadas y sin tratar fue comparable (anti-FLAG mancha en la parte superior). Una fracción considerablemente mayor (2,5 veces) de factor de las células a un tratamiento térmico que de no tratados por calor células reaccionó con el anticuerpo pSer ^326.

Para examinar los efectos de la sustitución de la Ser ³²⁶ en un fondo de otro wildtype HSF1, se hizo uso de un ratón HSF1 negativo línea celular preparado previamente por McMillan et al. [31]. Los análisis se llevaron a cabo un día después de transfección de expresión construye para HSF1, sustitución mutante S326A (wildtype HSF1 no en la serie LEXA-HSF1 fondo) y de control de la proteína β-galactosidasa. En primer lugar, se examinó si la fosforilación de ³²⁶ afectados Ser el primer paso de activación HSF1, paso que implica la adquisición de ADN HSE vinculante actividad nuclear y localización. Movilidad electroforética cambio de ensayo reveló que HSE ADN vinculante de las actividades wildtype HSF1 y mutante S326A calor fueron inducidos a niveles similares (Figura 3A]. Localización nuclear fue ensayada por norma fraccionamiento de los extractos de células y anti-occidental HSF1 blot. Cantidades comparables de wildtype HSF1 y mutante S326A estuvieron presentes en la fracción nuclear de las células a un tratamiento térmico (datos no presentados). Por lo tanto, la fosforilación de la Ser ³²⁶ no afecta a la primera etapa de activación HSF1. Para la segunda sonda de activación de paso, es decir, la adquisición de transactivation competencia, HSF1 negativo células fueron co-transfectadas con las construcciones por encima de expresión y con reportero construye HSP70-fLUC y rLUC. Culturas o bien se deja sin tratamiento o fueron sometidos a tratamiento térmico a 43 ° C por 30 min y se incubaron durante 6 horas. Transactivation competencia fue estimada por el oeste de la mancha endógeno HSP70 (Figura 3, los grupos ByC) y por luciferase ensayo (Figura 3D]. Calor inducida por la expresión de HSP70 endógeno se redujo en un 80% en las células que expresan el mutante S326A de HSF1 en comparación con las células que expresan wildtype HSF1. El transfectadas luciferase reportero se redujo en un 50%. El mayor efecto sobre la expresión HSP70 probablemente explica por la diferencia de RNA / proteína HSP70 y la estabilidad entre luciferase.

En el presente estudio se intentó por primera vez para examinar la fosforilación de HSF1 en las células expuestas a un estrés de manera global. Aunque HSF/HSF1 se activa en las células expuestas a distintos tipos de acontecimientos estresantes, en el interés de poder realizar un análisis en profundidad, hemos decidido centrar la atención en la fosforilación de HSF1 en las células en respuesta a un único tipo de estrés, es decir, un calor Estrés. Nuestro estudio identificó doce residuos de serina en HSF1 humanos que son fosforilados en el calor de las células subrayó. Ocho de estos residuos representan fosforilación sitios que antes no se conoce, es decir, Ser ^121, Ser ^292, Ser ^314, Ser ^319, Ser ^326, Ser ^344, Ser ⁴¹⁹ y Ser ^444. Fosforilación de todos los residuos que se encontraron anteriormente fosforilados in vivo, es decir, Ser ^230, Ser ^303, Ser ³⁰⁷ y Ser ^363, se confirmó. No fosforilación de Thr ¹⁴² o cualquier otro residuo de Tyr Thr o se observó.

Debido a la importancia de los distintos eventos de fosforilación de la activación de HSF1 humanos no se puede predecir, se realizó un esfuerzo para garantizar que la base transactivation ensayo utilizados en el presente estudio fue capaz de presentación de informes aún relativamente menores alteraciones en la actividad de los mutantes como HSF1 Así como examinar la exógenos HSF1 formas, en condiciones que difieren lo menos posible de los que se enfrentan los factores endógenos. Aunque HSF1 ratón deficiente de las células estaban disponibles y fueron utilizados en experimentos más tarde, nuestra meta inicial fue identificar mutantes de HSF1 humanos que se funcionalmente deficiente en las células humanas. Por lo tanto, los mutantes se prepararon de la serie LEXA-HSF1 de fondo, lo que nos permite probar los efectos de las mutaciones en las células que contienen HSF1 endógeno. Hyperphosphorylation porque se esperaba que transcripcional HSF1 afectan a la competencia en lugar de HSE de ADN capacidad vinculante, el uso de un HSF1 forma idéntica a excepción de un HSF1 sustituido ADN vinculante dominio parecía justificada. Por razones obvias, un mutante HSF1 con una alteración en la actividad cuando no se disponía de ensayo condiciones necesarias para ser establecido. En ausencia de dicho mutante, se definieron las condiciones de ensayo, en virtud de la cual la actividad reportero incrementaron proporcionalmente a las cantidades de la serie LEXA-HSF1 expresión construir transfectadas. En virtud de las condiciones de los elegidos, HSF1 exógenos (es decir, la serie LEXA-HSF1) se expresó en un nivel comparable como HSF1 endógeno. Por lo tanto, estas condiciones también satisfechos de que nuestro segundo criterio fue en analizar exógenos HSF1 intracelular en una situación que asemeja que se enfrentan los HSF1 endógeno. La importancia de este último criterio se ejemplifica en la observación anterior, que sobreexpresa sustancialmente exógenos HSF1 es trimeric y ADN obligatorio en la ausencia de un estrés, mientras que HSF1 endógeno no es vinculante trimeric ADN y en las mismas condiciones [7]. En los ensayos de transactivation utilizados en el presente estudio, exógenos HSF1 no específicamente obligar ADN en ausencia de un estrés.

Estos discutieron las diferencias entre la transactivation ensayo utilizados en el presente estudio y análisis empleadas en estudios anteriores proporcionan una explicación preparada para las diferencias observadas en los fenotipos de mutantes S (303/307) y un S307A. Esta última sustituciones (también en la serie LEXA-HSF1 fondo) ha sido examinado en un estudio anterior de nuestro laboratorio y se determinó que se activa en la ausencia de una tensión [28] (ver también [9, 23, 25]]. En este estudio anterior, HSF1 formas se sobreexpresa sustancialmente, lo que resulta en la acumulación de factores homotrimeric en ausencia de un estrés. Por lo tanto, los experimentos son sólo capaces de evaluar los efectos de las mutaciones en transcripcional HSF1 competencia. Cuando se examinó utilizando el ensayo de este estudio, en el que ensayo de oligomerización exógenos HSF1 formas está regulada, la Ser ³⁰⁷ y Ser ³⁰³ / Ser ³⁰⁷ sustituciones podría considerarse que se inactiva en ausencia de un estrés, a condición de que las mutaciones sólo afectó HSF1 transactivation competencia y no también oligomerización. Como se muestra en el Cuadro 1, este resultado fue el esperado. En el calor de las células subrayó, sin embargo, la Ser ³⁰⁷ y Ser ³⁰³ / Ser ³⁰⁷ sustituciones superado la actividad del factor de los padres. Este hallazgo es consistente con un papel de la fosforilación en Ser ³⁰³ y ^Ser-307 en el HSF1 modulación de la actividad durante un estrés térmico o, más probablemente, durante la recuperación de la tensión. Ese papel ha sido propuesta anteriormente por otros (por ejemplo, [23, 27, 32]]. También es compatible con esta hipótesis es que, en un tríptico resumen de HSF1 aislado de las células de pulso marcado con ³² PO ₄ durante el 44 ° C/45 min tratamiento térmico, péptido 297-309 fue uno de los más intensamente radiomarcada péptidos (no se muestra) . Este hallazgo implica que la fosforilación de Ser ³⁰³ y / o ³⁰⁷ Ser se produjeron durante el tratamiento térmico. Hietakangas et al. Ser confirmado recientemente que ³⁰³ es inducibly fosforilados por mancha occidental phosphopeptide experimentos utilizando un anticuerpo que reconoce pSer ³⁰³ [33]. Como Ser ³⁰³ fosforilación puede exigir antes de la fosforilación de la Ser ³⁰⁷ [23], ³⁰⁷ fosforilación de la Ser también es probable calor-inducible.

En el presente estudio se identificaron ³²⁶ Ser HSF1 de residuos como un objetivo dominante de la fosforilación de regulación durante la activación del factor por un estrés térmico. Luciferase reportero indicó que los ensayos de fosforilación de la Ser ³²⁶ causas inducidas por el calor de la actividad HSF1 a por lo menos el doble. El transactivation ensayos HSP70 endógeno en el que se utilizó como punto final reveló que este aumento de la actividad HSF1 se traduce en un aumento de cinco veces en la acumulación de HSP70. Si bien nuestro estudio no abordó esta cuestión, parece probable que el observado cinco veces HSP70 mejora de la expresión resultante de la fosforilación de la Ser ³²⁶ es fisiológicamente importante. Un estudio anterior demostró que de cinco a ocho veces en menoscabo de calor inducido HSP70 expresión dio lugar a la disminución sustancial de la termotolerancia afectados fibroblastos células de embrión de ratón [34]. Fosforilación de la Ser ³²⁶ también parece contribuir significativamente a HSF1 actividad en las células inducida por la exposición a subrayó CdCl _2.

Nuestro análisis sugiere que, a título individual, la fosforilación de ninguno de los demás residuos identificados como fosforilados en las células tratadas con calor contribuye significativamente a la actividad HSF1. Se consideró la posibilidad de que la fosforilación de algunos de estos residuos pueden ser necesarios para producir un efecto claramente detectable. Aunque esta posibilidad no fue examinado exhaustivamente, distintas combinaciones de sustituciones inclusión o exclusión de la sustitución S326A fueron probados por transactivation ensayo (datos no presentados). Estos experimentos no encontrar pruebas de un efecto funcional de la fosforilación en residuos que no sean Ser ^326. Es desconcertante que se HSF1 fosforilados en una serie de los residuos (por ejemplo, Ser ^121, Ser ^230, Ser ^292, Ser ^314, Ser ^319, Ser ^344, Ser ⁴¹⁹ y Ser ^444), cuya fosforilación no parece afectar a la actividad de factor. En efecto, no puede excluirse que formalmente fosforilación de algunos de estos residuos pueden reflejar los artefactos debido a las diferencias en la fosforilación de HSF1 exógenos y endógenos. Una explicación más razonable puede ser que esta fosforilación puede ser pertinente en virtud de las condiciones no han sido probados en el presente estudio. Esas condiciones pueden incluir diferentes tipos de tensiones o de los distintos niveles de tensiones utilizadas para activar HSF1. Es posible que incluso se refieren a las diferencias en los ensayos de transactivation utilizado que puede dar lugar preferencial en la evaluación de las diferentes facetas de HSF1 activación. Esta última explicación puede aplicarse a la fosforilación de la Ser ²³⁰ que se había informado anteriormente de contribuir a la activación de HSF1 por estrés térmico [19]. Otra posibilidad que se sugiere por el hecho de que no sólo HSF1 HSP transactivates genes, pero también participa en la regulación de varias importantes vías de señalización (por ejemplo, [35 - 38]]. Ser fosforilación de los residuos que se muestra gratuita en lo que respecta a la regulación de la expresión HSP pueden afectar HSF1 de interacciones con otros componentes de estas vías y alterar su actividad.

De acuerdo con trabajos anteriores, el estrés térmico inducido rápida trimerization de HSF1. El sustancial aumento de la fosforilación de la Ser ³²⁶ que fue inducida por el estrés por calor producido dentro de un marco de tiempo similar. Este rápido ritmo de la fosforilación de la Ser ³²⁶ fue acorde con lo que se esperaba para un evento de fosforilación que es esencial para la activación de estrés térmico HSF1. La mayoría de los otros eventos de fosforilación que podría ser supervisado por su efecto sobre la movilidad de gel producido más lentamente. Por lo tanto, es posible que algunos de estos eventos requiere más tarde antes de la fosforilación de la Ser ^326. Sin embargo, que al menos una parte de esta fosforilación producido ³²⁶ Ser independiente de la fosforilación fue sugerido por la observación de un calor inducido por SDS-PAGE cambio de la movilidad mutante S326A (datos no presentados).

El presente estudio proporciona evidencia de que la fosforilación de la Ser ³²⁶ estimula la transcripción de la mejora de la actividad de HSF1 su ADN, pero no vinculante. ¿Cómo esta fosforilación resultados en el aumento de competencia de transcripcional HSF1 queda por esclarecer. La observación de que la sustitución de la Ser ³²⁶ ni con Asp Glu ni reproduce el efecto de la actividad de fosforilación de los factores (datos no presentados) sugiere que el mecanismo no se basa en simples cargo repulsión. Tal vez, la fosforilación de Ser local ³²⁶ induce un cambio conformacional que afecta vinculante de un chaperón o de otro complejo proteína reguladora de cerca a la reglamentación de dominio que se sabe participan en la represión transcripcional de la competencia [6]. Alternativamente, pSer ³²⁶ puede ser un aspecto crítico de un sitio de unión para un desconocido co-activador. Identificación de la proteína quinasa que fosforila Ser ³²⁶ en el calor destacaron células sería útil para determinar si el nivel de fosforilación de los residuos está regulado y, si este fuera el caso, por lo que el estrés inducido mecanismo. Lamentablemente, la búsqueda de la secuencia Ser ³²⁶ en el que se inserta de la proteína quinasa NetPhosp sitios utilizando el programa [39] no ha proporcionado ninguna información útil sobre candidato de proteínas quinasas.

El presente artículo se refiere a la regulación de HSF1 humanos, que es un factor clave de mediación de la respuesta transcripcional de células humanas para física y química y un coregulator destaca de otras importantes vías de señalización (por ejemplo, [35 - 38]]. HSF1 incluso ha sido descubierto para regular el envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad [40, 41]. Para llegar a una mejor descripción de los mecanismos que permiten a las células responder a las diversas transitoriamente upregulating destaca por la expresión de genes HSP, será importante para conocer la medida en que modula HSF1 fosforilación de estas respuestas, así como para descubrir la forma en la fosforilación / dephosphorylation HSF1 de sí mismo está regulado por subraya. Por otra parte, cabe esperar que una comprensión cabal de la fosforilación de reglamentación de HSF1 hará avanzar nuestros conocimientos acerca de lo que controla la interacción de este factor con otras vías, así como que probable que, a través de la eventual identificación de las proteínas quinasas reguladas y fosfatasas que participan en la fosforilación HSF1 Y dephosphorylation, conducir a la identificación de nuevas conexiones con otros sistemas de regulación. El presente estudio representa una contribución inicial hacia esos objetivos más amplios. Nuestro análisis sistemático de HSF1 fosforilación en el calor destacaron células identificado doce fosforilados Ser residuos, de los cuales ocho fueron antes no conocida. Mutagénesis y funcional de experimentos reveló que recientemente identificados phosphoSer ³²⁶ desempeña un papel importante en la activación de calor de la actividad transcripcional HSF1 como demuestra el hecho de que la sustitución de esta acumulación de residuos reducido HSP70 varias veces. Fenotipos para sustituciones de Ser ³⁰³ y Ser ³⁰⁷ se observó que sean compatibles con el propuesto anteriormente la función de la fosforilación de estos residuos en HSF1 desactivación. Aunque no hay pruebas de las funciones de otros phosphoserines podrían ser obtenidos en este estudio, el conocimiento de la identidad de la mayoría o de todos los residuos fosforilados en calor-activado HSF1 debería facilitar mucho más dirigido experimentos para poner a prueba el potencial importancia de su fosforilación en los diversos procesos y HSF1 interacciones en el que se conoce a participar. No se puede descartar que, a través de la utilización de diferentes transactivation ensayos de las funciones de este último en phosphoresidues calor HSF1 regulación de la actividad que puede ser descubierto escapó de detección en este estudio.

PhosphoSer ^326-conejo policlonal de anticuerpos específicos se planteó contra el péptido CSVDTLLpSTAL. El antisuero fue positiva y negativamente sobre la afinidad-purificado inmovilizados fosforilados y unphosphorylated péptido. Por immunoprecipitations, purificadas de anticuerpos fue intersectoriales vinculadas a la utilización de una resina Aprovecha Primaria Immunoprecipitation Kit (Pierce). HSF1 antisuero fue de StressGen biotecnologías; anticuerpos M5 FLAG, FLAG resina M2 y tubulina de anticuerpos fueron de Sigma; HSP70 anticuerpo 4G4 fue de Affinity Bioreagents. Mouse anticuerpo monoclonal 4G4, que se planteó de anticuerpos humanos contra Hsp70, Hsp70 también reconoce ratón. Se detectaron señales de anticuerpos por chemifluorescence y se cuantificaron en un sistema de tormenta Molecular Dynamics.

Hela-CAT [42] las células se mantuvieron a 37 ° Cy 5% de CO ₂ en un 10% MEDM que contiene suero bovino fetal, 100U/ml penicilina y 100 μ g / ml estreptomicina. HSF1 negativo fibroblastos de embrión de ratón se cultivaron en completarse, tal como se describe MEDM por McMillan et al. [31].

Secuencias de codificación para completar (humanos) HSF1 (residuos 1-529), la serie LEXA-HSF1 (que contienen residuos de la serie LEXA 1-87 y 79-529 de residuos humanos HSF1) y amino-terminal-FLAG etiquetados derivados se subcloned en pcDNA3.1 ( +) (Invitrogen), colocando las secuencias bajo el control de un promotor CMV [7]. Estas construcciones fueron nombrados HSF1, la serie LEXA-HSF1, y HSF1-FLAG FLAG-serie LEXA-HSF1, respectivamente. Para la exploración de la alanina, la serie LEXA-HSF1 y de la serie LEXA-FLAG HSF1, fueron utilizados como plantillas para QuikChange sitio ^{R-mutagénesis} dirigida (Stratagene Manual de Instrucciones). Complementaria primer pares sustituirá único o múltiple Ser, Thr Tyr codones o con Ala codones. Potencial de genes mutantes se caracteriza por la restricción de análisis, la expresión de un conejo reticulocitos lisado basada en la transcripción y traducción del sistema (T7 rápido sistema de TNT, Promega) y análisis de secuencias de nucleótidos. Varias mutaciones también se introdujeron en la construcción de HSF1 utilizando el mismo enfoque. El β-galactosidasa expresión construir (B-GAL) fue utilizado pcDNA3.1/His / LacZ (Invitrogen).

Reportero construcción de la serie LEXA-fLUC se describió anteriormente [42]. Reportero gen HSP70-fLUC se obtuvo por subcloning promotor y líder de las secuencias de ARN de los genes humanos HSP70B en un plásmido que contenía un gen firefly luciferase. Constructores de constitutivamente expresado que contenía un gen Renilla luciferase (pRL-TK, pRL-CMV) se obtuvieron a partir de Promega. Culturas en placas de 96 pozos fueron transfectadas utilizando un protocolo de transfección rápida Lipofectamine 2000 (Gibco). Normalmente, cada bien recibido 0.75-1.0 μ l de Lipofectamine 2000, de 25 μ l Opti-MEM y un maestro de la mezcla de ADN (88,25 ng) en 25 μ l Opti-MEM que consta de 80 ng de la serie LEXA-fLUC o HSP70-fLUC, 0,25 ng de pRL - Tk o 0,1 ng de pRL-CMV, 0.1-0.5 ng de la serie LEXA-HSF1 o HSF1 (o un mutante) y 7.5-8.05 ng de B-GAL. 80000 celdas de 100 μ l MEDM se añadieron posteriormente. Normalmente, transfections se llevaron a cabo por triplicado. Transfectadas las células se incubaron por 16-20 horas, a un tratamiento térmico a 44 ° C durante 30 minutos (a menos que se indique lo contrario) o no sometidos a tratamiento térmico y cosechada 6-7 horas más tarde. La duración del período entre el tratamiento térmico y la cosecha de células fue optimizado para firefly luciferase de expresión y la recuperación de la actividad Renilla luciferase. Luciferase actividad fue medida utilizando el Kit Dual Luciferase (Promega) y una placa de Stratec luminometer. Normalmente, la actividad luciferase ensayos se realizaron por triplicado.

Las células fueron transfectadas en cápsulas de 100 mm con Lipofectamine PLUS, 25 ng de HSF1 o mutante HSF1 expresión y la construcción de 2,975 μ g B-GAL de acuerdo a las instrucciones del fabricante, se incubaron durante 24 horas y, a continuación, o bien a un tratamiento térmico o no se trata. PBS, las células fueron lavadas resuspendido en buffer C (20 mM Hepes, pH7.9, 0,42 M NaCl, 1,5 mM de MgCl _2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM dithiothreitol, "Complete" Cocktail inhibidor de la proteasa (Roche), el 25% de glicerol) . Los extractos fueron preparados por tres ciclos de rápida congelación y descongelación, y la clarificación por centrifugación. El mismo protocolo fue utilizado también para la preparación de los extractos utilizados para la electroforesis en gel nativo. Los extractos fueron utilizados, ya sea de inmediato o se almacena a -70 ° C. Movilidad electroforética cambio ensayos se llevaron a cabo básicamente como se describe antes de [7]. Se detectaron señales y cuantificarán mediante un PhosphorImager Molecular Dynamics.

Las células fueron transfectadas tal como se describe en la sección anterior. El fraccionamiento se realizó con NE-PER nucleares y citoplásmicas Extracción de Reactivos Pierce según el protocolo del fabricante. Correcto funcionamiento del protocolo fue verificado por HSF1 siguientes endógeno cuya localización se había determinado previamente.

9,0 × 10 ⁶ células Hela-CAT de 150 mm en los platos fueron transfectadas con 32 μ g de FLAG-HSF1 expresión construir. Para experimentos con análisis de radiomarcada phosphopeptides, 20 horas después de transfección cada cultura se lavan una vez con 25 ml de fosfato libre de MEDM que contengan 5% FCS y se incubó durante 1 hora en el mismo medio. Medio fue sustituido por el medio más dulce que contiene 2 mCi de ³² P-Ortofosfato (NEX011, NEN), y las células fueron incubadas durante 3 horas a 37 ° C. Después del tratamiento térmico durante 45 minutos a 44 ° C, las células fueron lavadas con helado de PBS y lisadas por incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente en 3 ml de buffer Mper (Pierce) complementado con 0,5 mM NaV _3, 5 mM NaF, 150 mM NaCl, 1 μ M ocadaic ácido y "Complete" Cocktail inhibidor de la proteasa (Roche). Después de la eliminación de los desechos, el extracto se incubaron durante la noche a 4 ° C con 80 μ l de resina BANDERA M2. Resina se lavó extensamente con Mper de amortiguación con 150 mM NaCl y Mper buffer solo, y FLAG-HSF1 se eluye con 120 μ l de 6X SDS-PAGE muestra buffer. Posterior a la electroforesis en un Tris-Tricine de alta resolución SDS-PAGE gel [43], FLAG-HSF1 Coomassie-fue manchado, y el gel de las piezas que contiene la mayoría de las especies altamente fosforilados estaban procesados por la Fundación Keck Laboratorio de Biotecnología de recursos en Yale (Kenneth Williams ) Para la digestión proteolítica, el análisis de espectrometría de masas, y radioquímica y normal de la secuencia peptídica. En otros experimentos, sin etiqueta, purificado HSF1-FLAG fue preparado mediante un protocolo similar. Análisis de secuencias de estos preparados se realizó en el Servicio de Harvard Microchemistry utilizando microcapillary HPLC en fase inversa-nano-electrospray y espectrometría de masas en tándem en un Finnigan LCQ DECA cuadripolares espectrómetro de masas de trampa de iones.

Para la mayoría de immunoprecipitation y HSF1 expresión experimentos, las células fueron lisadas en MPer-búfer complementado con 150 mM NaCl y "Complete" Cocktail inhibidor de la proteasa de Roche. Las concentraciones de proteínas en extractos se midieron mediante un ensayo de Bradford (Proteína de ensayo reactivo de Bio-Rad Laboratories). Los resultados se utilizan para ajustar las concentraciones de proteínas en los extractos que se compara.

TG llevado a cabo la mayor parte del trabajo experimental se presenta en este documento. Él también ha preparado todas las tablas y diseñado todas las cifras. FB preparado un primer conjunto de la serie LEXA-HSF1 sustitución mutantes. Asimismo, creó todos los oligonucleótidos utilizados en el estudio, así como todos los analizados secuencia de la información. WSL realizado o supervisado todos los trabajos relativos a la identificación de los residuos fosforilados de HSF1 utilizando LC / MS / MS, interpreta todos los datos obtenidos y consultados sobre diseño experimental. RV concibe el estudio, participaron en su diseño y coordinación, y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito.