Las mutaciones de PIK3CA en adenocarcinoma gástrico

El fosfatidilinositol 3-kinasa (PI3K)-AKT vía de señalización está implicada en la regulación de los diversos procesos celulares, incluyendo las células de crecimiento, la supervivencia y la motilidad. Anormal de la activación de esta vía es frecuente observar en distintos tipos de cáncer, lo que aberrante la progresión del ciclo celular, la adhesión y la motilidad alterada, la inhibición de la apoptosis y la inducción de la angiogénesis [1]. Se ha informado anteriormente de que las alteraciones genéticas que participan diversos miembros a lo largo de esta vía de señalización podría dar lugar a su activación en el cáncer. Estos comprenden la mutación, la pérdida alélica o promotor de la metilación regulador negativo PTEN [2], o alternativamente, de amplificación cromosómica o sobre-expresión de los reguladores positivos PIK3CA [3 - 5] y los diversos AKT quinasas [6, 7]. Además, los cambios en otras vías que comúnmente son alterados en el cáncer, como los que participan en la estimulación del factor de crecimiento a través de la proteína G-junto o por medio de los receptores de la interacción directa con la forma de pequeños activado GTPasa RAS, que también puede conducir a PI3K-AKT Vía [8]. La activación de este proceso conduce a la fosforilación de AKT en Thr-308/309 y Ser-473/474. Estas formas de AKT fosforilada proteínas han sido detectados por Western blot o inmunohistoquímica en varios tipos de cáncer, lo que sugiere la frecuencia de activación de la vía PI3K-AKT en el proceso cancerígeno [7, 9].

A pesar de los cambios genéticos a lo largo de la vía PI3K-AKT en repetidas ocasiones se han documentado en el cerebro, ovario, endometrio, mama, próstata y cáncer de tiroides [1, 2], los informes sobre su mecanismo de activación en el cáncer gástrico son limitados. Cáncer gástrico es el segundo cáncer más común en todo el mundo, pero sus bases moleculares de tumourigenesis aún es poco conocido. Previo estudio de inmunohistoquímica ha demostrado la presencia de la fosforilados forma de AKT en el 78% de cáncer gástrico [10], lo que sugiere que la activación de esta vía también puede ser común en el cáncer gástrico. A pesar de la pérdida de heterozigosidad (LOH) que supongan la legitimación PTEN se ha demostrado en el 47% de cáncer gástrico en un reciente estudio, la mutación o promotor metilación se ausente incluso en los casos con LOH [11]. Así, los datos de este estudio no puede apoyar las dos afectadas por la inactivación de PTEN en el cáncer gástrico, mientras que la importancia biológica de PTEN haploinsufficiency sigue siendo controvertido. Alternativamente, la amplificación de AKT1 ha reportado en un solo caso de cáncer gástrico [12], y la amplificación de PIK3CA asociados a los niveles elevados de ARNm se ha encontrado en el 36% de cáncer gástrico [11]. Más recientemente, Samuels et al. Examinado un amplio espectro de cánceres humanos de la mutación en 16 PI3K o PI3K-como genes y se encontró una alta frecuencia de mutación somática en PIK3CA, que codifica la subunidad catalítica p110 α. Principales cribado en el cáncer colorrectal (CCR) PIK3CA identificaron mutaciones en 74 de 234 (32%) casos, mientras que las mutaciones también se observó en 3 de cada 12 (25%) de cáncer gástrico. Informó de las mutaciones eran en su mayoría de tipo missense, y agrupados en 2 regiones de los dominios quinasa y helicoidal. Expresión de un "hot-spot" mutante, H1047R, confiere una significativa sobre regulación de los lípidos de la actividad quinasa PIK3CA, lo que sugiere que la activación de una mutación [13]. En este estudio, hemos examinado una serie de 94 humanos de los adenocarcinomas gástricos PIK3CA mutación. También hemos examinado PIK3CA expresión nivel de la extracción de datos de una gran escala de la expresión génica de perfiles de estudio realizados con anterioridad para estos casos [14, 15]. Uso de SAM, de correlación de los genes con una importante expresión con PIK3CA también han sido identificados.

Muestras de ADN utilizado para la secuenciación fueron preparados congelados de tumor y no tumorales epiteliales de la mucosa gástrica de 94 pacientes con cáncer gástrico los que se realizó gastrectomía en el Departamento de Cirugía, Hospital Queen Mary, de la Universidad de Hong Kong, como ha sido descrito previamente [16]. Mayoría de las muestras congeladas (n = 81) mostraron tumor componente de más del 70%, mientras que en 13 casos una proporción más baja entre el 50 y el 70% fue aceptado debido a los tumores "inherente carácter difuso infiltrante con atrapamiento de la no neoplásicas componentes. Análisis de inestabilidad de microsatélites (MSI), y KRAS mutación BRAF se han realizado y se informó anteriormente [16]. ARN y preparación de perfiles de expresión génica mediante un cDNA microarray contiene 44500 clones de ADNc, que representa alrededor de 30300 genes únicos, y se ha realizado en 90 de estos tumores, en comparación al 22 de no-tumorales epiteliales de la mucosa gástrica [14, 15]. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Hong Kong.

Mutación de cribado de PIK3CA se realizó para los exones 9 y 20, que abarca el hotspots mutacionales, y para el exón 18, de la que se encontró una mutación en un cáncer gástrico. Las mutaciones en estos 3 exones constituyen el 80% de todas las mutaciones de PIK3CA detectadas en el estudio anterior [13]. PIK3CA intrón-amplificación de los primers específicos externos e internos secuenciación primers fueron diseñados de acuerdo con el estudio anterior [13] con algunas modificaciones [véase la archivo adicional 1 ]. En particular, los cebos para el exón 9 se han modificado para evitar la amplificación de secuencias homólogas de los otros cromosomas. Productos de la PCR se han generado utilizando el exterior primers y secuenciados directamente usando el interior de los cebos con los DYEnamic ™ ET Terminator Ciclo de Secuenciación Kit (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante del equipo. Electroforesis se realizó en el ABI Prism ^® 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Para cada exón, los productos PCR se generaron a partir del 2 de reacciones independientes de PCR para la secuenciación de los capítulos adelante y atrás. Para el exón 9, 2 independientes PCR seguida de la secuenciación del capítulo se realizaron con interés. El análisis de los cromatogramas se ha realizado mediante el análisis de mutaciones de software Mutación Explorer ™ (SoftGenetics, State College, PA, EE.UU.).

La expresión de genes de datos fueron extraídos de la base de datos que contiene los microarrays 126 muestras (90 de cáncer gástrico, el 14 de metástasis a los ganglios linfáticos y el 22 de no-tumorales epiteliales de la mucosa gástrica) sobre la base de una señal de 3 veces por encima de ratio de fondo, ya sea para canal y el 80% con buenos datos [14 ]. Datos de la expresión génica 20336 clones de cDNA esta satisfecho los criterios de selección y se extrajeron, que incluía un clon cDNA correspondiente a PIK3CA (IMAGEN clon número 345430, GenBank adhesión no. W72473). Expresión de datos para PIK3CA se extrajo y de las diferencias en los niveles de expresión entre el tumor y los tejidos tumorales no fueron examinadas usando el de la t de Student Test. SAM se realizó para identificar los genes con importantes correlacionar con PIK3CA expresión [17]. Los valores que faltan en el conjunto de datos se estimaron por una K-vecinos más cercanos de 10 imputar algoritmo vecino más cercano [18] seguido de 5000 permutaciones en el análisis de la SAM.

Entre los 94 analizados adenocarcinoma gástrico, hemos detectado PIK3CA mutación en 4 casos. Dos de los casos se encontraba la mutación A3140G (H1047R) en el exón 20, y los otros 2 casos con G1624A mutaciones (E542K) y G1633A (E545K) en el exón 9. Representante secuencia de cromatogramas se muestran en la figura 1. Los cuatro ausentes eran las mutaciones en el correspondiente no neoplásicas epiteliales de la mucosa y, en consecuencia, se confirmaron como mutaciones somáticas. Aunque la frecuencia de la mutación (4,3%) fue más baja que la del anterior estudio, la naturaleza de las 4 mutaciones encontradas eran compatibles con las que se determinaron en la informó de los puntos de acceso. En particular, la mutación H1047R ha informado en 2 tipos de cáncer gástrico y 15 cánceres colorrectales [13]. Si bien la E542K y la E545K no se encontraron mutaciones en el cáncer gástrico en la serie anterior, un gran número de tumores de colon puerto hizo estas mutaciones 2.

PIK3CA mutación del espectro y sus correspondientes características clínico-patológicas se enumeran en la Tabla 1. Se observó una mayor tendencia de MSI de alto nivel en el cáncer gástrico con PIK3CA mutaciones (3 en 4, 75%) que en los que no tienen (18 en el 90, 20%). Por otra parte, si bien la incidencia global de KRAS mutación en la población estudiada fue baja (8 de 94), 2 de los 4 tipos de cáncer gástrico con PIK3CA mutación también alberga un KRAS mutación.

Dado que la sobre expresión de PIK3CA se ha informado en cáncer gástrico [11], también hemos extraído datos PIK3CA expresión de nuestro anterior cDNA microarray estudio de los casos [14, 15]. Hemos confirmado que el nivel de expresión de PIK3CA fue significativamente mayor en el cáncer gástrico (n = 87, media = 0,099, SD = 0,428) en comparación con las no neoplásicas epiteliales de la mucosa gástrica (n = 22, media = -0,418, SD = 0,426; del Estudiante T-Test, p <0,001). Usando PIK3CA nivel de expresión como variable continua de análisis SAM [17], encontramos clones de cDNA 2910 (correspondientes a 2546 acerca de los genes única) cuya expresión asociado positivamente con el PIK3CA expresión (mediana del número de falsos importantes = 0,372, Delta = 1.107) [ver Disposición adicional 2]. Curiosamente, no se encontró gen que se asoció negativamente con el PIK3CA expresión.

En este estudio, hemos informado de la presencia del gen PIK3CA mutación en el 4,3% de cáncer gástrico. Una tendencia alta (3 y 4), de la reparación de la deficiencia de falta de adecuación se observó en los casos en la acogida PIK3CA mutación. A pesar de que el reducido número de mutaciones en el PIK3CA nuestro estudio no podrá justificar la reclamación de la significación estadística; sugerencia de ese tipo, a pesar de su no ser mencionados por los autores, se pueden encontrar de un estudio anterior en el CCR por Samuels et al.. Desde su estudio de 33 MSI y 201 de microsatélites estables (SMS) CRC casos, PIK3CA mutación estuvo presente en el 48% de los tumores MSI, pero sólo en el 29% de los tumores SMS. Se observó una asociación significativa se habría puesto de manifiesto si el análisis estadístico se ha aplicado (prueba exacta de Fisher, p = 0,014) [13]. Los cánceres del tracto gastrointestinal con MSI se sabe que tienen una vía molecular de la evolución del tumor en comparación con sus homólogos de SMS [19, 20]. Esto puede atribuirse a su propensión a la frameshift mutaciones en repetir secuencias, lo que resulta en la interrupción selectiva de los genes con esas secuencias en el marco de sus regiones codificantes. Con 2 poli-adenina extensiones de codificación dentro de su región, PTEN puede ser inactivado a través de mutaciones frameshift MSI en el CRC, lo que resulta en la selección de la PI3K-AKT vía de señalización [21, 22]. También se sabe que la deficiencia de la reparación desajuste daría lugar a una elevada tasa de mutación missense debido a la alteración de nucleótido único desajuste de reparación [23]. Así, observó la mayor incidencia de la mutación en el PIK3CA missense MSI colorrectal y cáncer gástrico sugiere un nuevo mecanismo para la activación de la PI3K-AKT vía de señalización a través de la reparación de la deficiencia de desajuste.

Nuestros datos también muestran una mayor tendencia de KRAS mutación PIK3CA en los casos con mutaciones (2 y 4) que en los que no tienen (6 en 90). Una vez más, debido a la baja incidencia de las mutaciones en nuestras muestras, la significación estadística no podrán ser reclamados. En el estudio de Samuels et al., Algunos de los tumores colorrectales con PIK3CA mutación también alberga KRAS o mutación BRAF [13]. La vía PI3K-AKT se sabe que tiene una estrecha asociación con el RAS-MEKK vía de señalización [8]. Constitutivamente activa RAS pueden interactuar con la subunidad catalítica de PI3K y dar lugar a su activación. Ras PI3K dependiente de la activación contribuye a la transformación de fenotipo por mediación de anclaje independiente de crecimiento, la reorganización citoesqueleto y la apoptosis evasión. Se ha observado que los genes que participan en la misma vía de señalización puede manifestar mutaciones en las células del cáncer en una forma mutuamente excluyentes, presumiblemente debido a la falta de crecimiento selectivo ventaja de contar con una segunda herida en la ya alterada vía. Un ejemplo prominente es el excluyen mutuamente ocurrencia de la mutación BRAF hotspot (V600E) y KRAS mutaciones en el cáncer colorrectal [24, 25]. Sin embargo, existen otros ejemplos de las múltiples alteraciones en los componentes de la misma vía de señalización que puede dar lugar a una multi-nivel de la modulación de su actividad. Por ejemplo, no V600E BRAF mutaciones tienden a ocurrir conjuntamente con KRAS mutaciones [26], y la inactivación de la secretada frizzled relacionados con las proteínas (antagonistas de WNT) promotor de la metilación con frecuencia coincide con mutaciones en el gen adenomatosa Polyposis Coli para lograr multi - Nivel de activación de la vía de señalización WNT en cáncer colorrectal [27]. PIK3CA si funciona independientemente de RAS, y los actos con RAS sinérgicamente para producir efectos aditivos en la activación de la misma vía espera de nuevas aclaraciones.

Extrayendo datos de los microarrays, que han confirmado la sobre regulación de PIK3CA expresión en tejidos de cáncer gástrico en comparación con las no neoplásicas epiteliales de la mucosa gástrica e identificado un gran número de genes que muestran una correlación positiva significativa en el nivel de expresión con PIK3CA. Estos genes participan en diversos procesos celulares con 177 como putativo del ciclo celular-genes regulados [28] y 126 asignada a los genes con funciones conocidas en la regulación del ciclo celular, la proliferación celular o la replicación del ADN [véase la archivo adicional 2]. Si bien algunos de estos genes puede ser inducida por el PIK3CA, otros quizás co-ordinately reguladas por señales comunes de aguas arriba. Expresión conjunto de datos en un punto fue limitado en la diferenciación por encima de la causa y la consecuencia, pero sin duda puso de manifiesto la complejidad del proceso carcinogénico y la intrincada relación de PIK3CA señalización con otros procesos celulares.

Contrariamente a nuestras expectativas, la incidencia de la mutación PIK3CA encontrado en el estudio actual (4%) es mucho menor en comparación con la observada por Samuel et al. (25%) [13]. La razón de la discrepancia puede simplemente ser el resultado de la muestra de parcialidad que el anterior estudio incluyó sólo un pequeño número de tipos de cáncer gástrico (n = 12). Sin embargo, las diferencias étnicas también puede ser otra posibilidad. Las diversas patologías del espectro de los factores etiológicos y de cáncer gástrico en diferentes ubicaciones geográficas puede ser acompañado de las diferencias moleculares en el desarrollo de tumores de vía. Dado que nuestro estudio es sólo sobre la base de una población china con una incidencia de cáncer gástrico intermedio, más estudios con pacientes de diferentes grupos étnicos se podrá hacer frente a esta posibilidad.

En gran escala de detección de los adenocarcinomas gástricos mutaciones de PIK3CA reveló una mutación incidencia de 4,3%. Aumento del nivel de expresión PIK3CA se observó en tumores gástricos que los no neoplásicas epiteliales de la mucosa. Este aumento de nivel PIK3CA se asoció con elevación de la expresión de un gran número de genes, que pueden constituir los reguladores de aguas arriba o aguas abajo de PIK3CA objetivos a lo largo de la vía de señalización PI3K.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

VSWL llevó a cabo el análisis molecular, realiza análisis de datos y redactó el manuscrito. CWW, TLC, WZ asistida en el análisis molecular. KMC proporcionó los datos clínicos. ASWC colaboró en el análisis de datos y editó el manuscrito. SS y XC participaron en el estudio microarray y análisis de datos. STY y SYL concibe el estudio, participaron en su diseño, la coordinación y el análisis de datos, y editado el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

La historia previa a la publicación de este documento puede accederse en:

Http://www.biomedcentral.com/1471-2407/5/29/prepub