BMC Genetics, 2005; 6: 16-16 (más artículos en esta revista)

X-Y-cromosoma y variantes específicas del gen amelogenin permitir determinar el sexo de las ovejas (Ovis aries) y europeos ciervo rojo (Cervus elaphus)

BioMed Central
I Pfeiffer (ipfeiff@gwdg.de) [1], B Brenig (bbrenig@gwdg.de) [1]
[1] Departamento de Biología Molecular, Instituto de Medicina Veterinaria, Goettingen, Alemania

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Resumen
Antecedentes

Simple y precisa los métodos de determinación del sexo en los animales son un requisito previo para una serie de aplicaciones en la producción animal y forense. Sin embargo, algunos de los métodos existentes depende sólo de la detección del cromosoma Y-secuencias específicas. Por lo tanto, el abscence de una señal no necesariamente significa que la muestra es de origen femenino, debido a errores experimentales también pueden conducir a resultados negativos. Así, la detección de Y-cromosoma X-y secuencias específicas es ventajosa.

Resultados

Un nuevo método para la identificación del sexo en mamíferos (oveja, Ovis aries Europea y ciervo rojo, Cervus elaphus) se describe, mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) y la secuenciación de una parte de la amelogenin gene. Una secuencia parcial de la amelogenin genética de las especies ovina y de ciervo rojo se obtuvo, que existe en ambos cromosomas X e Y con una deleción en la región del cromosoma Y. Con un par de primers específicos de una molécula de ADN en fragmentos de diferente longitud entre el macho y la hembra es más grande de mamíferos.

Conclusión

Mediante amplificación por PCR utilizando los primers amelogenin gen es útil en la identificación del sexo de muestras de las ovejas y ciervos rojos y se puede aplicar a los análisis de ADN de muestras de microorganismos con pequeñas cantidades de ADN, como las raíces del cabello, así como los huesos o la biopsia del embrión.

Antecedentes

Sexo identificación mediante el ADN genómico extraído de la carne, sangre, cabello o embrión biopsias veces es un importante instrumento de análisis forense en la ciencia o en la rutina de genotipos. En la mayoría de los mamíferos, el hombre está identificado por amplificar el gen SRY (región determinante del sexo-Y) que es un cromosoma Y-secuencia específica. Cuando los resultados son negativos de amplificación de sólo el gen SRY, no se puede suponer que la persona es mujer o que había un error en el proceso experimental. Un gen presente en ambos, hombres y mujeres, debe ser amplificado en la misma tubo como control positivo. En la identificación del sexo de ursides por PCR, los cebos que amplificar el gen SRY junto con el ADN mitocondrial de control o de la región ZFX / Y se han utilizado región [1, 2]. Por otra parte, informes recientes han descrito el uso de bajos rigor PCR o la detección de X / Y polimorfismos específicos de los fragmentos de restricción (RFLP) en ovejas y cabras [3, 4]. Sin embargo, RFLP requiere un nuevo paso de la reacción que pueda aumentar el riesgo de contaminación y de un diagnóstico equivocado. El amelogenin gene (AMEL), que existe en ambos cromosomas XeY, se ha utilizado para determinar el sexo en el ganado [5] y de los seres humanos [6]. El uso de este gen ha hecho que la determinación del sexo y mucho menos complicado, ya que sólo un par de primers es necesario para ampliar el tamaño de los diferentes fragmentos de la AMEL genes.

En este estudio se utilizó la primers establecido en el ganado a fin de determinar su idoneidad para otras especies, es decir, ovejas y ciervos rojos Europea. Los amplicones fueron aislados y secuenciados, y mostró una característica del polimorfismo de la longitud de los cromosomas X, Y, en ambas especies.

Resultados

Las secuencias de nucleótidos de los productos PCR de la oveja y el ciervo rojo amelogenin gene se muestran en la Figura 1. Ambos productos específicos masculino puerto diferente basepair supresiones (ins / del). Además de un par de nucleótido único ins / dels, el más prominente ins / del es entre posiciones 63 y 107 (45 pb) y las posiciones 127 y 136 (10 bp), de acuerdo a la Fig. 1. Este importante ins / del lleva a una amplificación más corto que puede ser fácilmente detectado en un gel de agarosa. Las ovejas y rojo ciervo macho producto específico se depositó en el EMBL / base de datos de genes en virtud de la adhesión números AY453392 y AY453391, respectivamente. La comparación de la oveja y el ciervo rojo con el ganado amelogenin secuencias de ADN de genes mostraron un 96% y un 97% de homología de la AMELX de genes y un 86% y un 90% de homología de la AMELY gen, respectivamente.

Como era de esperar, una sola banda para las mujeres (EMBL / Genes número de la oveja AY 452664 y mujeres ciervo rojo AY 452665) y dos bandas para los hombres, se detectó al analizar diferentes muestras de los animales (Fig. 2]. Aunque otros no específicos banda se observó en los hombres ovejas y ciervos rojos, no existen problemas para determinar el sexo, sobre la base de los diferentes patrones de bandas.

Discusión

En este estudio hemos establecido un método sencillo y preciso para determinar el sexo de las ovejas y los ciervos rojos, utilizando un par de cebadores para el gen AMEL. El amelogenin gen codifica una importante proteína en el desarrollo de la matriz del esmalte de dientes de mamíferos [7, 8] que se ha conservado durante la evolución de los vertebrados. La genética bovina amelogenin [9] se encuentra en los cromosomas XeY, y las diferencias en su longitud se observan entre los XeY de genes específicos. En otras especies analizadas hasta el momento, por ejemplo, ratones [10], el gen está localizado sólo en el cromosoma X. Nuestros resultados muestran que el gen del amelogenin ovina y de ciervo rojo se encuentra en los cromosomas sexuales y que hay dos diagnósticos ins / del conjunto de 55 pb en el Y-gen específico en la región amplificada.

Al utilizar este método, en combinación con la rutina de genotipos más información acerca de un material objeto de la investigación se puede obtener. Además, la amplificación del gen AMEL también puede utilizarse como un control interno. Además, la contaminación con ADN humano es a veces un problema en el análisis de laboratorio. Sin embargo, la amplificación de los genes humanos AMEL con el mismo primers dado lugar a otro y claramente distinguible de bandas patrón. La situación de la conserva amelogenin gene entre los vertebrados indica la posibilidad de utilizar la prueba en otras especies de mamíferos silvestres como así.

Conclusión

En conclusión nuestros resultados muestran que el ensayo de PCR basado en el gen AMEL es fiable para la identificación del sexo en el ganado ovino y ciervo rojo europeo. La ventaja de este ensayo es que ni de control adicionales amplificados con un segundo locus específicos autosómica primer par de endonucleasa de restricción ni medidas que sean necesarias para determinar el sexo y el control de la reacción de PCR.

Métodos

Se tomaron muestras de las ovejas (Ovis aries) y europeos ciervo rojo (Cervus elaphus). Se extrajo el ADN de diferentes muestras de tejidos de tejido utilizando QIAamp ® Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) de acuerdo con las de los fabricantes manual. Aislado ADN se diluyó en 50 μ l HPLC-H 2 O y se utiliza para profundizar el análisis.

Se utilizó un juego de cebadores (SE47, SE48) para amplificar las ovejas y ciervos rojos amelogenin gene. Las secuencias de ADN de los primers fueron 5'-cagccaaacctccctctgc-3 '(SE47) y 5'-cccgcttggtcttgtctgttgc-3' (SE48), tal como se describe en [5].

Amplificaciones se realizaron en un volumen final de 20 μ l en 10 × PCR buffer (15 mM MgCl 2, pH 8,3) y Q-solución (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania), 100 μ M de cada dNTP, con 1 M Taq ADN polimerasa y 10 pmol de cada primer. Cuatro microlitros del extracto de ADN se añadieron a la mezcla de PCR. La amplificación se llevó a cabo con desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido por 35 ciclos de un paso de desnaturalización a 94 ° C durante 50 segundos, primer recocido a 56 ° C durante 50 segundos y el primer extensión de 72 ° C durante 50 Seg en un Hybaid Omnigene termociclizador (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania). Un paso de extensión final no se incluyó. PCR-productos fueron purificados utilizando el Gel de Extracción QIAEX II Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) de acuerdo con las las instrucciones de los fabricantes. Secuenciación se realizó a través de ABI Prism ™ BigDye Terminator v3.1 Ciclo de Secuenciación Kit (Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania) en un 10 μ l de volumen que contiene 2 μ l PCR-producto purificado y 5 pmol de primer. Reacciones de secuenciación se sometieron 27 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 55 ° C y 3 min a 60 ° C en un Techne Gene E Thermocycler (Burkhardtstorf, Alemania). El tinte terminadores fueron retirados por sephadex-G45 columna de purificación (Millipore). Secuenciación electrophoresed reacciones fueron de 2 h en un ABI Prism ® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania) de acuerdo con las las instrucciones de los fabricantes.

Contribuciones de los autores

IP realizó la extracción de ADN, PCR y análisis de la secuenciación del ADN.

BB se encargaba de la financiación, la supervisión del proyecto de investigación, redacción y edición de manuscritos así como la correspondencia científica.

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada con una donación de la Investigación y la Innovación Erxleben Consejo a ERIC B. Brenig (ERIC-BR1959-2002-03).