Un VHE-Restringido sulfotransferasa se expresa en la artritis reumatoide sinovial y es inducido por lymphotoxin-α y β y TNF-α en las células endoteliales cultivadas

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la inflamación crónica de la membrana sinovial que lleva a la destrucción del cartílago y el hueso tejidos. Los principales componentes celulares del infiltrado inflamatorio en la AR sinovial son células T, macrófagos, células B, y las células dendríticas (CDs) [1]. Tejido infiltrante linfocitos son a menudo dispuestos en folículos que exhiben grados variables de centro germinal (CG) reacciones [2 - 4]. Estas estructuras altamente organizadas son similares a los órganos linfoides secundarios, y el proceso se conoce como linfoide neogenesis [5, 6]. En la AR, esta linfoide ectópico formación de las estructuras se correlaciona con la expresión de lymphotoxin-β (LT-β) y realojamiento quimiocinas como BLC (CXCL13) y SLC (CCL21), recapitulando el proceso de desarrollo de la organogénesis linfoide [7].

La contratación de elementos celulares a los órganos linfoides secundarios se basa en las interacciones entre leucocitos circulantes y los especializados endotelio de vénulas del endotelio alto (HEV), que son exclusivas de estos órganos, en virtud condiciones fisiológicas. La interacción de la L-selectina en los linfocitos con sulfatados glicoproteína ligandos sobre VHE resultados de los ganglios linfáticos en linfocitos rodando por endotelio, que representa el primer paso en linfocitos radiorecalada [8]. VHE-ligandos para la L-selectina consisten en una serie de gran glicoproteínas O-glicosilada, que incluyen GlyCAM-1 y CD34 en el ratón y podocalyxin y CD34 en los humanos [9]. El reconocimiento de estos ligandos por L-selectina sialylation requiere, y fucosylation sulfate mucina de sus dominios semejantes [10]. El mínimo reconocimiento epítopo parece estar compuesto de un grupo conocido como tope 6-sulfo sialyl Lewis x (6-sulfo sLex) en la que la posición C-6 de GlcNAc es esterificado con sulfato. La MECA-79 mAb reconoce una crítica sulfate-dependiente determinante en estos ligandos que se superpone con la L-selectina reconocimiento epítopo. Expresión de GlcNAc6ST-2 (comúnmente conocido como HEC-GlcNAc6ST o LSST), un VHE localizados sulfotransferasa, es esencial para la elaboración de ligandos funcional dentro de los ganglios linfáticos, así como la generación de la MECA-79 epítopo [11 - 13 ]. Otro sulfotransferasa conocido como GlcNAc6ST-1 también contribuye a este epítopo VHE en [14]. MECA-79 reconoce un conjunto de sialomucins, incluida la mencionada L-selectina ligandos, junto con otro identificado recientemente sialomucin llamado endomucin [15, 16]. El complejo se denomina nodo addressin periférica (PNAd) [13]. MECA-79 bloquea la adhesión de los linfocitos a los ganglios linfáticos periféricos (PN) VHE in vitro e inhibe a los linfocitos radiorecalada PN in vivo [17].

El papel de GlcNAc6ST-2 en la generación de L-selectina ligandos en órganos linfoides se ha establecido claramente en ratones genéticamente deficientes en esta enzima [18 - 20]. Linfocitos radiorecalada se reduce a la PN en el GlcNAc6ST-2 - / - ratones como se refleja en un menor tamaño de la PN y un 60% de disminución en el número total de linfocitos dentro de este órgano. Además de los órganos linfoides, la inducción de la MECA-79 epítopo se ha identificado en varios tejidos crónicamente inflamado en el que se propone participar en el reclutamiento de leucocitos [21]. Inflamación sinovial contiene altos vasos de paredes, parecido a VHE, que expresan la MECA-79 epítopo y son capaces de unirse L-selectina + linfocitos en ensayos ex vivo [21 - 25].

Recientemente, el uso de GlcNAc6ST-2 anticuerpos específicos ha demostrado de nuevo la inducción de esta enzima en VHE-como buques y su correlación con la presencia de la MECA-79 epítopo en varios modelos de ratones de la inflamación crónica [26]. En este estudio usando un anticuerpo humano para GlcNAc6ST-2, analizamos si esta enzima se expresa en la AR y en las células endoteliales cultivadas y su correlación con la expresión de MECA-79 epítopo.

Hemos elaborado un anti-humano GlcNAc6ST-2 de anticuerpos y probado en humanos de los ganglios linfáticos y la amígdala secciones. Un patrón vascular del etiquetado se observó que a colocalized MECA-79 buques de VHE positivos morfología (Figura 1a]. Unas pocas células mononucleares también fueron etiquetados con el GlcNAc6ST anti-2 de anticuerpos. Expresión de la MECA-79 epítopo se detectó en 7, de 14 de la AR y ninguno de los 9 OA tejido sinovial. La mayoría de MECA-79 ⁺ buques mostraron una morfología VHE, pero en algunos casos, pequeñas embarcaciones con un piso endotelio también fueron etiquetados. Cinco de los 7 MECA-79 ⁺ tejidos que contengan abundante infiltrado linfocitario, que en 4 casos muestran un patrón folicular, y en 2 casos, MECA-79 ⁺ buques fueron observadas en la ausencia significativa de la infiltración (Tabla 1]. Tres MECA-79 negativos RA tejidos que contengan los infiltrados linfocíticos difuso y, en un caso, un simple infiltrado folicular.

Expresión de GlcNAc6ST-2 no se detectó en ninguno de los OA tejido sinovial. En contraste, 10 de 14 de los tejidos mostró GlcNAc6ST RA-2 por tinción de inmunoperoxidasa (Figura 2]. Se encuentra a la tinción de las células endoteliales de los vasos VHE en el sublining y, en algunas muestras, también de las pequeñas embarcaciones con piso endotelio. En algunas secciones, algunas células mononucleares perivasculares también fueron manchados. Doble MECA-79 y GlcNAc6ST-2 inmunofluorescencia mostró que todos los MECA-79 también se muestra positivo buques GlcNAc6ST-2 (Figura 1b]. Sin embargo, en una baja proporción de GlcNAc6ST-2 ⁺ buques, MECA-79 no fue detectado.

Especificidad de la inmunoperoxidasa GlcNAc6ST-2 etiquetado se confirmó mediante la sustitución normal de conejo para la IgG de anticuerpos específicos. No había manchas detectables (datos no presentados). Preincubación de la lucha contra la GlcNAc6ST-2 de anticuerpos con el péptido inmunógeno derogó la tinción (figura 2b]. También immunostained con un anticuerpo policlonal planteadas contra murino GlcNAc6ST-2 [26] y observó un patrón similar de tinción en pequeñas embarcaciones (figura 2c]. Este anticuerpo reacciona con las células del músculo liso en los medios de comunicación de los buques más grandes que atribuimos a un espurio de reactividad cruzada (datos no presentados). Inmunomarcación con este anticuerpo también fue derogado por la preincubación con murino GlcNAc6ST péptido-2 (Figura 2d].

Para analizar el posible papel de LT-αβ y TNF-α, dos citoquinas abundantemente expresado en la AR sinovial y linfoide asociado con neogenesis y GlcNAc6ST-2 expresión en modelos transgénicos [3 - 7, 26, 28], se examinaron los efectos de la La exposición a estas citoquinas en la expresión GlcNAc6ST-2 en células endoteliales humanas que carecen de la HEC fenotipo (HUVEC).

Por RT-PCR, el tratamiento con LT-αβ o TNF-α durante 8 h inducido un aumento significativo en la expresión de mRNA GlcNAc6ST-2 en HUVEC (Figura 3a]. Un efecto sinérgico del tratamiento con citocinas tanto no se detectó (datos no presentados). El tratamiento con alguna de citoquinas (interferón-γ) no modificar significativamente GlcNAc6ST-2 niveles de mRNA expresión.

Por el oeste con el blot anti-humano GlcNAc6ST-2 de anticuerpos, que hemos detectado una sola banda de 50 kD en HUVEC extractos de proteínas, en consonancia con el esperado para los humanos GlcNAc6ST MW-2 [11, 12]. GlcNAc6ST-2 la expresión de la proteína fue significativamente mayor después de 24 h de TNF-α o LT-αβ tratamiento en HUVEC (Figura 3b]. Immunofluorescent etiquetado de las culturas HUVEC con anti-humano GlcNAc6ST-2 de anticuerpos mostraron una débil, pero claramente detectable por encima de la señal no inmunes de IgG de conejo control. El pretratamiento con cualquiera de TNF-α o LT-αβ indujo un aumento claro de inmunofluorescencia perinuclear con una distribución que es característica del aparato de Golgi (Figura 3c]. Ni TNF-α ni LT-αβ tratamiento de la expresión inducida por MECA-79 epítopo en HUVEC (datos no presentados).

La presencia de MECA-79 ⁺ buques se ha informado anteriormente en humanos lesiones inflamatorias, que suelen asociarse con el desarrollo de linfoide neogenesis [21, 26]. En una variedad de condiciones inflamatorias no relacionadas (el rechazo de aloinjertos renales y de corazón, peribronchial especímenes de los asmáticos, tiroiditis, psoriasis, y la infección por H. pylori), la inducción de la MECA-79 ⁺ buques en asociación con infiltrado inflamatorio se ha demostrado [29, 32]. En algunos casos, MECA-79 ⁺ también buques pantalla VHE-aunque como la morfología plana endotelio de los vasos inflamatoria puede también expresar la MECA-79 epítopo. En la artritis crónica tejido sinovial, la presencia de VHE y MECA-79 ⁺ buques se ha demostrado [22, 23]. Recientemente, la importancia fisiopatológica de MECA-79 ⁺ buques se ha demostrado directamente en un modelo de ovejas de asma. Pretratamiento de asmáticos ovejas con administración intravenosa MECA-79 bloquearon dos fases finales de las vías respiratorias y las respuestas hiperreactividad vías respiratorias inducida por alergenos desafío vía aérea [33].

En modelos murinos de neogenesis linfoide, incluyendo modelos espontánea (NOD AKR ratón y ratón), y modelos transgénicos (PRI-PRI-BLC y LT-αβ), expresión de la MECA-79 epítopo está estrechamente relacionada con la inducción de GlcNAc6ST-2 [12, 26, 28]. Tomando ventaja de un recién generado anticuerpos humanos para GlcNAc6ST-2, nuestros resultados actuales son los primeros que muestran esta asociación en una enfermedad inflamatoria crónica en el ser humano. Varias de nuestras observaciones sugieren que la inducción de GlcNAc6ST-2 representa un evento temprano en el proceso de linfoide neogenesis sinovial en la AR. En primer lugar, GlcNAc6ST-2 se expresó en el plano y alta endotelial buques que superaron el número de MECA-79 ⁺ en buques de doble etiquetado secciones. En segundo lugar, GlcNAc6ST-2 y reactividad MECA-79 se detectaron en algunos buques que no se asociaron con los agregados linfoides, y en algunos casos, incluso en ausencia de importantes infiltración de células mononucleares. Esta última observación también sugiere que MECA-79 ⁺ buques linfoide puede contribuir a la contratación, sino que otros factores son necesarios. Esto es coherente con el modelo de multipaso transendothelial migración de leucocitos a los órganos linfoides, donde el desplazamiento de quimiocinas y endotelio mediada por la integrina adhesión de los leucocitos de rodadura se requieren [8]. La falta de expresión de MECA-79 epítopo y GlcNAc6ST OA-2 en las muestras sugiere que la escasa infiltración de los tejidos OA no es suficiente para inducir a estas características y que la AR-factores asociados son necesarios.

El desarrollo de linfoide neogenesis sinovial en la AR ha sugerido para facilitar las respuestas autoinmunes locales que permitan el desarrollo de las células B, y la producción local de autoanticuerpos y complejos inmunes formación [34 - 36]. El reciente desarrollo de las células B se agoten terapia demuestra un importante papel de estas células en la AR [37]]. La contratación de L-selectina ⁺ células dendríticas, las células B y las células T CD45RA a RA sinovial se correlaciona con la expresión de quimiocinas homing como CXCL13, CCL19 y CCL21, y la segunda parte a colocalizes MECA-79 VHE positivos [3, 38, 39]. También hemos detectado expresión de CXCL12, un realojamiento de quimioquinas abundantemente presentes en la AR-VHE en tejidos como los buques [40].

Local expresión de LT-β y TNF-α son factores importantes en la patogénesis de la AR, y el LT-β expresión se correlaciona con la expresión de quimiocinas y realojamiento linfoide neogenesis [1, 3]. El papel de LT-homing αβ y quimiocinas en la inducción de VHE ha sido sugerida por estudios en murino RIP-LT-αβ y RIP-BLC (CXCL13) los ratones que desarrollan espontáneamente los agregados linfoides y GlcNAc6ST-2 expresión en MECA-79 ⁺ buques [26, 28, 29]. El papel de esta enzima en linfoide contratación también ha sido estudiado en RIP-BLC / GlcNAc6ST-2 - / - ratones, que muestran una reducción de la infiltración linfoide [26].

Tenemos que demostrar de nuevo la inducción de la expresión GlcNAc6ST-2 también se produce a LT-αβ o TNF-α HUVEC cultivadas en la estimulación, más el apoyo a la función de LT-αβ y TNF-α, como los principales inductores de lymphogenesis extranodal. Forzadas LT-αβ expresión en modelos murinos de linfoide neogenesis induce la expresión de quimiocinas homing, lo que hace difícil diseccionar el papel de LT-αβ y quimiocinas en GlcNAc6ST-2-VHE expresión y el desarrollo [41]. Un papel para LT-αβ, que está aguas abajo de las quimiocinas, se ha observado en un modelo transgénico de BLC expresión genética o funcional de la orientación LT-αβ [42]. En modelos murinos de linfoide extranodal neogenesis, no redundante de papel LT-αβ través de la alternativa de señalización NF-κ B itinerario ha sido demostrada, mientras que el papel de TNF-α parece prescindible y ectópico LT-α no induce GlcNAc6ST expresión-2 ( 13, 28). Nuestros datos sugieren que en humanos cultivadas CE TNF-α puede contribuir a este proceso mediante la inducción de GlcNAc6ST-2 a pesar de su relevancia in vivo aún no se han decidido. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que ambos LT-αβ y TNF-α puede inducir directamente GlcNAc6ST-2 en células endoteliales cultivadas, aunque otros factores parecen ser necesarios para el pleno desarrollo de la HEC fenotipo in vitro. Uno de ellos puede ser el núcleo de extensión 1 enzima, conocida como Core1-β 3GlcNAcT, que se requiere para la formación de la MECA-79 epítopo sobre O-glicanos [29, 43]. Nuestros resultados más carbohidratos enzimas modificadoras de establecer como un importante grupo de transcripcional objetivos de citocinas durante la inflamación. El aumento de hidratos de carbono de varios sulfate glicoproteínas, incluidos los proteoglicanos heparán sulfato, CD44 y mucins las vías respiratorias, ha sido previamente demostrada en respuesta a TNF-α [44 - 46].

En la AR, TNF-α desempeña un importante papel multifuncional y en la patogénesis de la enfermedad mientras que el papel de LT-αβ es que se está estudiando actualmente [47]. La posible contribución de estos factores al desarrollo de VHE amplía el espectro de posibles patogenético funciones de esta citoquina.

MECA-79 define las glicoproteínas servir como ligandos de L-selectina durante el proceso de realojamiento de linfocitos a los ganglios linfáticos. Esta clase de ligandos también es fundamental para el tráfico de leucocitos inflamatorios y de la patología asociada, como se ha demostrado recientemente en un modelo de ovejas de asma. Anteriores experimentos en ratones han demostrado la necesidad de GlcNAc6ST-2 en la generación de la MECA-79 y el correspondiente epitopo L-selectina ligando actividad en VHE y VHE-como los buques. En este sentido, demuestran que MECA-79 ⁺ dentro de los vasos humanos RA sinovial también expresar GlcNAc6ST-2, lo que implica que firmemente esta enzima contribuye a los ligandos de estos buques. El establecimiento de la participación directa de GlcNAc6ST-2 en la formación de L-selectina ligandos en la AR VHE identificaría esta enzima como diana terapéutica potencial para inhibir el reclutamiento de leucocitos a las articulaciones. En el mismo contexto, nuestra conclusión de que el TNF-α induce GlcNAc6ST-2 en células endoteliales cultivadas puede ayudar a racionalizar la eficacia de los anti TNF-α en el tratamiento de la artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias. Además, la actividad de LT-αβ para inducir GlcNAc6ST-2 en HUVEC está probablemente relacionado con el requisito establecido para esta citocina en la formación de VHE en el desarrollo de órganos linfoides. Muchas oportunidades para futuras investigaciones son claramente indicados.

Un anticuerpo policlonal humano contra GlcNAc6ST-2 fue preparado siguiendo el mismo procedimiento seguido en la base del ratón GlcNAc6ST-2 [26]. El péptido elegido, RGKGMGDHAFHTNC, difiere de la de la correspondiente secuencia de ratón por un aminoácido (D sustituyendo Q) con la C-terminal C añadido para facilitar la conjugación. El péptido fue acoplado a KLH y se inyecta en conejos Nueva Zelanda Blanco de Covance de Investigación Productos (Denver, PA). 500 μ g de péptido conjugado se mezcla con 0,5 ml de adyuvante completo de Freund y se inyecta intradérmica, seguido de tres impulsa, cada tres semanas, con inyecciones subcutáneas de 250 μ g péptido conjugado en 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund. La posterior antisuero fue sometido a la purificación en el péptido inmunógeno junto a la agarosa utilizando el Kit SulfoLink (Biotecnología Pierce, Rockford, IL), a raíz de las recomendaciones del fabricante. El anticuerpo purificado por afinidad se lavan en Dulbecco del PBS en un Centricon 30 (Millipore, Billerica, MA) y se concentró a 0,125 mg / ml.

Tejido sinovial se obtuvieron entre el 14 de la AR y 9 de control (OA) de los pacientes en el momento de la cirugía de reemplazo de prótesis de rodilla. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado, y el estudio fue aprobado por el comité de ética del Hospital 12 de Octubre.

Los tejidos fueron congelados en el broche de PTU y almacenarse a una temperatura de -80 ° C. Humanos amígdala y los ganglios linfáticos congelados secciones se utilizaron como controles de MECA-79 y GlcNAc6ST-2 immunolabeling.

Congelados secciones (8 μ m) se fijaron durante 10 minutos en acetona fría. Doble GlcNAc6ST-2 y MECA-79 immunolabeling fue realizada por el bloqueo durante 30 minutos en el 5% de suero normal de cabra PBS, seguido de la incubación de las secciones con 1,4 μ g / ml MECA-79 mAb (IgM de rata) y 0,3 μ g / ml de conejo anti - GlcNAc6ST humanos-2 a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavado en PBS, una secundaria con biotina de cabra anti-IgG de conejo a 1,3 μ g / ml se añadió (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA). Fluorescencia se desarrolló con 1,5 μ g / ml Cy3-conjugado de cabra anti-IgM de rata y 1,8 μ g / ml Cy2-conjugado streptavidina (Jackson Immunoresearch Laboratories).

La tinción de inmunoperoxidasa se realizó por la noche a la mañana de incubación a 4 ° C, ya sea con anti-humano o anti-ratón GlcNAc6ST-2. Peroxidasa endógena fue bloqueada en el 0,3% de H ₂ O ₂ en metanol. Inmunoperoxidasa detección se realizó por el método ABC de acuerdo con el fabricante (Vectastain ^®, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Actividad peroxidasa fue desarrollado por diaminobenzidine sustrato y diapositivas se counterstained en Gills hematoxilina. Con los controles no inmunes de IgG de conejo en la misma concentración como anti-humana anti-ratón o GlcNAc6ST-2 anticuerpos fueron incluidos. Se realizaron controles adicionales por preincubating secciones con humanos o de ratón GlcNAc6ST péptido-2 a 10 μ g / ml. Para garantizar idénticas condiciones, la OA y RA secciones fueron montadas en la misma diapositiva diapositivas y todos fueron procesados en paralelo.

Humanos de la vena umbilical células endoteliales (HUVEC) se preparan a partir de cordones umbilicales y de la digestión por la colagenasa fueron propagadas en medio 199 (Life Technologies, Paisley, Escocia), con 20% de FCS. Cultivos celulares se caracterizaron como CE por citometría de flujo con anti-células endoteliales de anticuerpos P1H12 (Chemicon Internacional, Temecula, CA). La presencia de HEC en estas culturas fue excluido por citometría de flujo con MECA-79 mAb.

HUVEC cultivos fueron estimulados con cualquiera de 25 ng / ml de TNF-α, de 20 ng / ml de LT-α1/β2, o de 200 ng / ml de interferón-γ (R & D Systems, Inc, Abingdon, Reino Unido) por 8-24 H y el total de ARN o proteínas se extrajeron. Por immunofluorescent detección de GlcNAc6ST-2, se HUVEC cultivadas en vaso coverslips y tratadas de manera similar. Coverslips fueron fijadas con paraformaldehido 4% y immunofluorescent detección de GlcNAc6ST-2 se realizó como se describió anteriormente para las secciones de tejidos.

RT-PCR se realizó en cDNA sintetizado a partir del 1 μ g de RNA total de la CE de las culturas usando las siguientes GlcNAc6ST oligonucleótidos-2: aguas arriba 5'-GCAGCATGAGCA AAAACTCAAG-3 'y 5'-abajo TCCAGGTAGACAGAAGATCCAG-3', y β-actina oligonucleótidos aguas arriba 5'-CTACCTCATGAAGATCCTCAC-3 'y 5'-abajo GTCCACGTCACACTTCATGATG-3'. Supervisión en tiempo real de las reacciones de PCR se realizó en un instrumento Roche LightCycler, utilizando SYBR Green I kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). La especificidad de los amplicones se verificó por electroforesis en la que demostró único transcripciones de 449 pb (GlcNAc6ST-2) y 303 pb (β-actina) como se esperaba. Para la cuantificación relativa, se calculó el n veces la expresión diferencial Δ C por el método _t (Ct denota el umbral del ciclo de amplificación de PCR en la que el producto se detectó por primera vez por fluorescencia) que compara la cantidad de amplificación de genes blanco, normalizado a la β-actina Endógena referencia a lo descrito previamente [27].

Western blot detección de GlcNAc6ST-2 se realizó en HUVEC extractos de proteínas (50 μ g) electrophoresed en un 10% por electroforesis en gel de poliacrilamida y transferidas a filtros de nitrocelulosa. Membranas se incubaron durante la noche, ya sea con conejo anti-humano GlcNAc6ST-2 o el control anti-β actina (clon AC-15, Sigma-Aldrich Química, España) anticuerpos en el 5% sin grasa leche en polvo-TBST. Los filtros se lavaron y se incubaron durante 1 h con anticuerpos secundarios ligados a peroxidasa de 0,08 μ g / ml (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Bandas se visualizaron por un mejor sistema de chemiluminiscence (Pierce, Rockford, IL).

JLP llevó a cabo el immunodetection estudios y participó en el diseño del estudio y la coordinación. BS realizó los estudios en células endoteliales cultivadas. MG GP y participó en la selección de los pacientes, y la recolección y preparación de los tejidos sinoviales. DT y los anticuerpos SMS preparado y desarrollado técnicas de la immunodetection. DEG participado en el diseño y la coordinación del estudio. Todos los autores contribuyeron a la redacción del manuscrito y han leído y aprobado la versión final.