Filaria Journal, 2005; 4: 1-1 (más artículos en esta revista)

Frecuentes de la detección del gusano de los movimientos en onchocercal nódulos por ecografía

BioMed Central
Sabine Mand (mand@parasit.meb.uni-bonn.de) [1], Marfo-Yeboah Debrekyei (kccr@africaonline.com.gh) [2], Alex Debrah (adebrah@parasit.meb.uni-bonn.de ) [2], Marcelle Buettner (marcelle.buettner @ t-online.de) [3], Linda Batsa (kccr@africaonline.com.gh) [2], Kenneth Pfarr (pfarr@parasit.meb.uni-bonn. De) [1], Ohene Adjei (oadjei@africaonline.com.gh) [4], Achim Hoerauf (hoerauf@parasit.meb.uni-bonn.de) [1]
[1] Departamento de Parasitología, Instituto de Parasitología Médica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Bonn, Bonn, Alemania
[2] Departamento de Parasitología, Kumasi Centro de Colaboración para la Investigación (KCCR), Kumasi, Ghana
[3], Hamburgo, Alemania
[4] Departamento de Microbiología de la Universidad de Ciencia y Tecnología (UST), Kumasi, Ghana

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Resumen
Antecedentes

Ecografía (SGA) es conocido por ser una herramienta adecuada para el diagnóstico de la filariasis linfática como el adulto nematodo filarial Wuchereria bancrofti escrotal en los vasos linfáticos de los hombres infectados pueden ser detectados por el patrón característico de circulación, la Filaria Danza Sign. En la oncocercosis, gusanos adultos en movimiento todavía no se han demostrado por USG. Además de la verificación de los efectos de drogas sobre la vida de adultos Onchocerca volvulus filariae en los juicios se ve obstaculizada por la falta de instrumentos para la observación longitudinal de las alteraciones inducidas por drogas potencialmente macrofilaricidal in vivo. El presente estudio fue realizado para determinar la frecuencia de detección de movimiento filariae adultos de O. Volvulus por SGA.

Métodos

En una región endémica de oncocercosis en Ghana, 61 pacientes infectados con la oncocercosis fueron reclutados por palpación y onchocercomas examinados por SGA utilizando un sistema de ultrasonidos equipado con un 7,5 - transductor lineal de 10 MHz. Onchocercomas fueron grabadas en cinta de vídeo y evaluados con respecto a la ubicación, el número y tamaño, así como a los movimientos de los adultos filariae.

Resultados

En los 61 pacientes se encontraron 303 onchocercomas por palpación y 401 onchocercomas fueron detectados por SGA. En 18 de 61 pacientes (29,5%), con un total de 22 nódulos en movimiento para adultos O. Vólvulo filariae se detectaron y se presentan en el ultrasonido imágenes animadas como mp-4 videos.

Conclusión

Ultrasonographical exámenes de onchocercomas donde viven adultos filariae puede mostrarse puede servir como un nuevo instrumento para la observación in vivo longitudinal de los pacientes con oncocercosis, en tratamiento y como un complemento de la evaluación histológica.

Antecedentes

La oncocercosis es endémica en 37 países y alrededor de 18 millones de personas están infectadas en África y América Latina. Salud organizaciones están procurando eliminar la oncocercosis como un importante problema de salud pública. Programa de Lucha contra la Oncocercosis (OCP) ha dirigido con éxito la transmisión de control de los vectores (mosca negro), pero este programa finalizó en 2002. Dentro del ámbito del Programa Africano de Lucha contra la Oncocercosis (APOC), el tratamiento anual de la masa con la ivermectina microfilaricidal de drogas se lleva a cabo. Sin embargo, la eliminación de la transmisión ha resultado más difícil de lo esperado [2]. En una reciente conferencia llegó a la conclusión de que no sea posible la erradicación con las herramientas actuales [4], y que se necesitan nuevos medicamentos. Junto a la indirecta parámetro de microfilarias contar, una intervención quirúrgica (nodulectomies) que se necesita para comprobar los efectos de las drogas sobre la vitalidad y la fertilidad de los adultos Onchocerca volvulus después del tratamiento.

Por lo tanto, existe una necesidad urgente para el desarrollo de fármacos más eficaces que cualquiera de matar o largo plazo esterilizar los gusanos adultos. Además, sería útil disponer de una herramienta no invasiva para proporcionar repetible longitudinales de observación de alteraciones de la vitalidad y motilidad de los gusanos macrofilaricidal potencialmente inducidos por drogas.

Diferentes a los ordinarios de detección y observación longitudinal de los movimientos del gusano (Filaria Danza Registrarse-FDS) en los vasos linfáticos en la filariasis de Bancroft [1, 6, 7] filariae móviles adultos de la especie O. Vólvulo en onchocercoma tejidos no han sido mostradas hasta la fecha por la ecografía. Por lo tanto, la utilidad de SGA en relación con la frecuencia de detección de los adultos que viven O. Vólvulo filariae se evaluó en el presente estudio. El examen no invasivo SGA-método constituye, por un lado, la oportunidad para la observación longitudinal, en términos de número y tamaño de onchocercomas y por otro lado repetible exámenes para observar alteraciones en la movilidad de adultos O. Vólvulo filariae in vivo.

Materiales y Métodos

El estudio fue parte de una doble ciego, controlados con placebo de tratamiento con doxiciclina estudio llevado a cabo en el Bajo Denkyira Distrito, en la región central de Ghana. Este estudio fue aprobado por el Comité de Derechos Humanos y Ética de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas en KNUST, Kumasi, Ghana. El estudio se ajusta a los principios de la Declaración de Helsinki de 1975 (como revised1983 y 2000).

Sitio de estudio y de los pacientes

Después de la explicación detallada sobre el estudio en el idioma ghanés twi, los pacientes fueron seleccionados previamente por palpación de los nódulos gusano. El número y la ubicación de palpado onchocercomas paciente se documentó en las formas. 61 participantes, que no habían recibido tratamiento antifilárico dentro de los últimos 2 años, fueron examinados por ultrasonografía antes de recibir tratamiento con placebo o doxiciclina. De acuerdo con el protocolo de estudio, todos los pacientes también recibieron la ivermectina ivermectina 150 μ g / kg de peso corporal - 4 meses después de iniciar el estudio.

Para determinar microfilaria carga antes del tratamiento, dos snips piel de la parte superior de cada glúteo fueron tomadas con un corneoscleral (Holth) punch (Koch, Hamburgo, Alemania). Cada piel snip fue pesado con una balanza analítica (sartorio balanza electrónica, Göttingen, Alemania). Microfilarial carga fue calculado por mg / piel.

La piel snips fueron incubados a temperatura ambiente en 100 μ l de NaCl 0,9% para 6 - 20 horas en separar los pozos de una ronda de 96 pozos de fondo placa de microtitulación (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Microfilarias fueron contados después de una incubación de 63 veces el uso de un microscopio de aumento.

La ecografía

Se realizaron exámenes de ultrasonido antes del tratamiento se inició mediante un SonoSite 180 Plus ® (SonoSite Inc; Washington, EE.UU.), equipado con un L38 mm 5 MHz - transductor lineal de 10 MHz. Para el examen ecográfico de la onchocercomas, las frecuencias de 7,5 MHz y 10 fueron utilizados. Una videocámara digital SONY DCR-PC120E PAL Handycam ® (Sony Corporation, Japón) está directamente conectado a la máquina de ultrasonido para grabar vídeos en tiempo real de las cintas mini DV para la documentación de los hallazgos. Los pacientes fueron examinados en una posición supina con el fin de evitar artefactos debido a los movimientos. El examinador observó cada nódulo en longitudinal y transversal de las exploraciones para detectar los movimientos de los adultos filariae. En primer lugar, el transductor se coloca en el mayor diámetro de un nódulo o en la mayor zona libre de eco en caso de los nódulos quísticos. Posteriormente, la imagen fue llevada a cabo en el panorama de modo que se facilite más información. Cada detectado onchocercoma se midió en las dos dimensiones b-modo para la longitud y el ancho en la mayor diámetro, el examinador podría ajustar. Nódulos se mide en total - incluyendo la cápsula, que consiste en tejido conectivo. La detección de todos los onchocercomas fue grabado en cinta de vídeo y más tarde en comparación con el número de nódulos detectados por palpación. El vídeo de la documentación también se utilizó para evaluar los nódulos con gusanos en movimiento con respecto al número, el tamaño, motilidad, echo en zonas libres de onchocercomas como signo de los procedimientos necrótico y sombreado acústico, que refleja el movimiento y estática fragmentos de los gusanos.

Resultados
Los participantes del estudio

Se analiza un grupo de 44 hombres y 17 mujeres participantes. El rango de edad de 19-61 años. A todos los pacientes se les realizó pruebas de microfilarial carga que iba de 0 - 290 mf / mg de piel (geom. significa 11,21 mf / mg). En total fueron 356 onchocercomas palpado, mientras que 401 (geom. significa nódulos 5,140 / por paciente) se detectaron por onchocercomas SGA en el que participan 61 pacientes. En varones, un total de 272 (geom. media 5.417) fueron nódulos palpado mientras que 303 (geom. media 6.010) fueron detectados por el Gobierno de los Estados Unidos, en pacientes de sexo femenino 84 (geom. media 4.487) onchocercomas se palpado y 98 (geom. media 5.210) Se detectaron por SGA (cuadro 1].

Correlación de palpación y SGA

Onchocercomas podrían diferenciarse claramente de los ganglios linfáticos, donde un sinusal fue visible con aferente y eferente los vasos linfáticos, y de lipomas, que parece más brillante, más densa y homogénea eco que onchocercomas. Cuerpos extraños, como trozos de metal, piedras o espinas pueden ser diferenciados de onchocercomas debido a su fuerte señales, que son el resultado de sus fronteras bien definidas y de los tejidos que rodean granuloma.

Todos palpado nódulos pueden ser detectadas por SGA. En 23 pacientes el número de nódulos detectados por palpación corresponde con el número de onchocercomas detectado por SGA. En 26 pacientes se detectaron más onchocercomas por SGA que por palpación. Estos onchocercomas eran de un tamaño más grande y perfectamente empaquetado en un torno de la cápsula de tejido conectivo. SGA por el examinador fue capaz de distinguir con mayor precisión el número exacto de los nódulos, dividido por septulae de tejido conectivo dentro onchocercomas más grandes. SGA, de 12 pacientes que presentaron una menor onchocercomas palpado: 2 lipomas, 2 cuerpos extraños y 8 de los ganglios linfáticos se había juzgado erróneamente como onchocercomas por palpación. El 2 doloroso cuerpos extraños, que fueron vistas por SGA, fueron extirpados y verificado.

Reproducibilidad de los resultados de SGA

3 pacientes fueron sometidos a examen, el 3 de SGA días consecutivos en el primer tiempo-punto (inicio del estudio). Todos onchocercomas se detectaron en los mismos lugares y juzgados como onchocercomas. 45 de los 61 pacientes fueron sometidos a estudio de una segunda ecografía confirmatoria 4 meses después de iniciar el estudio. Todos los nódulos juzgado como onchocercomas por SGA al comienzo del estudio pueden ser redescubierta y todavía demostrado ser onchocercomas. 30 de los 45 SGA reexaminada nodulectomies pacientes fueron sometidos en este momento a punto. Después de nodulectomies no más onchocercomas eran visibles por SGA en lugares que se sabe que son positivos para esas conclusiones antes.

Medición de la onchocercomas

El tamaño de los nódulos medido por SGA varió de 0,18 cm 2 a 9,44 cm 2 (geom. media 1,823, la mediana 1.78). Evaluación total de la zona de sección transversal (cm 2) de todos los nódulos miden por paciente mostró que los nódulos eran mayores en los pacientes de mayor edad (figura 6]. No hubo relación significativa entre la edad y la aparición de nódulos quísticos, donde el gusano de los movimientos pueden ser documentados por SGA (Mann-Whitney U test: p = 0,1989). Tomo mediciones de la onchocercomas no se hace desde este habría sido inexacta con un dispositivo de 2 dimensiones. Por lo tanto 3 dimensiones escáneres de ultrasonido son necesarios.

Los pacientes con onchocercomas contengan móviles adultos filariae

En 18 de 61 (14 varones, 4 mujeres) participantes (cuadro 2], el 22 de onchocercomas con movimiento filariae adultos fueron observados por SGA. 15 pacientes tenían un nódulo, 2 pacientes tenían nódulos 2, y 1 paciente tenía 3 nódulos filariae con vida. Anatómica sitios en los nódulos quísticos se detecten se tórax, trocánter, cresta ilíaca, crena analis, rodilla y pie (talón). La distribución de frecuencias de los movimientos del gusano onchocercomas donde se puede observar la figura en el cuadro 3. Los gusanos adultos viven fueron visibles como la mejora acústica (de eco luminoso) de los tejidos en movimiento se refleja en el eco de las zonas libres de onchocercomas (ficheros adicionales 1, 3] y en un caso en el tejido nodular hipodensa (ficheros adicionales 2]. El eco libre de las partes del nódulo previsto el llamado "ventana acústica", donde los movimientos de gusano podría ser visto fácilmente (figura 2A, 2B, 3B, 4A, de ficheros adicionales 1, 3], en comparación con los nódulos donde se embalan los gusanos adultos Herméticamente en una cápsula de tejido conectivo (figura 1A, 1B, 3A, de ficheros adicionales 2]. En el eco de zonas libres de movimiento apareció como adultos filariae y retorcidas en espiral alrededor de las estructuras se desplazan unos a otros en el fluido circundante. El eco de zonas libres de difería de una parte muy pequeña de los nódulos de las áreas que comprende el conjunto de nódulos (figura 2A, 2B, 3B, 4A, 4B archivo adicional 1, 3].

Además de la movilidad de adultos filariae, todos los nódulos quísticos que figuran partes de degenerado probablemente fragmentos de gusanos adultos, de forma que las partículas del haz de ultrasonido no puede transitar y se refleja y visible como doble capas en movimiento en el líquido quístico (figura 4A, de ficheros adicionales 3].

La onda de pulso como se describe la técnica Doppler para la detección de adultos filariae de Wuchereria bancrofti [8, 14] fue utilizado para visualizar los movimientos de la vida de los gusanos O. Vólvulo en función del tiempo y la frecuencia, que sin embargo parece lento y poco frecuentes en comparación con los adultos filariae en los vasos linfáticos. Así, la pertinencia de la onda de pulso Doppler técnica parece menos importante que la observación y la confirmación de la oncocercosis en comparación a los exámenes en la filariasis de Bancroft.

Correlación con la histología

Un análisis preliminar de onchocercomas por histología, confirmó los resultados sobre la proporción de los gusanos adultos en vivo desde un estudio anterior (85%) [10], que se basa en la misma área endémica. Los datos muestran claramente que la mayoría de gusanos móviles no son vitales, pero que los gusanos adultos no son detectables y no aparecen como gusanos móviles por SGA. Las razones pueden ser que i) los gusanos son demasiado herméticamente envasadas en tejido de acogida a aparecer móviles, ii) el tejido conectivo que rodea a la onchocercomas es gruesa y, por tanto, refleja el haz de ultrasonido de la cápsula, pero no dentro de los gusanos.

De los 18 pacientes que presentan nódulos quísticos con movilidad gusanos, 8 pacientes fueron examinados de nuevo después de 4 meses antes de la mencionada nodulectomies. Todos los nódulos quísticos podría ser redescubierto en el mismo lugar y todavía figura en movimiento filariae adultos.

Para correlacionar estos hallazgos en la histología 3 de los pacientes que presentan nódulos sometidos a los movimientos con visible nodulectomies. En quística onchocercomas adultos filariae se encontraron por la histología (figura 5 A-C]. Un núcleo es visible en la hipodermis de los gusanos y intacta microfilarias son visibles en el interior del útero como signo de vitalidad en el momento de punto de nodulectomy.

Discusión

En el presente estudio, la oncocercosis pacientes fueron examinados por ultrasonografía para determinar la frecuencia de detección de los adultos que viven O. Vólvulo en onchocercomas. El estudio actual es una mejora con respecto a los intentos anteriores de detectar gusanos en onchocercomas ya que proporciona vídeo de la documentación de los movimientos y el gusano muestra que, con la disponibilidad de transductores de mayor resolución, la frecuencia de detección de gusanos que contienen gusanos adultos en movimiento es sorprendentemente alta. En 18 de 61 (29,5%) de los pacientes examinados, 22 onchocercomas con movimiento de adultos filariae se detectaron.

Los ensayos clínicos para verificar potencialmente macrofilaricidal efectos de las drogas que actualmente carecen de métodos para repetibles a largo plazo de observación de los adultos que viven filariae en onchocercomas in vivo. El uso de la ecografía para observar onchocercomas ha sido poco frecuente, puesto que los movimientos de los gusanos adultos en nódulos incrustados rodeados de tejido conectivo son difíciles de imagen. De hecho, sólo hay uno de los casos enumerados en la literatura donde se desplazan los gusanos adultos se detectaron [5]. Homeida et al. [11] describió por primera vez el uso de SGA onchocercomas para detectar en los pacientes. Poltera y Zak [16], publicada en 1988, un ultrasonido estudio sobre onchocercomas, en el que se describe la capacidad de utilizar el Gobierno de los Estados Unidos para observar alteraciones en el tejido de nódulos después de que el tratamiento in vitro. Leichsenring et al. [12] evaluó en 1990 el uso de exámenes de ultrasonido en pacientes con respecto a un instrumento adecuado para la observación longitudinal, en virtud de las condiciones de tratamiento, sin embargo no mostraron movimientos de los gusanos. La mayor sensibilidad de la detección de nódulos por SGA en relación a la palpación y la capacidad de diferenciar entre onchocercomas y lipomas, ganglios linfáticos y órganos extranjeros ha informado [12]. En 1994 Darge et al. [5] describió que el gusano distintos movimientos observados en 1 de 249 nódulos detectados de su grupo de pacientes en Liberia.

Un movimiento de la documentación de animación para adultos de O. filariae Volvulus por vídeo no ha sido publicado hasta la fecha. Debido a la mejora de la sensibilidad actual de las máquinas de ultrasonido, así como la técnica de vídeo digital hemos sido capaces de detectar y registrar en casi el 30% de los participantes del estudio 1 al 3 de onchocercomas contienen en movimiento, filariae adultos de O. Vólvulo. Aunque se ha observado (Prof. Buettner, Instituto Bernhard Nocht de Medicina Tropical de Hamburgo, comunicación personal), que parecen convertirse en onchocercomas quística en el transcurso del tiempo, y que los gusanos mueren por su parte en el cuerpo mientras que el prosoma y el jefe de El gusano seguir avanzando en el líquido quístico, no hemos encontrado una correlación entre la aparición de gusanos en movimiento en los nódulos y la edad de los pacientes (18-61 años, de Mann-Whitney U test: p = 0,1989). Esto se debe probablemente al hecho de que en nuestra zona de estudio, la transmisión sigue siendo elevada a pesar de la aparición de la ivermectina en masa y, por tanto, el tratamiento, los pacientes más jóvenes, incluso ya hemos mostrado un considerable número de nódulos quísticos. Podría ser posible que el número de nódulos quísticos es mayor en las zonas donde ha habido varias rondas de MDA resultando en la reducción de la transmisión y, por lo tanto, a lo largo de edad nódulos.

Efectos de las drogas que actualmente son verificadas por los exámenes histológicos de los nódulos después de la cirugía mínimamente invasiva (nodulectomy). Gusanos pueden ser evaluadas en relación con el número de hombres y mujeres gusanos, el tamaño, la embriogénesis y spermiogenesis [3]. Immunohistology se utiliza para determinar si estaban vivos antes de gusanos nodulectomy. Para ello, las secciones de los nódulos pueden ser manchadas por ejemplo, con los anticuerpos contra la O. Vólvulo GST1 (Glutatión S-transferasa) y Yersinia hsp 60 (proteína de choque térmico), esta última reacción cruzada con mitocondrial hsp 60 en los gusanos [10, 13]. GST1 y mitocondrial hsp sólo 60 son producidas por los gusanos que viven y se presentan como una fuerte tinción en la hipodermis.

La evaluación de tratamiento por el uso de (inmuno-) histología tiene el inconveniente de que sólo hay un único punto de tiempo para el examen, que no pueden ser repetidos y no puede ser llevado a cabo en diferentes puntos del tiempo. En contraste, el uso de SGA ofrece una no invasiva, rentable herramienta, que permite la observación en tiempo muchos puntos, pero tiene el inconveniente de que los gusanos adultos de O. Vólvulo se espiral que se enrolla en sí y no parece posible determinar su número y su sexo, aunque el sexo masculino son los gusanos sólo 3-5 cm de largo, en comparación con las mujeres filariae con una longitud de 30-80 cm.

SGA no es un sustituto de la immunohistology. Con SGA es imposible evaluar la embriogénesis y la espermatogénesis de los adultos filariae. Además, el Gobierno de los Estados Unidos puede proporcionar cualitativos, no cuantitativos información sobre el gusano en el número de nódulos. Otra desventaja de Gobierno de los Estados Unidos es que sólo una fracción de los gusanos que demostrar "vital" en la histología es capaz de mostrar los movimientos, ya sea debido a la densidad del tejido de acogida, o debido a la eco denso tejido conectivo que rodea a la onchocercoma. No obstante, aunque el número de gusanos onchocercomas donde la movilidad podría ser detectado parece ser pocos (5,5%), el hecho de que el 29,5% de los pacientes son portadores de nódulos quísticos con movilidad filariae ofrece la posibilidad de que a largo plazo la observación de la vitalidad de gusanos In vivo en un número razonable de los humanos infectados. Por lo tanto, la información proporcionada por el Gobierno de los Estados Unidos puede resultar útil para la evaluación de medicamentos potencialmente macrofilaricidal y tiene la ventaja de ser no invasivo. Este último punto es importante, ya que el cumplimiento de los pacientes es mucho mejor en los casos en que una lesión sea el método utilizado.

Conclusión

Ultrasonographical examen de onchocercomas quística que contiene vida adulta filariae puede servir como un nuevo instrumento en la observación longitudinal de los pacientes con oncocercosis como un complemento de la evaluación histológica. SGA también puede facilitar los ensayos clínicos en términos de la observación de las actividades macrofilaricidal con respecto a los efectos que se han pasado por alto antes (por ejemplo, altas dosis de ivermectina repetidas tratamiento).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

S. Mand pacientes reclutados, que los exámenes de ultrasonido, compilado los datos y escribió el documento de proyecto. Y. Marfo-Debrekyei, A. L Batsa Debrah y llevó a cabo la piel snips y la microfilaridermia contar. Ellos realizan el manejo del paciente en el proceso de contratación y exámenes de ultrasonido. M. Buettner pacientes reclutados, realiza exámenes físicos, y llevaron a cabo el tratamiento. K. Pfarr ayudado en la preparación manuscrito y ofrecieron comentarios constructivos. O. Adjei hizo estudios preparatorios para la adecuada selección de las aldeas, las negociaciones con los ancianos de la aldea, y se lleva a cabo la aprobación ética. A. Hoerauf diseñado y supervisado el estudio, participaron con el reclutamiento de pacientes y exámenes de ultrasonido, los datos compilados y editados el manuscrito de la versión final.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Transversal de la exploración del paciente cresta ilíaca derecha. Un gran onchocercoma con una pequeña área quística (eco-libre - negro - zona) se puede ver. Dentro de este área quística movimientos de los adultos filaria (e) son visibles. Fragmentos del cuerpo del gusano pueden verse como una doble capa de membrana. La correspondiente imagen puede verse como la figura
2B
Archivo Adicional 2
Longitudinal de la exploración del paciente trocánter derecho. Un homogéneo de tamaño mediano onchocercoma se puede ver. Aunque no hay quística - zona libre de eco, el gusano de los movimientos se presentan en la modalidad b-imagen (flecha). Lateral sombras y una pared posterior reflexión son visibles. La correspondiente imagen puede verse como la figura
3A
Archivo Adicional 3
Transversal de exploración de la rodilla izquierda del paciente. Un gran onchocercoma quística se puede ver. De los movimientos en espiral de un conglomerado de adultos filariae se exhiben en el líquido quístico de los nódulos. Static fragmentos de los gusanos son visibles en la parte inferior izquierda de la imagen de video. La correspondiente imagen puede verse como la figura
4A
Agradecimientos

Queremos dar las gracias a todos los participantes del estudio por su paciencia durante los exámenes de ultrasonido. También queremos dar las gracias a las personas del Distrito de Gestión de la Salud Dunkwa sobre Offin, Baja Denkyira distrito, región central de Ghana por su cooperación. Tenemos la obligación de los miembros de la Kumasi Centro de Colaboración para la Investigación (KCCR), Kumasi, Ghana, por su apoyo durante los años de estudio. Estamos agradecidos por el apoyo financiero de la Comisión de la Unión Europea (UE a la concesión ICA4-2002-10051)