Journal of Experimental & Clinical Assisted Reproduction, 2005; 2: 4-4 (más artículos en esta revista)

Mecanismos moleculares en el epitelio uterino durante trofoblasto vinculantes: el papel de la pequeña GTPasa RhoA humanos en células uterinas Ishikawa

BioMed Central
Carola Heneweer (carola.heneweer @ uni-essen.de) [1], Martina Schmidt (martina.schmidt @ uni-essen.de) [2], Hans-Werner Denker (denker@uni-essen.de) [1] , Michael Thie (thie@caesar.de) [1]
[1] Instituto de Anatomía, Hospital de la Universidad de Essen, Alemania
[2] Instituto de Farmacología, Hospital Universitario de Essen, Alemania
[3] Stiftung caesar, Bonn, Alemania

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Resumen
Antecedentes

La implantación del embrión exige epitelio uterino que se desarrolla la competencia para obligar a su trofoblasto apical (gratuito) polos. Este elemento esencial de la receptividad uterina parece depender de una desestabilización de la polaridad apico-basal de epitelio endometrial. En consecuencia, una reorganización del citoesqueleto de actina regulada por la pequeña GTPasa RhoA desempeña un papel importante en el epitelio uterino humanos RL95-2 por la unión de las células humanas trophoblastoid JAR células. Ahora obtenido nueva información sobre el uso obligatorio trofoblasto humano Ishikawa células del epitelio uterino.

Métodos

Ishikawa polaridad de las células fue investigado por microscopía electrónica, apical adhesividad fue probado por la adhesión de ensayo. Los análisis de la distribución subcelular de actina filamentosa (F-actina) y RhoA en apical de células basales y de los polos se realizaron por microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) con y sin carácter vinculante de JAR esferoides, así como con y sin inhibición de la pequeña Rho GTPasas por Clostridium Difficile toxina A (toxina A). En este último caso, la distribución subcelular de RhoA, además, fue investigado por Western Blot.

Resultados

Ishikawa células para expresar apical adhesividad JAR esferoides y moderada apico-basal de polaridad. Sin contacto a JAR esferoides, significativamente mayores intensidades de señalización de la F-actina y RhoA se encontraron en el basal, en comparación a los polos apical en las células de Ishikawa. RhoA se distribuyen por igual entre la membrana y la fracción citosólica de la fracción. Los niveles de F-actina y RhoA señales convirtió igualaron en la apical y basal regiones en contacte a JAR esferoides. Después de la inhibición de Rho GTPasas, Ishikawa células permanecieron adhesivo para JAR esferoides, la gradiente de las señales de fluorescencia de F-actina y RhoA se mantuvo en tanto que la suma se redujo de RhoA en la fracción citosólica con un aumento comparable en la fracción de membrana.

Conclusión

Ishikawa células responder a JAR de contacto, así como al tratamiento con toxina con una reordenación de la F-actina y los pequeños GTPasa RhoA pero parecen ser capaces de modificar las vías de señalización de una manera no aclarada hasta la fecha en las células del endometrio. Esta capacidad puede estar vinculado con el grado de organización polar observada en las células que indican Ishikawa un papel esencial de la modificación en el fenotipo celular apical adhesividad de epitelio uterino de trofoblasto in vivo.

Antecedentes

La implantación del embrión humano es una compleja secuencia de acontecimientos que se inicia con la adhesión de blastocisto al endometrio revestimiento del útero receptivo. Con el fin de permitir la adhesión, las células del epitelio uterino desarrollar la competencia para obligar a sus trofoblasto apical (gratuito) polos [revisado por [1 - 4]]. Este estado receptivo de las células del útero se caracteriza por numerosas modificaciones celulares incluido un reducido espesor de la glucocálix y un cambio de la composición de proteínas y glicoproteínas en su membrana plasmática apical [5 - 8]. También los compartimentos laterales y basal de estas células están involucradas en esas transformaciones que muestra por ejemplo, una mayor profundidad y complejidad geométrica de los cruces apretado lateralmente y un reducido contacto con el sustrato en los polos de células basales [revisado por [2]]. Además, la organización de la célula de la arquitectura y los sistemas de señalización parecen ser modificado [3, 9 - 16]. Estas modificaciones apuntan a una reducción o la desestabilización de apico-uterino basal polaridad de las células epiteliales de los preparativos para la adhesión de trofoblasto en los primeros meses de la implantación del embrión [2, 17 - 19].

Con el fin de conseguir obtener información más detallada de los procesos moleculares en las células del epitelio uterino en el momento del contacto con el trofoblasto, hemos establecido un modelo in vitro de la simulación de esta célula a célula de contacto [20 - 22]. Utilizamos multicelulares esferoides de células humanas trophoblastoid JAR como modelo de blastocisto trofoblasto. Estos esferoides se entregan en monocapas de epitelio uterino humanos RL95-2 células que actúa como un modelo para el receptivo epitelio uterino. Hemos demostrado que la formación estable de la célula a célula bonos depende en este modelo RL95-2 en células' citoesqueleto de actina (F-actina) y las pequeñas GTPasas de la familia Rho, más probable es que RhoA. Los datos sugirieron que la activación de las Rho GTPasas y coordinados en la reordenación de F-actina en el apical y la basal del epitelio uterino polos de las células en respuesta a trofoblasto vinculantes son parte de un generalizado de reorganización estructural y funcional de la arquitectura celular de las células del epitelio uterino [ 23 - 25].

Aunque RL95-2 células han demostrado un instrumento útil para estas investigaciones, por ejemplo, relativas a la interacción entre los eventos de transducción de señales y citoesqueleto [14, 23], este modelo puede ser criticado desde estas células rígidamente estable y expresar un no-polar fenotipo epitelial [21 , 22]. Por lo tanto, ellos no imitan exactamente el epitelio uterino in vivo que desestabilizan y parcialmente abajo-regula (pero, sin embargo, mantiene un grado de) apico-basal de polaridad en la receptividad. Por lo tanto, un modelo optimizado debe constar de un humano de células del epitelio uterino línea que ha mantenido polar organización a un mayor grado de RL95-2 células, pero sí permite trofoblasto archivo adjunto, a fin de simular la situación in vivo más de cerca. Como se muestra en la presente comunicación, Ishikawa células [26] cumple con estos criterios, al menos en cierta medida. Además, esta línea celular representa un posible modelo alternativo de los procesos implicados en la implantación del embrión humano [27 - 30].

Los datos muestran que las células Ishikawa responder a JAR de contacto, así como al tratamiento con toxina con una reordenación de la F-actina y una redistribución de la pequeña GTPasa RhoA. Sin embargo, esta reorganización se diferencia en varios aspectos de las características conocidas de la reacción de otras células endometriales modelo investigado hasta el momento, por ejemplo, las células RL95-2 [24, 25]. Esto se debe probablemente a la expresión de un fenotipo específico polar por Ishikawa células que indican una función esencial de la modificación en el fenotipo celular apical adhesividad de epitelio uterino de trofoblasto in vivo.

Métodos
Anticuerpos fluorescentes y tintes

Mouse anticuerpo monoclonal contra RhoA (26CH: sc-418) se adquirió de Santa Cruz de Biotecnología (Heidelberg, Alemania). Mouse anticuerpo monoclonal contra E-Cadherin (C20820) se obtuvo de Transduction Laboratories (Heidelberg, Alemania). Mouse anticuerpo monoclonal contra la subunidad α v integrina (0770) se obtuvo de Dianova (Hamburgo, Alemania). 5-Chloromethylfluorescein diacetato (CMFDA, Cell Tracker Verde; C-2925), la secundaria anticuerpos AlexaFluor 488 cabra anti-ratón IgG (A-11001), AlexaFluor 488 cabra anti-IgG de rata (A-11006) y AlexaFluor 633 cabra anti - Mouse IgG (A-21.052) se obtuvieron a partir de sondas moleculares / MoBiTec (Goettingen, Alemania). Tetramethylrhodamine isotiocianato (TRITC)-conjugado phalloidin se obtuvo de Sigma (Taufkirchen, Alemania).

Cultivo de células

El cáncer de endometrio humanos línea celular Ishikawa se derivan de un adenocarcinoma de endometrio [26], y se cultivó a lo descrito previamente por el grupo de Schulz [31, 32] a partir de la cual se obtuvieron las células. Las células se mantuvieron en medio Dulbecco MEM (Gibco, Eggenstein, Alemania) suplementado con 15% FCS, 5 ml de L-glutamina, 100 U / ml penicilina y 100 μ g / ml estreptomicina (Boehringer, Mannheim, Alemania). Para los experimentos de microscopía electrónica, las células fueron cultivadas en poli-D-lisina revestidos thermanox coverslips. Por inmunohistoquímica coloraciones poli-D-lisina coverslips revestidos de vidrio se utiliza tal y como se describe anteriormente [20, 21]. Como un modelo de trofoblasto invasivo, esferoides multicelulares humanos de las células coriocarcinoma JAR (ATCC: HTB 144) [33] se colocaron en la superficie libre de monocapas de células de endometrio. JAR esferoides se prepararon como se describe anteriormente [20], es decir, una suspensión de 450000 JAR 6 células por ml de medio RPMI 1640 (Gibco, Eggenstein, Alemania) suplementado con 10% de suero de ternera fetal (FCS) se agita a 37 ° C en un cruce giratorio Agitador (Certomat R; Braun, Melsungen, Alemania) a 110 rpm, a fin de formar esferoides multicelulares 72 h después del inicio de la cultura.

Archivo adjunto ensayo

El JAR célula de ensayo se realizó como se describió anteriormente [20], con las modificaciones siguientes [24]: En breve, JAR esferoides se tiñeron con el colorante fluorescente vital 5-chloromethylfluorescein diacetato (CMFDA) durante 45 min a 37 ° C en un cruce giratorio Shaker. Después de la incubación en medio de cultivo sin JAR CMFDA, esferoides fueron entregados suavemente hacia confluente monocapas de células endometriales Ishikawa. Poli-D-lisina revestidos de vidrio coverslips se tomaron como controles. Después de 60 minutos de la cultura en la co-JAR medio a 37 ° Cy 5% de CO 2, esferoidal adhesión a la monocapas se cuantificó por centrifugación de la coverslips a los 12 g por 5 min con esferoidal superficie hacia abajo. Como medida de la adhesividad de monocapas, que se adjunta esferoides fueron contados y expresado como un porcentaje del número de semillas esferoides inicialmente.

Para inactivar las pequeñas GTPasas de la familia Rho, confluente Ishikawa monocapas de células fueron incubadas con la toxina de Clostridium difficile A [34] durante 24 horas a una concentración de 100 ng / ml en medio de cultivo. Luego, el archivo adjunto ensayo se realizó como se describió anteriormente. Los controles se cultivaron durante 24 h, sin toxina A.

Preparación de las fracciones subcelulares y Western Blot

Ishikawa células se suspendieron en helado Un buffer (20 mM Tris / HCl, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulphonylfluoride, 50 μ g / ml de inhibidor de tripsina de soja, 10 μ M pepstatin, 10 μ M Leupeptina y 2 μ g / ml aprotinina) y, posteriormente, interrumpido por tres ciclos de congelación-descongelación, utilizando nitrógeno líquido y un 37 ° C baño de agua. El resultado lisados se centrifuga a 17000 × g durante 5 min, con lo que separa en la fracción citosólica y la bolita. Este último fue resuspendido en buffer de helado A, complementado con 1% Tritón X-100, sonicated 5 veces durante 10 s cada uno, y centrifugada que la anterior, para producir en la fracción citoesqueleto [24]. Las muestras fueron hervidas durante 5 min en Laemmli de amortiguación y de las proteínas fueron separadas por SDS-PAGE en geles de acrilamida 12,5% (por carril: lisado 10 μ g, de membrana y citosólicas, así como la fracción citosólica de 100 μ g cada una), transferidos a membranas de nitrocelulosa, y Manchada con una específica de anticuerpos anti-RhoA (dilución 1:1000; 1 h de incubación). Las membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario, y inmunoreactividad fue visualizado por un aumento de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania), según lo descrito antes [24].

Inmunofluorescencia y F-actina tinción

Inmunomarcación se realizó según lo descrito antes [24, 25]. Las muestras fueron fijadas y permeabilised por un 1 + 1 mezcla de etanol-acetona durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, no específicas sitios fueron bloqueados por incubación con 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) en buffer fosfato salino (PBS) durante 15 min. Luego, las muestras fueron incubadas durante 90 min a 37 ° C con el anticuerpo primario (véase más arriba), que fue omitido en el control de coloraciones. Posteriormente, las células fueron lavadas en PBS/0.5% BSA, incubadas con los correspondientes fluorescencia-anticuerpo secundario conjugado (véase más arriba) por 90 min a 37 ° C, y enjuagarse de nuevo montado en PBS suplementado con 90% de glicerol y 1% p-phenylendiamine . Para la tinción de F-actina, las muestras fueron fijadas con paraformaldehído 3% por 15 minutos a temperatura ambiente, por permeabilised incubación con 0,05% Tritón X-100 durante 2 minutos y luego se incubaron durante 15 min con TRITC-phalloidin que se omitió en los controles. Posteriormente, las muestras fueron montadas en PBS / glicerol / phenylendiamine.

Con el fin de combinar la inmunofluorescencia y F-actina de manchas, muestras fueron fijadas con paraformaldehído 3% por 15 minutos a temperatura ambiente y en permeabilised Triton X-100 de acuerdo a la F-actina tinción de protocolo. Luego, el anticuerpo primario y TRITC-phalloidin se aplicaron simultáneamente durante 90 minutos a 37 ° C. Ambos fueron omitidos en los controles. Posteriormente, la reacción inmunoticción se realizó como se describió anteriormente. Todas las muestras fueron examinadas por microscopía de escaneo láser confocal.

Microscopía de escaneo láser confocal, análisis y tratamiento de imágenes

La microscopía confocal se realizó con un Zeiss Axiovert 100 M microscopio conectado a una microscopía de escaneo láser confocal sistema (CLSM) (modelo LSM 510; Carl Zeiss, Jena, Alemania), como se describe anteriormente [24]. Como fuentes de excitación, un láser de argón con salida a 488 nm y dos láseres de helio-neón con salida en 543 y 633 nm, respectivamente, estaban disponibles. Emisión de fluorescencia de CMFDA fue codificada como 'azul' tras pasar un filtro de banda de 505-530 nm, emisión de TRITC como 'rojo' tras pasar un filtro de banda de 560-565 nm, y la emisión de Alexa Fluor Alexa Fluor 633 y 488 como 'verde "Después de pasar un filtro de 650 nm longpass y un filtro de banda de 505-530 nm, respectivamente. Tomografía Óptica se realizó a los 0,5 μ m utilizando intervalos de 40 veces la inmersión en aceite con un objetivo numérico de abertura de 1,3 NA pinhole y un tamaño correspondiente a un valor de 1,0 de la aireado disco. Para mejorar la relación señal / ruido, cada rebanada de escaneado 8 veces seguidas de un promedio.

Todas las mediciones se realizaron en varias único Ishikawa células. En monocapas sin contacto de las células JAR, examinó Ishikawa células fueron seleccionados al azar de todo el campo fotográfico. En contacto con monocapas a JAR esferoides, sólo Ishikawa definido con membrana de las células en contacto a JAR células fueron incluidos. Desalineamientos con JAR fue evitado por las células pre-etiquetado con los CMFDA. Para obtener los datos semi-cuantitativos, la intensidad de las señales de fluorescencia de cada canal, se midieron y se expresaron como media de la escala de grises valores (gsv) utilizando el software CLSM (versión 2,8 AR 1; Carl Zeiss). La mayoría-apical y basal de la mayoría de las rebanadas de cada pila se seleccionaron para su análisis. Image Pro Plus software se utiliza para la mejora de la imagen, así como las mediciones espaciales de RhoA-positivas gránulos (versión 4,5; Medios Cybernatics, Crofton, Md, EE.UU.). Es, además, equipados con un filtro de Gauss módulo [35] y un filtro homomorphic plugin [36]. Adobe Photoshop de software (versión 7,0; Adobe Systems, San Jose, California, EE.UU.) se utilizó para el arreglo de imágenes en color RGB-único de la escala de grises las imágenes que representan a cada uno de la señal de un canal de color.

La microscopía electrónica de transmisión

Las células fueron cultivadas como monocapas sobre thermanox coverslips como se ha descrito anteriormente, enjuagarse dos veces en PBS y fijadas en glutaraldehido al 2,5%, en 0,1 M cacodylate buffer, pH 7,4, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de varios lavados en cacodylate buffer, las muestras se postfixed con 1% OsO 4 en cacodylate buffer, deshidratados con etanol clasificado y óxido de propileno, y embebidos en la mezcla de resina de epoxi [37]. El incrustados monocapas fueron separados de los thermanox coverslip de calefacción a corto plazo sobre una placa caliente. Ultrathin secciones fueron montadas en 200 redes de malla de cobre, doble teñidas con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron con un Zeiss 902 A de 80 kV (Carl Zeiss, Jena, Alemania).

Análisis estadístico

En la Fig. 4, los datos se presentan como medianas (primera - tercer cuartil) con n que indica el número de experimentos. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba de Kruskal-Wallis para el mundial de las diferencias entre los grupos y la Firmado Wilcoxon Rank Sum pairwise prueba para su comparación. Un valor de p <0,05 fue considerado significativo. En la Fig. 6, los datos se presentan como medios ± SEM con n denota el número de experimentos. Pareadas y unpaired t-pruebas se aplicarán, según proceda. Un valor de p <0,05 fue considerado significativo.

Resultados
I. Morfología de Ishikawa monocapas
II. Mecanismos moleculares de la adhesividad de Ishikawa apical monocapas de JAR esferoides
Discusión

La formación estable de la célula a célula bonos a células trofoblásticas requiere una reorganización del citoesqueleto (F-actina) y la redistribución de las pequeñas GTPasas de la familia Rho en células de endometrio [23 - 25]. De acuerdo con esto, F-actina y RhoA aumentar significativamente en Ishikawa células están en contacto con JAR esferoides. Esto puede ser parte de un generalizado de reorganización estructural y funcional de la arquitectura celular como la coordinación de reorganización se observa en la apical, así como en el de células basales polos.

Curiosamente, Ishikawa células igualar F-actina y señales de RhoA en la apical de células basales y de los polos en respuesta al contacto JAR. Esto contrasta con otra línea celular del endometrio, por ejemplo RL95-2, que invierte el gradiente entre apical de células basales y de los polos, como se muestra anteriormente [25]. Esta tendencia idéntica, pero diferente alcance de las modificaciones de polaridad apico-basal podría ser debido a las diferencias entre Ishikawa y RL95-2 en células de la inicial distribución subcelular de RhoA JAR encontrado antes en contacto con: Ishikawa en las células, grandes cantidades de RhoA se detectaron en la membrana Fracción, así como en el citosol, pero en RL95-2 considerables cantidades de RhoA sólo se observa en la fracción de membrana [24]. Estas diferencias pueden incluso indican que distintas vías de señalización implicadas que se compondrá de un subconjunto específico de RhoA específicos de los factores de cambio de nucleótidos guanina (GEFs), GTP activar la carga, y, por tanto, la activación de RhoA [38, 39]. De hecho, RhoA y su GEFs se ha informado de que se presente en caveolae y balsas de lípidos. Estos compartimentada membrana señalización dominios se cree que confiere especificidad a los complejos mecanismos de señalización RhoA [39, 40]. El hecho de que Ishikawa células no son tan adhesivo para JAR esferoides como RL95-2 células puede ser basada en esas diferencias [21].

Después del tratamiento con toxina A, que inhibe la familia de las Rho GTPasas pequeñas, F-actina disminuye significativamente en apical y basal Ishikawa polos de las células mientras que RhoA aumenta significativamente. Además, la adhesividad de las células de Ishikawa JAR esferoides no se ve afectada. En este sentido, se podría argumentar que la toxina es una absorción insuficiente de las células Ishikawa pero marcados cambios en la F-actina tinción con disminución significativa en la intensidad de fluorescencia, así como los cambios en la distribución de RhoA claramente contradicen esto. Una hipotética posibilidad podría ser que las células Ishikawa uso alternativo cascadas de señalización que compensar la inhibición de la pequeña Rho GTPasas. Esto puede incluir un aumento de la síntesis de las proteínas Rho en un nivel que no puede impedir los cambios morfológicos, pero puede permitir mantener especial resultante cascadas de señalización conservados en la adhesividad de JAR esferoides. Además, Ishikawa células pueden ser capaces de sustituir las pequeñas GTPasas de la familia Rho por otros miembros de la superfamilia de GTPasas. De hecho, se ha demostrado que diferentes Rho GTPasas pueden influir en las actividades de los demás [38 - 41]. Se ha propuesto recientemente que incluso Rho señalización pueden tener profundos efectos en Rap de señalización, este último sabe que modulan la organización del citoesqueleto de actina y [42 - 44].

La respuesta de las células Ishikawa a la toxina A es en contraste con el comportamiento de los descritos anteriormente RL-95-2 células que muestran una distribución diferente de RhoA en el oeste de secante después del tratamiento con toxina A, en comparación con las células de Ishikawa [24]. Además, la adhesividad de JAR esferoides se pierde RL95-2 en las células después de un tratamiento de la toxina. Estas diferencias pueden deberse a otras cascadas de señalización que también pueden ser responsables de los distintos grado de polaridad apico-basal en ambas líneas celulares. De hecho, las células se han preservado Ishikawa principales aspectos de la polaridad apico-basal típica de epitelios simple como se muestra aquí. Sin embargo, modificó la composición de los complejos de ocasiones, así como la localización de la membrana generalizado de E-cadherina y integrinas implica una ligera downregulation de la polar fenotipo epitelial [19]. Estas modificaciones pueden ser un requisito previo para el hecho de que también las células Ishikawa hacer reaccionar a la célula JAR vinculante con la reorganización molecular en el apical, así como en las regiones basales. En futuras investigaciones, sería interesante usar un modelo que imita el sistema in vivo situación aún más estrecha. Inmortalizado células del endometrio puede ser un modelo experimental en este sentido [por ejemplo, [45]].

Nuestros resultados indican que la respuesta de la célula huésped es, en efecto, un complejo proceso que implica una reorganización de toda la arquitectura de la célula [17, 18], y no sólo el polo apical de células a lo sugerido por los conceptos centrados en la membrana plasmática apical [12]. Queda por ver si y en qué medida este proceso puede ser regido por el mismo tipo de genes y la regulación de los mecanismos celulares que intervienen en los procesos de fusión epiteliales durante el desarrollo y las transiciones epitelio-mesenquimal (EMT) [2, 17]. En particular, el postulado maestro genes y cascadas de señalización específico estudiado en relación con los procesos de EMT completo [46 - 50] debería ser de interés aquí.

Conclusión

Los datos presentados aquí apoyan la hipótesis de que el citoesqueleto de actina y la pequeña GTPasa RhoA desempeñar un papel importante en la implantación del embrión. Como una toxina no puede impedir el embargo de JAR esferoides Ishikawa a las células, estas células parecen ser capaces de modificar las vías de señalización de una manera no aclarada hasta la fecha en las células del endometrio. Esta capacidad puede estar vinculada a la peculiar polar fenotipo epitelial observada en las células Ishikawa. Esto es coherente con la idea de que el grado de organización polar de líneas de células del epitelio uterino influye en sus respuestas a las células en contacto con JAR implica un papel fundamental de la modificación en el fenotipo celular apical adhesividad de epitelio uterino de trofoblasto.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

CH concibe el estudio y lleva a cabo el escaneo láser confocal y microscopía electrónica de las investigaciones microscópicas. MS aportó su experiencia en los pequeños Rho GTPasas y realizó experimentos bioquímicos. HWD participado en el diseño del estudio y ayudó a redactar el manuscrito. MT concebido del estudio, y participaron en su diseño y la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a K.-D. Schulz (Marburg, Alemania) de la prestación de los Ishikawa línea celular, así como HG Adelmann (Loughborough, Reino Unido) para críticas constructivas avanzadas en procesamiento digital de imágenes y el tipo de suministro de su banda de Gauss y homomorphic filtro plugins, y J. Huesing (Essen , Alemania) para ayudar en el análisis estadístico. El hábil asistencia técnica de Baden K., B. Gobs, B. Maranca y D. Schuenke Se agradece.