Journal of Inflammation (London, England), 2005; 2: 2-2 (más artículos en esta revista)

Inalterada la producción de TNF-α por los macrófagos y monocitos en la obesidad inducida por dieta en la rata

BioMed Central
Sammy Bedoui (Bedoui.Sammy @ web.de) [1], Elena Velkoska (e.velkoska @ pgrad.unimelb.edu.au) [1], Steve Bozinovski (bozis@unimelb.edu.au) [3], Jessica E Jones (jessicaj@unimelb.edu.au) [3], Gary Anderson P (gpa@unimelb.edu.au) [1], Margaret J, Morris (mjmorris@unimelb.edu.au) [1]
[1] Department of Pharmacology, The University of Melbourne, Melbourne, 3010, Australia
[2] Department of Medicine, The University of Melbourne, Melbourne, 3010, Australia
[3] Cooperative Research Centre for Chronic Inflammatory Diseases, The University of Melbourne, Melbourne, 3010, Australia

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Resumen
Antecedentes

Resultados recientes han establecido una asociación entre la obesidad y la disfunción inmune. Sin embargo, la mayoría de los estudios de investigación de los efectos de la obesidad sobre la función inmunológica se han llevado a cabo en modelos de roedores genéticamente obesos. Dado que la obesidad humana se debe principalmente a la ingesta de una dieta alta en grasa y la disminución de gasto de energía, defectos inmunológicos pregunta si también se producen en la obesidad inducida por dieta. En concreto, se centró en la función de los monocitos y macrófagos, ya que estas células se cree que participan en la inflamación de bajo grado presente en la obesidad.

Métodos

Hombre ratas Sprague-Dawley, fueron alimentados con un alto contenido de grasa o un chow dieta estándar para los 2 o 10 semanas. Al final del período de intervención animales fueron anestesiados, la sangre recolectada para la determinación de las concentraciones plasmáticas de mediador y de lipopolisacárido (LPS) estimuló la producción de TNF-α por los monocitos. LPS estimula la producción de TNF-α en macrófagos alveolares también fue determinada.

Resultados

Con alto contenido de grasa de la alimentación de los 2 o 10 semanas dio lugar a un aumento significativo de la masa grasa y la leptina sérica. Aunque el aumento de la leptina sérica ha sido previamente vinculado a la modulación de la inmunidad innata, no se encontraron diferencias significativas en el LPS estimula la producción de TNF-α por los monocitos de sangre o cualquiera de los macrófagos alveolares entre los grupos de la dieta. Por otra parte, pero no hemos podido encontrar un aumento significativo de la distribución de las concentraciones de TNF-α en los animales obesos, según lo informado por los animales genéticamente obesos.

Conclusión

Nuestros datos sugieren que los defectos en la función inmune innata observado en animales genéticamente obesos no se simula con la dieta de la obesidad, la más probable y puede reflejar en cifras brutas anormalidad en la función de la leptina de estos modelos. Aún es necesario delimitar los efectos de la dieta sobre la obesidad estado inflamatorio y la función inmunológica.

Antecedentes

La obesidad es una enfermedad crónica muy común que plantea importantes riesgos de salud como la diabetes, las enfermedades cardiovasculares y la hipertensión. Esta condición patológica se caracteriza por complejos cambios neuroendocrinos en el cerebro, así como en la periferia, con la participación de mediadores como el neuropéptido Y (NPY) y leptina [1]. Además, se han recibido varios informes que demuestran que la obesidad se asocia con alteraciones de la función inmunológica y una crónica de bajo grado estado inflamatorio [resumidas por [2, 3]]. En concreto se ha informado de que los individuos obesos tienen una mayor incidencia y gravedad de las enfermedades infecciosas [4]. Estos defectos incluyen también alteraciones en la fagocitosis mediada por macrófagos y citoquinas pro-inflamatorias de producción [5], así como el aumento de la sensibilidad a la endotoxina inducida letalidad [6]. Hasta la fecha, los enfoques experimentales a la investigación de este nuevo vínculo entre la obesidad y la función inmunológica se han llevado a cabo principalmente en modelos genéticos de la obesidad que, o bien carecen de leptina (ob / ob mouse) o de la forma larga del receptor de leptina (db / db mouse ). Sin embargo, la leptina mutaciones sólo representan una pequeña fracción de la obesidad en los seres humanos con la mayoría de la obesidad ligada a la sobrealimentación y la reducción de gasto de energía [7]. Con leptina se asemejan a varios aspectos de una citoquina y ejercer diversas funciones inmunológicas [revisado por [8]], no está claro si estos modelos de examinar los efectos de la obesidad en general, o más bien los efectos de un defectuoso sistema de la leptina sobre la función inmunológica. Esta cuestión debe abordarse mediante la investigación de la función inmunológica inducida por dieta en modelos de la obesidad.

Monocitos y macrófagos son los principales componentes celulares de la rama innata del sistema inmune. Con su capacidad de producir citocinas, por ejemplo, el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), en respuesta a las bacterias y los fragmentos bacterianos, tales como LPS, monocitos y macrófagos son esenciales para la primera línea de defensa en los sitios de contacto entre el interior y el Exterior, como la mucosa de los pulmones o el tracto gastrointestinal. En particular, el aumento de la evidencia sugiere que los macrófagos también desempeñan un papel importante en el desarrollo de la inflamación de bajo grado que está presente en la obesidad. Recientes trabajos demuestran que los macrófagos infiltrarse en el tejido adiposo, y que estas células son parte integrante de la inflamación de bajo grado-[9]. Sin embargo, muchas preguntas siguen sin respuesta en cuanto a la función exacta de los monocitos y macrófagos en el curso de la obesidad. Por ejemplo, es de gran interés para examinar si los cambios funcionales descritas en el tejido adiposo son intrínsecos a los macrófagos, o si estos defectos proceden de la interacción con el microambiente local en el tejido adiposo. Si los defectos intrínsecos macrófagos son responsables de las alteraciones descritas en la obesidad, defectos similares también deben estar presentes en los macrófagos en otros compartimentos. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue investigar los macrófagos y monocitos en función de los distintos compartimentos del tejido adiposo de obesos animales, específicamente a los pulmones y la sangre.

Con el fin de examinar los monocitos y macrófagos en función de la obesidad inducida por dieta, estamos sometidos ratas Sprague Dawley, machos a una cafetería de estilo dieta duradera o 2 semanas (a corto plazo) o 10 semanas (a largo plazo). De esta manera podríamos examinar los efectos de la dieta en sí y establecido de la obesidad. La basura compañeros recibió la dieta normal de roedores chow. Una vez terminada la intervención dietética, la sangre monocitos y macrófagos alveolares fueron recogidos y estimulados con LPS in vitro. En estas condiciones LPS induce la producción fuerte de la pro-inflamatoria TNF-α mediador [10]. Como la leptina y la activación simpática impacto en la función inmunológica [11, 12], las concentraciones plasmáticas de NPY, un marcador de la actividad del sistema nervioso simpático [13, 14], y la leptina, así como el TNF-α fueron determinadas.

Materiales y métodos
Animales

Hombre ratas Sprague-Dawley, que se mantuvieron en el control de luz (06.00-18.00 h) y temperatura (20 ± 2 ° C) las condiciones de ad libitum con el acceso al agua. Cinco ratas semanas de edad (n = 18) fueron divididos aleatoriamente en dos grupos. El grupo de control ( "controles", n = 9) fue alimentado chow estándar de laboratorio (12,5% de calorías como grasa) y en el segundo grupo ( "la dieta con alto contenido de grasa", n = 9), se presentó con un sabor muy alto En grasa estilo cafetería dieta (35% de calorías como grasa), que consta de tartas y pasteles de carne, pasta y torta y completado chow. Dos conjuntos diferentes de los experimentos se llevaron a cabo. La primera serie ( "a largo plazo la dieta"), se mantuvo durante 10 semanas, mientras que una segunda serie ( "a corto plazo, la dieta") sólo fue alimentado durante 2 semanas. Ambos conjuntos experimental consistió en el control de los animales y la obesidad inducida por dieta de los animales que fueron asignadas a grupos similares a partir de los pesos. De peso corporal y la ingesta de calorías de todas las ratas se vigila semanal. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Experimentación Animal de la Universidad de Melbourne.

Colección de tejidos

En la conclusión del período de la dieta, los animales fueron anaesthetized con pentobarbital (Nembutal, 100 mg / kg, Merial Australia Pty Ltd, Australia). Punción cardiaca (3 ml) se realizó con un heparinizado jeringa para recoger la sangre de la sangre plena estimulación, y para permitir la preparación de plasma para la determinación de las concentraciones plasmáticas de mediador. Retroperitoneal tejido adiposo blanco y el bazo fueron retirados y pesado.

Lavado broncoalveolar

Para obtener los macrófagos alveolares, anaesthetized ratas fueron sometidas a lavado broncoalveolar (BAL). Los pulmones fueron lavadas con 10 ml de frío, estéril PBS a través de una cánula colocada en la tráquea. Los pulmones se lavaron dos veces y el total de células y viabilities se determinaron por bromuro de etidio / acridina naranja (Molecular Probes, Oregon, EE.UU.) fluorescentes viabilidad manchas utilizando un hemocitómetro Neubauer. Cytocentrifuge preparativos (Shandon Cytospin 3) utilizando 100 μ l de BAL fueron diferenciadas según el estándar de criterios morfológicos contar al menos 500 células (DiffQuik, Zeiss, Alemania). BAL líquido que figura entre 97-99% de los macrófagos alveolares. Macrófagos alveolares se ajustaron a 500000 cells/250 μ l y estimulado por 3 horas a 37 ° C en presencia de varias concentraciones de LPS (0.001-10 μ g / ml, E. coli serotipo 026: B6, Sigma). Sobrenadantes fueron recolectados y almacenados a -80 ° C para la medición de TNF-α.

Completo de la sangre de estimulación

Varias concentraciones de LPS (0.01-10 μ g / ml) se añadieron a 250 μ l de sangre total y se incuba durante 3 horas a 37 ° C. Al término de la incubación, las muestras fueron centrifugadas y sobrenadantes fueron almacenadas a -80 ° C para la medición de TNF-α.

Detección de TNF-α, NPY y leptina

Todos los reactivos son de endotoxina-libre para asegurar que el TNF-α no se artifactually inducida, salvo que se utilizó deliberadamente LPS. La concentración de TNF-α en las muestras de plasma y sobrenadantes se determinó por ELISA kit disponible comercialmente (Pharmingen, Merckville, Australia) con el estándar de las concentraciones que van desde 4-1000 pg / ml. Las concentraciones plasmáticas de leptina se midieron utilizando un kit disponible comercialmente de radioinmunoensayo (Linco, Missouri, EE.UU.), mientras que NPY se midió utilizando un ensayo en la casa que utilizan un anticuerpo de conejo y 125 I-NPY (2000 Ci / mmol, Amersham, Australia) que se describió anteriormente [ 13].

Estadísticas

Unpaired Student's t-test fue usado para determinar diferencias significativas de las concentraciones de masas y los órganos de NPY, la leptina y de TNF-α. Los datos de BAL y la plena estimulación de sangre se analizaron mediante ANOVA de una vía y el peso corporal de datos fue sometido a ANOVA para medidas repetidas, con la consiguiente LSD si los valores de p se encontraban por debajo de p <0,05. Las diferencias donde los valores de p <0,05 se consideró significativo. Se usaron GraphPadPrism 3,0 para Windows.

Resultados
Efecto de la dieta con alto contenido de grasa en la ingesta calórica, el peso corporal y la masa de órganos

La exposición de los animales a la dieta con alto contenido de grasa conducido a un aumento significativo en la ingesta calórica (p <0,05, Tabla 1] y el peso corporal de 3 semanas (p <0,05; Fig. 1]. Animales en la dieta con alto contenido de grasa siguió en la ganancia de peso y la realización de las 10 semanas de intervención dietética pesaron 23% más que sus respectivos controles. Aunque el peso corporal no fue diferente, tejido adiposo retroperitoneal blanco ya era significativamente mayor después de 2 semanas en la dieta (p <0,05, Tabla 1.]. Continuación de la exposición a la dieta con alto contenido de grasa llevan a progresivo aumento de la ingesta de calorías, y la masa de tejido adiposo, que fue de 2,8 veces más elevado que el control de los animales a las 10 semanas de la dieta (Tabla 1]. Net bazo peso fue significativamente deprimidos (p <0,05) después de 2 semanas de la dieta con alto contenido de grasa. Aunque hubo una tendencia a que la reducción de masa bazo después de las 10 semanas de intervención dietética, esto no alcanzó significación estadística (Tabla 1].

Dieta efectos inducidos por la leptina en el plasma, NPY y TNF-α

El consumo de una dieta alta en grasa se asociaba con un aumento significativo en las concentraciones plasmáticas de leptina (p <0,05; Fig. 2]. Incluso después de 2 semanas en la dieta, las concentraciones de leptina se había más que duplicado, en un momento en que el peso corporal no fue significativamente elevados (Tabla 1]. El chow ratas alimentadas también mostró un aumento en las concentraciones de leptina de 2 a 10 semanas (Fig. 2], lo que supone su incremento en el peso corporal y la masa grasa a través del tiempo (Tabla 1]. Cuando el plasma se compararon las concentraciones de NPY, el consumo de la dieta con alto contenido de grasa dado lugar a un aumento significativo (p <0,05) en el corto plazo, mientras que no se observó después de 10 semanas de dieta (Fig. 2]. No hubo cambios relacionados con la edad en las concentraciones plasmáticas de NPY en los animales alimentados chow, que indica la ausencia de efectos relacionados con la edad en las concentraciones plasmáticas de NPY durante este período de tiempo.

A pesar del aumento de otros informes plasma las concentraciones de TNF-α en la obesidad [15], en las condiciones utilizadas en este estudio, pero no hemos podido detectar una diferencia significativa entre el chow y con alto contenido de grasas animales alimentados. En el grupo de edad de mayores de TNF-α niveles estaban por debajo del límite de detección del ensayo.

LPS inducido por TNF-α en plena producción de sangre preparativos

Para examinar si la dieta con alto contenido de grasa modula la capacidad de los monocitos de sangre para producir TNF-α en respuesta a LPS, lleno de sangre preparativos de las dos chow y con alto contenido de grasas animales fueron alimentados en comparación. Ex vivo LPS-estimulación de la plena preparativos resultado en la sangre Una dosis-dependiente aumento en la producción de TNF-α (Fig. 3]. Sin embargo, la respuesta a LPS no difirió significativamente entre los animales alimentados chow y la dieta con alto contenido de grasa, tanto en los puntos explorados (a corto y largo plazo la dieta, la Fig. 3A y 3B].

Estimulación de los macrófagos alveolares con LPS

Con el fin de examinar si la intervención dietética tiene algún efecto en los parámetros funcionales de los tejidos-sufragados macrófagos, macrófagos alveolares son estimuladas con LPS in vitro. El aumento de las concentraciones de LPS dado lugar a un dependiente de la dosis, el aumento significativo de la producción de TNF-α por los macrófagos alveolares (Figura 4]. No hubo diferencias significativas en el grado de estimulación por LPS en los animales alimentados con la dieta alta en grasa para 2 o 10 semanas. A pesar de que la producción basal de TNF-α, en estas condiciones, no fue significativamente diferente, alto consumo de grasa animales alimentados tendieron a tener una mayor basal de los niveles de TNF-α, por lo tanto, el aumento proporcional de los animales con alto contenido de grasas, expresado como porcentaje de cambio de la basal, es Reprimida en comparación con los animales alimentados chow, sobre todo a largo plazo después del alto consumo de grasa de alimentación (13747% 19589% frente a 10 μ g / ml LPS en grasa y chow ratas alimentadas respectivamente).

Discusión

Anteriormente hemos caracterizado en gran medida el modelo de la dieta obesidad utilizado en el actual estudio [16, 17]. Animales aumentar la ingesta de calorías en la presentación de la dieta, y muestran un aumento significativo de peso dentro de las 3 semanas. Reproducible aumento de la adiposidad y de las concentraciones plasmáticas de leptina se producen dentro de las 2 semanas de alto consumo de grasa de alimentación, como se ha demostrado en el presente estudio.

La mayoría de los estudios que tratan de investigar el vínculo entre la obesidad y el sistema inmunológico han llevado a cabo en modelos genéticos de la obesidad. Por ejemplo, los defectos en la inmunidad específica, por ejemplo la reducción del número de linfocitos en el bazo, timo y de la sangre periférica se han notificado en ob / ob o db / db ratones, ratas y Zucker [2]. Además, la función inmune innata también parece ser afectados genéticos en modelos animales de obesidad. En concreto, se ha informado de que los macrófagos de animales genéticamente obesos tienen una menor capacidad para eliminar la Candida albicans y para producir citocinas proinflamatorias [18]. Aunque pocos estudios han investigado la función inmune en la obesidad inducida por dieta, algunos cambios en la inmunidad humoral y celular se ha demostrado [19, 20], sin embargo todavía no hay información sobre la función inmunológica inflamatoria.

La leptina también se ha demostrado para modular varios parámetros funcionales inmune [6, 8], y un estudio reciente demostró que en el ser humano la leptina activa neutrófilos indirectamente estimulando monocitos a la liberación de TNF-α [21]. Por ello, pregunta si la obesidad inducida por dieta, que se asocia significativamente con el aumento de los niveles de leptina y más de cerca se asemeja a la forma más común de la obesidad humana que los modelos modificados genéticamente [22], podría tener un impacto en las funciones inmune innato. Sin embargo, en el presente estudio no se encontraron alteraciones en la capacidad de los macrófagos y monocitos a la liberación de TNF-α a un desafío LPS.

Nos centramos en la sangre monocitos y macrófagos alveolares del pulmón, ya que estas células son las principales componentes de la rama innata del sistema inmune. Además, con la actual propuesta de un papel de los macrófagos en la conducción bajo grado de inflamación presente en el tejido adiposo [9], este enfoque también nos permitió evaluar si los defectos intrínsecos macrófagos están presentes en la obesidad, tales como defectos que también se producen en Tejidos que no sean el tejido adiposo. Macrófagos y monocitos producen TNF-α en respuesta inmune innata a estímulos tales como LPS, que es esencial para la acogida de defensa contra bacterias y otros patógenos [23]. Nuestros resultados demuestran, no evidentes cambios en la producción de TNF-α por los monocitos de sangre después de 2 o 10 semanas de intervención dietética. Es posible que aunque la obesidad no tiene influencia en la función de los monocitos de sangre, que el complejo de los cambios asociados con la obesidad ejercen una influencia funcional en tejido adulto a cargo de los macrófagos. Sin embargo, el uso de derivados BAL macrófagos alveolares, no se encontraron diferencias estadísticas en la red TNF-α respuesta de los macrófagos alveolares LPS a la hora de comparar la estimulación y el control de los animales obesos. Curiosamente, cuando se analizó el aumento por encima del percentil basal de la producción de TNF-α a las 10 semanas de la dieta, el alto contenido de grasas animales alimentados parece tener una respuesta a LPS debilitados, lo que sugiere que los macrófagos alveolares de alto contenido de grasas animales alimentados no puede ser estimulado como firmemente Como las células de los animales del grupo control.

Más recientemente, la obesidad ha sido considerada como un proceso inflamatorio [3, 24, 25] y estudios en humanos han demostrado que la pérdida de peso pueden reducir los marcadores inflamatorios [26]. Así reciente atención se ha centrado en citocinas como el TNF-α y la IL-6 [27]. TNF-α, antes conocido como cachexin [28], ha sido estudiada en ambos modelos animales y humanos de la obesidad. Algunos estudios han demostrado que en los seres humanos aumento de las concentraciones de leptina se correlacionan con soluble TNF-α receptores, lo que sugiere el desarrollo de un estado pro-inflamatorio como el peso del cuerpo aumenta [29]. Tejido adiposo es capaz de producir TNF-α, y el aumento de las concentraciones de TNF-α en sujetos ancianos se correlacionan con la masa grasa troncular [30]. Varios investigadores han informado también de incremento de los niveles plasmáticos de TNF-α en modelos genéticos de la obesidad. Por ejemplo, el plasma las concentraciones de TNF-α se duplicó en ratones obesos que se debe a un defecto en el gen de hormona de crecimiento [15]. En nuestras manos plasma TNF-α no fue dramáticamente afectado por la dieta alta en grasa, sin embargo esto puede ser debido en parte al hecho de que los valores están muy cerca del límite de detección del ensayo. También es probable que esta discrepancia pueden poner de relieve las diferencias de especies, pero también podría indicar que la genética y la obesidad inducida por dieta obesidad impacto diferente sobre la regulación de los niveles de TNF-α. Cambios en el TNF-α puede ser más coherente cuando hay una base genética predominante a la obesidad en la que el nivel de la obesidad suele ser más extrema [28]. Reforma en el TNF-α puede ser de tejidos específicos como lo demuestra un reciente estudio en el que se propone macrófagos inflamatorios relacionados con las actividades en el tejido adiposo desempeñar un papel en la obesidad relacionada con la resistencia a la insulina [31].

Curiosamente, también se halló un aumento significativo en la concentración de NPY que circulan después de 2 semanas de intervención dietética. Como periféricos NPY se deriva principalmente de los terminales del nervio simpático, las concentraciones plasmáticas de NPY puede ser considerado como un marcador de actividad nervioso simpático [13, 14]. Así, sobre la base de los resultados de la presente y anteriores informes de la activación simpática postprandial [32], proponemos que a corto plazo el exceso de la dieta aumenta la actividad simpática. El aumento de la actividad simpática aumenta el gasto de energía [33], y, por lo tanto, podría representar un mecanismo endógeno para contrarrestar el aumento de peso. Sin embargo, surge la pregunta de por qué los niveles plasmáticos de NPY no son diferentes después de 10 semanas de dieta. Estudios anteriores han demostrado que los cambios en la actividad nervioso simpático puede ser cama específicos [34], con una mayor renal y cardíaca inferior noradrenalina secundarios en personas obesas [34]. En general todo el cuerpo nervioso simpático actividad en los sujetos obesos fue normal, lo que puede explicar por qué no vemos un cambio en los niveles plasmáticos de NPY después de la dieta a largo plazo de exposición.

Conclusión

Desde defectos específicos de genes sólo representan una pequeña proporción de la obesidad en los seres humanos [7, 35], este estudio fue diseñado para investigar si los defectos funcionales en los monocitos / macrófagos sistema descrito en modelos animales genéticamente obesos también están presentes en un modelo animal de La obesidad inducida por dieta, que más de cerca se asemeja a la obesidad humana. La ausencia de efectos significativos de la dieta sobre la obesidad inducida por críticos de los parámetros funcionales monocitos / macrófagos sistema utilizado aquí plantea la importante cuestión de si los cambios en la producción de citoquinas pro-inflamatorias observado en animales genéticamente obesos en realidad el resultado de la compleja Fisiopatología de la obesidad o son más bien una consecuencia de la leptina defecto presente en estos modelos. Nuestros resultados a favor de este último concepto ya que nuestros animales muestran todas las características de la obesidad y, sin embargo, no muestran una comparables defecto en el monocitos / macrófagos del sistema. Nuestros resultados también muestran que la función de los monocitos y macrófagos en compartimentos extra-adiposo es normal, lo que sugiere que el estado inflamatorio crónico presente en el tejido adiposo durante la obesidad no es una consecuencia de defectos funcionales en los monocitos / macrófagos del sistema. Una posibilidad para el resto de nuestra conclusión es que el período de sobrealimentación utilizadas no reflejan los cambios observados en más obesidad crónica.

Si bien nuestros resultados no apoyan un importante efecto de la obesidad en los marcadores de la función inmune innata utiliza aquí, que no excluye efectos en otros tejidos inmune competentes, tales como el endotelio. Es evidente que aún es necesario trazar los posibles efectos de la obesidad sobre la función inmune, a la luz del aumento de la carga de esta enfermedad.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Contribuciones de los autores

SaB participó en el diseño experimental, llevó a cabo la mayoría de los procedimientos experimentales y de poner juntos el manuscrito. EV llevó a cabo el radioimmunoassays y ayudó a redactar el manuscrito. StB participó en la recogida de las muestras destinadas al LPS protocolo. JEJ ayudado en la recogida de las muestras. ACP participó en el diseño experimental. MJM concibe el estudio y participaron en su diseño y la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la Convención de las enfermedades inflamatorias crónicas, el Consejo Nacional de Salud y del Consejo de Investigación Médica y la Universidad de Melbourne Plan de Investigación.