Particle and Fibre Toxicology, 2005; 2: 1-1 (más artículos en esta revista)

Impacto de los desechos de neumáticos en los estudios in vitro e in vivo de los sistemas de

BioMed Central
Maurizio Gualtieri (maurizio.gualtieri @ unimib.it) [1], Manuela Andrioletti (manuela.andrioletti @ unimi.it) [2], Paride Mantecca (paride.mantecca @ unimi.it) [1], Claudio Vismara (claudio. Vismara@unimi.it) [2], Marina Camatini (marina.camatini @ unimib.it) [1]
[1-1 20126 Milano, Italia
[2] Department of Biology, University of Milano, Via Celoria, 26, Milano 20133, Italy

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Resumen
Antecedentes

Se estima que más del 80% de las partículas respirables (PM 10) en las ciudades proviene de los transportes por carretera y que el desgaste de frenos y neumáticos son responsables del 3-7% de emisión de la misma. Los datos sobre los indicadores de impacto ambiental de los desechos de llantas (TD), se originó a partir de la abrasión de neumáticos en las carreteras, son muy escasos, a pesar de TD contiene sustancias químicas (zinc y compuestos orgánicos) que pueden ser liberados en el medio ambiente.

Métodos

TD morfología de las partículas se analizó con SEM, TEM y la FIB instrumentos. TD TD eluates y extractos orgánicos fueron probados en la serie de dilución en líneas celulares humanas y de embriones de Xenopus laevis. 50 y 100 g / L TD fueron utilizados para la eluates obtenido después de 24 h a pH 3 y la cantidad de zinc presente se midió con un ICP-AES. Eluates diluida al 1%, 10%, 50% en medios de cultivo y se utiliza en estado puro X. Laevis embriones en el ensayo FETAX. Células HepG2 fueron expuestos durante 24 horas a 0,05 - 50 μ g / ml de zinc sal A549 mientras que las células fueron expuestas durante 24, 48 y 72 h a 10, 50, 60, o 75 μ g / ml de extracto de TD. X. Laevis embriones fueron expuestos a 50, 80, 100, o 120 μ g / ml de extracto de TD.

Resultados

La solución puro de 50 g / L TD produjo 80,2% de mortalidad (p <0,01) en X. Laevis embriones y este efecto tóxico fue tres veces mayor que el producido por 100 g / L TD. Zn acumulación en las células HepG2 fue evidente después de 4 h de exposición. A549 células expuestas al extracto TD orgánicos durante 72 h presentó una modificación de la morfología, es decir una disminución en la proliferación celular y un incremento en los daños del ADN, como se muestra por ensayo cometa. La dosis de 80 μ g / ml de extracto produjo TD 14,6% en la mortalidad X. Laevis embriones y 15,9% de mortalidad de 120 μ g / ml. El tratamiento con 80, 100, o 120 μ g / ml de extracto TD orgánica aumentó de 14,8% a 37,8% un error de larvas de los porcentajes en comparación al 5,6% en el control.

Conclusión

Dado que la cantidad de Zn lixiviados de TD se relaciona con el pH, la agregación de las partículas y la elución proceso, la cantidad de TD presentes en el medio ambiente tiene que ser tenido en cuenta. Además las condiciones atmosféricas, lo que puede influir profundamente las propiedades de partículas, tienen que ser consideradas. La fracción orgánica se TD tóxicos para las células y los organismos. Así pues, debido a sus componentes químicos, la DT puede tener un potencial de impacto ambiental y ha de seguir investigando.

1. Antecedentes

PM de las zonas urbanas es una mezcla compleja de componentes orgánicos e inorgánicos [1].

Ambos fino (<2,5 μ m) y ultrafinas (<100 nm) y partículas de metales de transición se reconocen los componentes a ser responsables en la determinación de la toxicidad y los posibles efectos en la salud [2, 3]. El tracto respiratorio es el principal sitio de la exposición a la PM, que pueden afectar el árbol tráqueo-bronquial y los alvéolos pulmonares. PM puede causar complicaciones pulmonares y cardiovasculares y es responsable de una mayor proporción de cáncer de pulmón [4]. PM toxicidad está demostrado por estudios epidemiológicos [2] y por las investigaciones de laboratorio de los mamíferos y roedores pulmonar líneas celulares [5, 6]. Líneas celulares humanas también se utilizan para estudiar la citotoxicidad, la genotoxicidad y la inducción de la inflamación por soluble e insoluble de compuestos PM [7 - 11]. PM 10 [12, 13], las partículas de los motores diesel (DEP) [14 - 17] y partículas ultrafinas [18, 19] han recibido la atención y han sido ampliamente analizado por su citotoxicidad, mientras que las partículas derivadas de la abrasión de llantas en el camino recibió un Limitada a consideración su impacto en el suelo, ya que libera una gran cantidad de zinc [20], y en el aire ambiente por su composición de metal [21, 22]. Anteriormente, la presencia de alergenos en látex de polvo de neumáticos fue sugerido por Miguel et al. [23], que destaca que este componente podría ser un factor importante en la producción de látex de las alergias y los síntomas de asma.

Desechos de neumáticos (TD), generados por el desgaste de neumáticos en las carreteras, son partículas con un tamaño superior a 7 μ m y rango máximo de> 100 μ m, pero también una población de partículas más pequeñas (<1 μ m) [24], menos de 20% del total, de acuerdo con Cadle y Williams [25]. Más recientemente Fauser [26] examinó la distribución de tamaño de TD y llegó a la conclusión de que se trata de un histograma bimodal con más del 90% en masa (en el rango recogidos, es decir, <20 μ m) inferiores a 1 μ m, y el resto son mayores de 7 μ m . La concentración total de partículas de neumáticos en una ciudad ocupada por carretera está en el rango 1-10 μ g / m 3, con un valor medio de 2,8 μ g / m 3 que representa alrededor del 5% del total de partículas en suspensión en el aire <20 μ m. A partir de estos datos y los de Tappe y nulo [27] y Ntziachristos [28] que se puede calcular que el 5-7% de estas partículas PM 10 en el rango de tamaño de la fracción respirable.

Nelson et al. [29] y Evans [30] se describe el efecto nocivo de toda la chatarra y neumáticos en organismos acuáticos producidos por la liberación de zinc en el medio acuático [31]. Además, Stephensen et al. [32] mostró que el componente orgánico también es tóxico, ya que los HAP extraídos de desgaste de neumáticos inducida ethoxyresorufin-O-deethlyase (EROD), la actividad en los peces.

La Comisión Europea [33] ha señalado los riesgos ambientales relacionados con la emisión de TD en condiciones normales de desgaste del neumático, ya que la contribución de la DT al B [a] P de partículas respirables es ligeramente superior al 5% en comparación con el DEP y aumentará cuando diesel Asociada a que se reduzcan las emisiones en un futuro próximo. Además, TD es una fuente de zinc para el medio ambiente [20, 22, 34].

El propósito de este trabajo es investigar TD efectos en el desarrollo de X. Laevis, y sobre las líneas celulares humanas. En estudios previos, se describe la forma [35 - 37], la caracterización físico química [38] de la DT y los resultados preliminares sobre sus efectos en una línea celular [10] y de los organismos vivos [39]. Aquí, presentamos pruebas de que ambos TD TD eluates y extractos orgánicos son muy tóxicos para los sistemas vivos.

Michnowicz y Weaks [31], [30] Evans y Nelson et al. [29] zinc identificado como la principal fuente de eluido toxicidad en el medio ambiente acuático. Contienen compuestos de goma 2% de zinc principalmente como óxido de zinc usados como un activador de azufre en la vulcanización. Por lo tanto, una cierta cantidad de cinc es lixiviados de TD cuando llueve, y cuando toda la chatarra o neumáticos se utilizan como obstáculos de agua. Se analizaron el efecto de la DT eluates sobre X. Laevis embriones. El eluates fueron obtenidos de la mezcla de un elemento claro de la DT en el agua a pH 3, desde el típico de los valores de pH de la lluvia ácida, causada por las emisiones antropógenas, puede ser en el rango de 3-5 [40]. Embrión rana Xenopus Teratogeneis de ensayo-(FETAX) es un modelo muy sensible acuáticos para evaluar la toxicidad, y se ha utilizado. Además, el efecto producido por una sal de zinc añadido a la medio de cultivo se evaluó sobre la línea de células de hígado humano HepG2.

TD extracto, cuyo principal compuesto químico fue poli-isopreno, se puso a prueba en el A549 humanos alveolar línea celular, un modelo para estudiar el daño pulmonar humana [41] y sobre X. Laevis embriones.

Se presentan evidencias de que la toxicidad de la eluates es, en parte relacionados con la presencia de Zn, como ya se ha demostrado por numerosos autores sobre otros sistemas vivos. Abernathy et al. [42] presentó pruebas de que la toxicidad no se elimina por completo la presencia de la divalente quelante EDTA, y sugirió que la presencia de componentes orgánicos más tóxicos. TD extracto que contiene compuestos químicos orgánicos es tóxico para el A549 pulmonar línea celular humana a una dosis, que pueden corresponder a la cantidad presente en el aire, los seres humanos inhalan diariamente. Daily ventilador puede ser de 20 m 3, y contiene 50 μ g / m 3 de PM 10 en un área urbana contaminada. Como ya se informó de 5-7% de los PM es la DT, por lo que la supuesta cantidad de TD puede ser inhalado 50-80 μ g / m 3 / día.

2.Materials y métodos
2,1 TD morfología de partículas

TD muestras se obtuvieron a partir de la degradación de los ensayos de laboratorio con una técnica de crio-fractura de neumáticos a partir de la chatarra. La morfología de la multa 1-7 μ m de las partículas se analizó con un haz de iones se centró (FIB), y las muestras se prepararon como se describe anteriormente [37]. Las partículas se analizaron con un microscopio electrónico de barrido (SEM) TESCAN y un microscopio electrónico de transmisión (TEM) JEOL JEM 1220, de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente [38].

2,2 TD eluates

Eluates se obtuvieron de 50 y 100 g TD en 1 L borosilicated botellas de vidrio que contienen agua ultra puro a pH 3. Zinc cantidad se midió a las 24 h con un Inductively Junto Plasma-Espectrometría de Emisión Atómica (ICP-AES) instrumento. Un 206,200 nm de longitud de onda de emisión se utilizó para determinar los iones de Zn que aseguró que interferir especies constituyen una parte insignificante de la señal de respuesta. Zn (15,075 ppm, y de 5,05 ppm en blanco) Milli Q normas en el agua a pH 3 fueron utilizados para la calibración. Las botellas se colocan en un agitador mecánico a 50 rpm durante 24 h. A continuación, las diferentes concentraciones del efluente a pH 3, que simula el más bajo valor de pH de la lluvia ácida causada por las emisiones antropógenas [40], se prepararon y esterilizados. Las diluciones se expresa en porcentaje de volumen. El DT de lixiviados sin diluir se define como una concentración de 100%, mientras que el 10% de lixiviados TD fue diluido con un 90% de mediano FETAX utilizados en la prueba (1, 10, 50 y 100% eluido dilución serie se utilizaron. Solutions se ajustaron a las fisiológicas PH de la FETAX medio antes de añadir las sales.

2,3 TD extractos orgánicos

Tire partículas se colocaron en un dedal de extracción de la celulosa y se inserta en una asamblea Soxhlet provisto de un matraz de 250 ml, y luego 150 ml de diclorometano se añadió. Las partículas se extrajeron de Soxhlet durante 6 h, y luego o bien secos en un rotativo de evaporación en vacío o se utilizan para el análisis de espectroscopia infrarroja. TD extracto se caracterizó por espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR). Diclorometano suspendido extracto fue analizado. En breve, de 50 a 100 μ l de extracto TD KBr fueron repartidas en los discos y deja secar. El KBr ventanas se analizaron con un FTIR Midac M200 conectada a un PC con un espectro de la adquisición, el almacenamiento y la elaboración de software. El pellet obtenido después de la evaporación se suspendió en DMSO a razón de 10 μ g / μ l, congelados a -20 ° C, y se utiliza para la prueba en la línea celular A549 y X. Laevis embriones.

2,4 TD tratamiento de los sistemas in vitro

El A549 de pulmón humanos y el hígado humano HepG2 líneas celulares fueron cultivadas de forma rutinaria a 37 ° C en medio Opti-MEM (Gibco, BRL Life Technologies, EE.UU.) suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (Gibco BRL Life Technologies, EE.UU.) y 1% de los antibióticos (penicilina \ estreptomicina) en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2. El A549 línea celular se utilizó para evaluar el efecto de extractos TD, disuelto en medio de cultivo para las concentraciones 10, 50, 60 y 75 μ g / ml para 24, 48 y 72 h. Un control positivo con DMSO en la concentración de 0,75% (v / v) se realizó para verificar el efecto del disolvente solo en el 75 μ g / ml tratamiento.

La línea celular HepG2 se utilizó para evaluar el posible efecto de la sal de cinc ZnSO 4 7H 2 O. Células, cultivadas según ha informado [43], fueron expuestos para 2, 4 y 24 h para las concentraciones de Zn que van desde 0,05 a 50 μ g / ml, disuelto en medio de cultivo. El nivel intracelular de zinc se mide directamente por ICP-AES y expresado como ppm/10 6 células.

2,5. TD tratamiento in vivo de los sistemas de
2,6 Análisis estadístico

Los experimentos con células HepG2 y A549 por triplicado y se repetirá al menos tres veces. Un modelo de ANOVA y la prueba de Kruskall-Wallis (Statgraphics Plus 5,0 software) estaban a cargo de detectar diferencias estadísticamente significativas entre el control y la muestra de los grupos tratados.

La relación entre la concentración de extracto de TD y el porcentaje de larvas muertas o malformadas se investigue por la χ 2-test y ANOVA modelo.

3. Resultados
3,1 morfología de partículas

Morfología de partículas se muestra en la Figura 1. Las imágenes se obtuvieron con SEM, respectivamente, (1, A), TEM (1, B) y la FIB (1, C y D) instrumentos. SEM, TEM y la FIB imágenes ilustran la rugosidad TD externos. La técnica de la FIB reveló la forma de partículas de modificación después de la lixiviación de laboratorio, según lo informado por Milani et al. [37]. Además, esta técnica visualiza la morfología interna de las partículas, ya que la imagen en alta resolución se suma a una in situ de secciones, que muestra la variable densidad de los componentes (Fig. 1D]. Este aspecto es en virtud de una investigación más a fondo. La morfología de las partículas, ilustra en la Figura 1, obtenido según se describe en la sección 2,1, es muy similar a la del medio ambiente recogido partículas de neumáticos [38], incluso si la forma externa no es tan áspero como el ambiente recogido partículas. La criopreservación se han obtenido partículas de la misma composición química de las partículas de desgaste de neumáticos.

3,2 caracterización química

Identificado por la morfología de la SEM, se analizaron las partículas de caucho con EDX para determinar la composición elemental. Figura 2 se presenta la típica huella digital del vulcanizado compuestos de neumáticos para la detección de S, Zn y Si, que son buenos marcadores TD ambientales [38]. Este espectro EDX SEM refiere a la imagen de la Figura 1A. El Cu pico de la EDX espectro deriva de los materiales (Cu), que constituye las redes sobre las que se recogieron partículas TD. En la Figura 3, un espectro FTIR presenta picos relacionados con isopreno polímeros. La mayoría de los definidos en 2920 y 2850 cm -1 se refieren a CH 2 estiramiento (simétricas y asimétricas), una de las características de isopreno polímero. Los picos en 2363 y 2334 cm -1 se refieren a las emisiones de CO 2 presentes en el aparato, el pico de 1734 cm -1 se refiere al estiramiento C = O 1705 cm -1 mientras que se refiere a un grupo CH 3. Más débiles picos en 1458 y 1377 cm -1 se refieren, respectivamente, a 2 y CH CH 3 grupos.

3,3. In vitro de los sistemas de
3,4 sistemas in vivo
4. Discusión

La distribución de las partículas TD debe ser mejor analizado junto con la resuspensión de sus propiedades una vez depositado en la superficie terrestre. En la actualidad TD distribución de tamaño [25, 26, 38] y la composición química [20, 26, 38, 50, 51] han recibido suficiente atención al estado de que puedan tener un impacto ambiental. En realidad, TD partículas se pueden identificar por inorgánico [26, 38, 52] y [53] orgánicos trazador especies. Una mejor comprensión de su morfología ha sido recientemente, a través de un instrumento de la FIB [37], lo que da más información sobre la distribución de neumáticos de compuestos químicos. Se ha demostrado que los componentes orgánicos [42, 54, 55], así como los inorgánicos [21, 29, 56] afectan al medio ambiente. En la literatura, se informa de que las formulaciones de rodadura del neumático-históricamente incluyen alrededor de 2,5% Zn [57]. Durante varios decenios, el desgaste de neumáticos materiales han sido reconocidos como fuente de Zn en el medio ambiente [20, 22, 29, 30], y recientemente se ha informado de [20] que el 10-40% de Zn del suelo-se aplica TD Puesto en libertad en un pool lábil. Así, se prestará especial atención que se ha dedicado a la liberación de zinc, que es una cuestión de un debate serio entre las organizaciones en Europa [58]. Los estudios de Smolders y Degryse [20] y Councell et al. [22] sugieren que Zn en llantas de caucho pueden ser móviles y biodisponibles; elevación de los niveles de Zn se han demostrado en experimentos con lixiviación de llantas de caucho [29] y el agua de lluvia simulada [34, 59]. Zn lixiviación que puede aumentarse indirectamente por cambios en las condiciones ambientales locales (por ejemplo, mediante la reducción del pH), y se ha demostrado que el desgaste del neumático eluates son tóxicas para especies de algas, Daphnia y peces [29, 60]. Esta toxicidad está relacionada con la presencia de zinc en el eluates, y la concentración de zinc eluyen es siempre superior a la que consideran perjudiciales para los organismos acuáticos. En realidad máximo autorizado de las concentraciones de Zn en el agua, sobre la base de la toxicidad para los organismos acuáticos, han sido establecidos por la EPA a 120 μ g / l.

Eluates obtenidos con 50 y 100 g / L TD en la dilución de un 50% y un puro de alta toxicidad producidos en X. Laevis embriones. Luo et al. [49] mostró que el cloruro de zinc CL 50 en FETAX era de 55 μ g / ml. Esta concentración produce embriotoxicidad y teratogenicidad, y es comparable a la que se presente en nuestra eluates. Nuestros resultados muestran que 100 g / L TD eluido es menos tóxica de 50 g / L. Desde TD partículas tienden a agregado en función de sus propiedades físicas, las partículas de agregados exponer al medio una menor superficie de la dispersión. En consecuencia, física y química y las interacciones entre partículas son medianas disminuido, y menos cantidad de productos químicos es lixiviado en el medio.

Está bien documentado que el zinc puede afectar a los organismos vivos, pero su efecto sobre líneas celulares ha recibido escasa atención. Hemos expuesto a la línea de células HepG2 a la sal de metal ZnSO 4. 7H 2 O en diferentes concentraciones de 0,05 a 50 μ g / ml. El 50 μ g / ml dosis produjo una fuerte absorción de los metales, y el ICP-AES análisis reveló que el nivel intracelular de zinc aumentó de 4 a 24 h de exposición. El procedimiento analítico utilizado mostró una vez dependiente de la acumulación de zinc en las células expuestas para 2, 4 y 24 h, dando lugar a un efecto citotóxico. Cuando el nivel intracelular de zinc superan un límite determinado, una serie de mecanismos homeostáticos participar en la regulación de la distribución por el interior de la acción sobre el flujo a través de la membrana plasmática, por secuestrar el cinc dentro de los compartimentos subcelulares [43], o por la síntesis de moléculas capaces de Vinculan estrechamente zinc [61].

Cuando se cansan eluates fueron tratados con EDTA por Abernethy et al. [42] y Gualtieri et al. [39] sólo retirada parcial de zinc se observó toxicidad, y esto indica la presencia de un nuevo orgánico tóxico. De hecho, varios informes [23, 54, 55, 60] se refieren a la presencia de componentes orgánicos que pueden ser filtrados. El TD fracción orgánica, obtenida por extracción en soxhlet aparato y analizado con FTIR, isopreno figura como el principal compuesto químico. Isopreno es un producto químico industrial utilizado ampliamente como la unidad básica monomérico en caucho natural y los productos químicos utilizados principalmente en la fabricación de poli-isopreno y diversos copolímeros, tales como goma de butilo. Inhalación estudios han demostrado múltiples efectos tumorigénicos órgano con este producto químico en ratones y ratas [62, 63]. Isopreno terpens pertenecen a la familia química, y se realizaron varios estudios sobre estos compuestos. Isopreno y chloroprene se enumeran en el Programa Nacional de Toxicología del Informe sobre Carcinógenos como razonablemente ser un carcinógeno humano, a pesar de los datos de epidemiología sobre estos dos productos químicos no se consideran adecuados para evaluar su potencial de carcinogenicidad en humanos. Además, recientemente se ha demostrado que las formas isopreno guanidina aductos [64], y que metopreno y sus productos de degradación afectan X. Laevis desarrollo [65].

La interacción entre las partículas inhaladas y de las células pulmonares se describe en la literatura [66, 67], así como la correlación entre las partículas de neumáticos y la puesta en libertad de alergia a las proteínas del látex [23, 68]. Estos datos muestran que la DT puede liberar compuestos químicos de su matriz. Recientemente, también se ha sugerido que los productos químicos se TD extraíble disruptores endocrinos [69], lo que justifica el creciente interés por este contaminante.

Estamos expuestos tanto la línea celular A549 y X. Laevis embriones a los extractos de TD. A549 disminución de la proliferación de las células en un tiempo-y de manera dosis-dependiente, y una disminución estadísticamente significativa apareció a las 24 horas y se hizo más evidente a las 48 y 72 horas a la dosis probadas. Para definir el papel de TD extracto orgánico como un inductor de los daños en el ADN celular, se evaluó la rotura de filamento de la DNA utilizando una cometa de ensayo y se encontró que los extractos causó capítulo romper la formación. Se ha demostrado mediante el ensayo cometa partículas insolubles que, como negro de humo [8] y quarz [70], fueron capaces de inducir capítulo rompe en células A549, probablemente a través de la generación intracelular de OH. Más investigación es necesaria para determinar si éste es el mecanismo por el cual los extractos orgánicos TD acto. TD Orgánica tratamiento modificaron en gran medida la morfología de estas células, y las cifras de apoptosis en el núcleo y el citoplasma son frecuentes a la dosis máxima. Además, los extractos de TD producido una toxicidad significativa en X. Laevis embriones, ya que una diferencia significativa en la mortalidad entre los porcentajes de control de la dosis más alta y grupo expuesto estaba presente. Por otra parte un aumento de las larvas de un error de porcentajes es evidente.

5.Conclusions

Anteriores trabajos y estos resultados confirman el importante papel del zinc en TD lixiviados y la presencia de otras sustancias tóxicas orgánicas. Los estudios realizados se han centrado su atención en el potencial riesgo tóxico para los organismos acuáticos que viven de toda la chatarra o neumáticos de caucho. En este estudio TD ha sido investigado por su impacto en las líneas celulares humanas y en la X. Laevis embriones. TD eluates contienen zinc, y hemos demostrado que este metal puede acumularse en las células, y afectar a X. Laevis embriones. El extracto fue TD orgánicos tóxicos para las células A549 y afectados morfología celular, la proliferación de las células y el ADN, y produce graves malformaciones en el desarrollo de X. Laevis embriones. Estos resultados contribuyen al conocimiento de un componente de la tarde, lo que representa un porcentaje considerable de PM 10, que en la actualidad no se considera una "sustancia peligrosa", pero debe ser tenido en cuenta por su potencial impacto ambiental [71, 33]. Además, estos resultados firmemente hincapié en la necesidad de una investigación más a fondo en la distribución de TD, así como sobre su destino en las zonas urbanas.

Abreviaturas

Tire de Desechos = TD; partículas = PM; Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus = FETAX; Partículas Diesel Exhaust = DEP; Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos = HAP; Centrado Ion Beam = FIB; Microscopía Electrónica de Transmisión = TEM; por microscopía electrónica de barrido SEM =; Inductively Junto Plasma-Espectrometría de Emisión Atómica = ICP-AES; Dimetil Sulfoxide = DMSO; 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro = MTT; Humanos gonadotropina coriónica = HCG; Transformada de Fourier análisis InfraRed = FTIR

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MG concebido del estudio, llevado a cabo la proliferación y otros ensayos bioquímicos, en líneas celulares, redactado el manuscrito. MA llevó a cabo el ensayo FETAX y redactó el manuscrito. PM redactado el manuscrito. CV realizó el análisis estadístico. MC concibe el estudio y participaron en su diseño y la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Prof. M. Milani para la asistencia técnica en la FIB y el doctor M. Acciarri por su apoyo técnico en el análisis SEM.