Particle and Fibre Toxicology, 2005; 2: 2-2 (más artículos en esta revista)

Efectos de las partículas sobre el sistema vascular y pulmonar: la hora curso en las ratas espontáneamente hipertensas

BioMed Central
Miriam Gerlofs E-Nijland (miriam.gerlofs @ rivm.nl) [1], A John F Boere (AJF.boere @ rivm.nl) [1], Daan ALC Leseman (daan.leseman @ rivm.nl) [1] , Jan AMA Dormans (j.dormans @ rivm.nl) [1], Thomas Sandström (thomas.sandstrom @ lung.umu.se) [2], Raimo O Salonen (raimo.salonen @ ktl.fi) [3], Leendert van Bree (lvbree@rivm.nl) [1], Flemming R Cassee (f.cassee @ rivm.nl) [1]
[1] Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente (RIVM), PO Box 1, 3720 BA, Bilthoven, Países Bajos
[2] Departamento de Medicina Respiratoria y Alergia, el Hospital de la Universidad de Umeå, Umeå, Suecia
[3] Departamento de Salud Ambiental, Instituto Nacional de Salud Pública (KTL), Kuopio, Finlandia

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

Este estudio se realizó en el marco de dos multi-centro de la Comisión Europea en los proyectos financiados (HEPMEAP y PAMCHAR) relativa a la fuente-composición-toxicidad relación de las partículas (PM) de muestra en Europa. Con el objetivo de optimizar el diseño de PM in vivo en los estudios de toxicidad de cribado en términos de dosis y el tiempo entre una sola exposición y la determinación de las respuestas biológicas de rata en un modelo de imitación de las enfermedades humanas resultantes ambiente en la susceptibilidad a la tarde. El polvo en tamaño torácica PM-gama (diámetro aerodinámico <10 μ m), se tomaron muestras de una carretera cerca del túnel (IDT) a través de un alto volumen de impactador de cascada. Ratas espontáneamente hipertensas están expuestos a polvo urbanos recogidos en Ottawa, Canadá (EHC-93 10 mg / kg de peso corporal; referencia PM) de IDT o diferentes dosis (0,3, 1, 3, 10 mg / kg de peso corporal) por instilación intratraqueal . La necropsia se realizó a los 4, 24, o 48 horas después de la exposición.

Resultados

El número de neutrófilos en el lavado broncoalveolar aumentado enormemente después de la exposición a la dosis más alta de IDT o EHC-93. Además, la exposición PM ligeramente afectada la coagulación de la sangre, ya que existía un pequeño pero significativo aumento en los niveles plasmáticos de fibrinógeno (factor 1.2). Inflamación pulmonar y el estrés oxidativo, así como los cambios en los factores de coagulación de la sangre y de las poblaciones de células circulantes en sangre se observaron en el rango de 3 a 10 mg PM / kg de peso corporal sin lesión pulmonar significativa.

Conclusión

La dosis óptima para la determinación de la clasificación de la toxicidad ambiental derivado PM muestras en las ratas espontáneamente hipertensas se sugiere a ser de entre 3 y 10 PM mg / kg de peso corporal en las condiciones utilizadas en el presente estudio. Con una dosis más baja sólo algunos se detectaron efectos inflamatorios, que será probablemente muy pocos para poder discriminar entre las muestras de la tarde mientras que una respuesta completamente diferente patrón se observó con la dosis más alta. Además de la dosis, un intervalo de 24 horas de la exposición al sacrificio parecía apropiado para evaluar la toxicidad relativa potencia de la tarde ya que la mayoría de los efectos para la salud se observaron un día después de la exposición PM frente a los otros tiempos examinados. Las consideraciones expuestas anteriormente constituyen una buena base para la realización de estudios de detección PM toxicidad en ratas espontáneamente hipertensas.

Antecedentes

Los efectos de partículas (PM) en la salud humana son una gran preocupación ya que los datos epidemiológicos actuales muestran efectos en la salud por debajo de las concentraciones de PM en común de las normas de calidad del aire ambiente o la salud basada en directrices [1]. Por otra parte, una clara asociación se ha demostrado en suspensión en el aire entre el aumento de las concentraciones de PM y exacerbación de las respiratorias crónicas y enfermedades cardiovasculares, síntomas respiratorios o disminución de la función pulmonar, como se puso de manifiesto en el aumento de los ingresos hospitalarios y visitas a la sala de emergencia o incluso la mortalidad prematura [1].

PM no se ha vinculado a numerosos efectos adversos para la salud por sí sola investigación epidemiológica. Cuenta con el apoyo de PM estudios de toxicidad en animales de experimentación y los dos voluntarios humanos. La exposición a la inhalación estudios han demostrado que la exposición a corto plazo a los motores diesel tienen un efecto inflamatorio agudo en las vías respiratorias humano normal lo que marcó neutrofilia, la activación de los mastocitos y neutrófilos, y la producción de citocinas y quimiocinas asociados a la acumulación y activación de neutrófilos [2, 3]. Además, la exposición repetida de los animales de experimentación [4, 5] y de los seres humanos [6] para dirigir el mundo real del aire ambiente en las zonas urbanas de São Paulo, Ciudad de Mexico y Florencia sugieren que más se produzcan efectos adversos para la salud en lugares con alta densidad de tráfico, Posiblemente debido al mayor nivel de (multa) PM (diámetro aerodinámico <2,5 μ m). Estos estudios han demostrado graves efectos negativos para la salud de las vías respiratorias, incluidas lesiones en la vía aérea superior e inferior de los tejidos, el aumento de la reactividad de la vía aérea y los efectos inmunotóxicos. Muchos animales in vivo exposición estudios han demostrado la toxicidad de la tarde, la muestra de aire ambiente o de los motores diesel de filtros, y administrado por instilación intratraqueal. PM fracciones causa no sólo de las vías respiratorias y la inflamación pulmonar, y las lesiones [7 - 10], pero también pueden afectar la función cardiopulmonar [11, 12].

Las incertidumbres sobre los efectos en la salud de las PM características y componentes y sus respectivas fuentes de complicar seriamente el proceso de la salud PM evaluación de los riesgos y la elaboración de normas, así como la aplicación efectiva de los costos de emisión y medidas de control de riesgos. Si ambiente PM con diferentes composiciones y fuente de las contribuciones, se hace la actividad biológica y la toxicidad queda por determinar lo que es de importancia sustancial, tanto de la comunidad científica y el punto de vista reglamentario. Por lo tanto, existe una urgente necesidad de realizar estudios para establecer el origen de la composición de la relación efecto-PM. Híbrido entre los estudios de toxicología, epidemiología y disciplinas de la calidad del aire puede ser un reto en este sentido. Con el fin de mejorar la base de datos científicos sobre este aspecto, varios proyectos europeos se han puesto en marcha para investigar tanto los efectos de ambiente PM recogidos en metropolitanas europeas, así como las zonas rurales y la relación entre la toxicidad y la PM composición y las fuentes (por ejemplo, el tráfico). En estos proyectos se utilizan el método de la instilación intratraqueal y se centran en las diferencias entre la acumulación o el así llamado modo de multa (diámetro aerodinámico de 0,1 - 2,5 μ m) y el modo de gruesas (diámetro aerodinámico de 2,5 - 10 μ m), de PM. Los estudios de Schins et al [10] y Hetland et al [13] han dado una primera indicación de que el modo de partículas gruesas podría ser más potente in vivo que un buen modo de fracción.

Anteriormente, había investigado el curso del tiempo urbano PM [7] durante un período de 7 días, es decir 2, 4, y 7 días después de una única exposición a la PM. Los niveles de expresión génica y de los correspondientes productos involucrados en los problemas cardiovasculares y pulmonares fueron estudiados en ratas con inflamación pulmonar existente. Desde el más fuerte impacto sobre el efecto biológico de indicadores tales como la proteína inflamatoria de macrófagos-2 (MIP-2), factor de necrosis tumoral (TNF) - α, la endotelina-1 (ET-1), y fibrinógeno se observó a los 2 días después de la exposición, Se plantea la cuestión de si o no efectos significativos se pueden detectar en menos de dos días después de una única exposición. De hecho, los cambios en los niveles de la inflamación pulmonar asociada a citoquinas se han reportado dentro de 2-6 horas después de una única exposición a la tarde o el ozono, mientras que la inflamación, como lo demuestra el aumento de los niveles de neutrófilos, a menudo picos alrededor de las 24 horas [14 - 16]. Usar aceite residual cenizas volantes (ROFA) como sucedáneo de ambiente PM, Watkinson et al [17] y Campen et al [18] han demostrado que tanto ROFA inducida inmediata (0-6 horas después de la instilación) y retrasado (24-84 H) cardiaca, así como las respuestas termorreguladoras. Una rápida expresión de los genes después de una única exposición PM también se ha demostrado en espontáneamente hipertensas (SH) las ratas [19].

El objetivo de este trabajo fue optimizar el diseño de la toxicidad in vivo PM estudios de cribado en términos de dosis y el tiempo entre una sola exposición intratraqueal y la determinación de las respuestas biológicas. Por lo tanto, en el presente estudio se podría conocer en una dosis óptima en la que los efectos biológicos son aún detectables dado el número relativamente pequeño de observaciones. Además, el curso temporal de los efectos después de una sola dosis de la tarde fue descubierta. Los resultados deben proporcionar información importante para el diseño de futuros estudios en ratas, como el SH HEPMEAP y PAMCHAR los estudios in vivo, en el que diversos ambiente PM muestras recogidas en toda Europa será comparado por su potencia relativa tóxicos.

Resultados

Los resultados del cuerpo y peso de los órganos, así como los análisis de sangre y BALF SH de ratas expuestas a la solución salina o PM (polvo de la carretera del túnel (IDT) o EHC-93) se dan por separado para cada examinado tiempo después de la exposición (4, 24 Y 48 h) en archivos adicionales (ver archivos adicionales 1, 2 y 3 respectivamente).

Cuerpo y peso de los órganos

Cuerpo y corazón pesos no cambió en respuesta a IDT EHC-93 o la exposición. Por el contrario, el peso húmedo de pulmón y pulmón peso vivo aumentó significativamente tras la exposición a EHC-93 (10 mg / kg) 24 horas después de la exposición.

Lavado broncoalveolar (BALF) análisis
Análisis de sangre

Fibrinógeno plasmático se aumentó sólo a las 24 y 48 horas después de la exposición a 10 mg / kg de IDT o EHC-93 (Figura 4]. No se encontraron cambios significativos en el plasma de grandes ET-1, el precursor vasoconstrictor de la endotelina-1, ni para el marcador de lesión endotelial factor de von Willebrand (vWF). Los diferenciales de células en la sangre sólo reveló disminuido los niveles de linfocitos después de la exposición a la dosis más alta de la IDT y EHC-93, y la exposición de IDT (10 mg / kg) también resultó en disminución de los niveles plasmáticos de granulocitos basófilos, tanto a las 4 horas después de la exposición.

Histopatología pulmonar

La exposición a la I + DT en dosis de 3 y 10 mg / kg de peso corporal mostró un aumento dependiente de la dosis en el número de focos inflamatorios 24 y 48 horas después de la exposición, siendo significativo para los 10 mg / kg de dosis a las 48 h (Tabla 1]. Por otro lado, la exposición a 10 mg / kg de peso corporal EHC-93 dio lugar a un importante aumento más pronunciado en los focos inflamatorios en ambos puntos temporales. Además de lo observado aumento dependiente de la dosis de focos inflamatorios, una importante relación dosis-efecto se observó para el número de macrófagos cargados de la tarde después de la exposición a IDT (Figura 5]. La alta dosis EHC-93 también induce un aumento significativo del número de macrófagos en las ratas SH que phagocytized IDT. La evaluación histológica de BrdU de etiquetado en el control de ratas mostraron SH además de un etiquetado de fondo normales y un alto etiquetado broncoalveolar en el tejido linfoide (BALT) y de los tejidos linfoides perivasculares, pronunciada en el etiquetado focos inflamatorios. La exposición a la I + DT, así como EHC-93 provocado un pronunciado aumento en el tamaño de la etiqueta zonas de la focos inflamatorios (Tabla 1].

Discusión

En este estudio, varios dependientes de la dosis biológica de las respuestas se midieron después de la exposición a IDT EHC-93 o por instilación intratraqueal en los tres después de los tiempos de exposición (4, 24 y 48 h). Como era de esperar, sobre la base de estudios anteriores [14 - 16], la inflamación asociada a la respuesta de citoquinas en el pulmón es más rápido después de la exposición mientras que la afluencia de células inflamatorias picos de 24 Horas después de la exposición. No muertes o inmediatamente su vida en peligro la salud se han observado efectos después de una única exposición a la PM; este último aspecto es el apoyo de los relativamente pequeños cambios en el peso corporal o el pulmón, hallazgos macroscópicos en la necropsia y señaló el general de la patología pulmonar. Además, el marcador de la citotoxicidad, LDH, es puesta en BALF sólo en el más alto nivel de dosis. Los bajos niveles de proteína y albúmina en la BALF así como la falta de Clara de células secretoras de proteína CC16, una vez más, se indica que estas dosis relativamente altas utilizadas para la instilación no indujo toxicidad grave.

Todas las dosis utilizadas en el presente estudio, incluyendo la más baja dosis de 0,3 mg / kg, por encima de los niveles que se puede esperar que se produzcan en humanos realista la exposición ocupacional o ambiental [20]. Por otro lado, estos niveles se justifican teniendo en cuenta la toxicidad relativa PM evaluación de los diferentes tipos de partículas y de sus mecanismos biológicos subyacentes. Para la mayoría de los parámetros de efectos en la salud, una clara relación dosis-respuesta depende patrón se observa. Sin embargo, las respuestas biológicas inducidas por la más alta de 10 mg / kg dosis de IDT, y en especial EHC-93, parecía más extrema y no parecía encajar en el esquema general de esta curva. Estos efectos pueden atribuirse a las altas dosis y podría considerarse como una respuesta diferente patrón, que es probablemente causado por la sobrecarga de los pulmones [21, 22]. Sorprendentemente, sin embargo, es la observación de que aún hay macrófagos pulmonares sin phagocytized PM y no hay tampoco señales de PM sueltos en los alvéolos que indica que la dosis de 10 mg / kg de peso corporal no dio lugar a la sobrecarga de los pulmones en el Presente estudio (observaciones no publicadas). Aunque separados de selección de tamaño de las diferentes fracciones de la tarde tendrá lugar en varios proyectos europeos, el presente estudio utilizó una muestra de IDT PM agruparon las fracciones gruesas y finas para aumentar el rendimiento de PM toxicidad, lo que mejora la probabilidad de golpear la respuestas biológicas. Además, el uso combinado en lugar de fracciones separadas es de acuerdo con la política de restringir el número de animales de experimentación.

PM exposición puede provocar lesión pulmonar y la inflamación, una respuesta de estrés oxidativo, así como efectos sistémicos [7, 23 - 27]. Las personas con enfermedades ya existentes son más susceptibles a la exposición PM; exacerbación de la inflamación pulmonar en personas susceptibles, por lo tanto, podría ser un mecanismo por el cual ejerce su toxicidad PM [28, 29]. Dado que los sujetos son más susceptibles de riesgo, las ratas espontáneamente hipertensas fue seleccionado como un modelo animal para la evaluación de la toxicidad relativa PM. El SH rata ha demostrado ser un modelo animal representativo de los sujetos con hipertensión sistémica y también ha demostrado que faciliten la medición de la toxicidad PM [30]. En el presente estudio se determinó la lesión pulmonar por varios parámetros medidos en BALF (LDH, ALP, proteína, la albúmina, y CC16), además de macroscópicas y microscópicas de la patología pulmonar. Gross celular daño pulmonar está ausente incluso después de la exposición a dosis muy altas PM a pesar de la alta neutrofilia PM expuestos en los pulmones. Tal reacción inflamatoria en el pulmón, en ausencia de un perjuicio grave se ha observado también en las ratas después de la exposición a dosis relativamente bajas PM (~ 0,6 - 1 mg / kg) 18 horas después medirán instilación [10].

El presente PM exposición dio lugar a una respuesta rápida de mediadores pro-inflamatorios (MIP-2, TNF-α y la IL-6). MIP-2 juega un papel clave en el reclutamiento de células inflamatorias desde el MIP-2 niveles con frecuencia han precedido en el aumento de neutrófilos [14, 31]. TNF-α Se ha sugerido que la mayoría puestos en libertad en relación al aumento de los neutrófilos a pesar de que es liberado por los macrófagos. Además, los niveles de IL-6 se incrementará cuando TNF-α se convierte en el regulado [32]. Esto parece ser cierto también para la inflamación inducida por la tarde se muestra aquí. Inflamación pulmonar debido a la exposición a PM es evidente en el presente estudio ya que el número de neutrófilos en BALF aumentado enormemente después de la exposición a la dosis más alta de IDT o EHC-93 y algunos neutrófilos afluencia se ha visto en una dosis baja PM 4 Horas después de la exposición. A pesar de esto, sólo la alta dosis de IDT, de 3 y 10 mg / kg de peso corporal también han mostrado actividad inducida de neutrófilos, como se indica por el aumento de la actividad MPO. BALF Mayor número de neutrófilos, y por que es una inflamación pulmonar compatible PM efecto que se ha observado también en otros estudios de la instilación de ratas [10, 15]. Elevado número de macrófagos, como se observa en el presente estudio, no han sido demostrado, que es probablemente causado por la variabilidad en el procedimiento de lavado. Sin embargo, un claro aumento de los macrófagos se muestra en el ser humano 18 horas después de la exposición a los gases de escape diesel [33]. El hallazgo de la reducción en el número de macrófagos BALF 4 Horas después de la exposición a la dosis de 3 mg / kg de peso corporal de IDT más probable es que representa un aumento de los macrófagos en la adhesión al epitelio en una fase relativamente temprana después de la exposición. Más tarde, a partir de los macrófagos número aumente debido a la demanda de remoción de partículas. La importancia de los linfocitos en la inducción de una pronta respuesta inflamatoria por la tarde la exposición ha sugerido anteriormente para los gases de escape diesel [2, 3, 34] y la exposición a EHC-93 produjo un aumento de BALF número de linfocitos, que apoya esta conclusión. Es evidente que en el estado normal de descanso sin respuesta hay un cierto porcentaje de células con menos años de edad integridad de membrana. La exposición dio lugar a una relativamente masivo reclutamiento y la afluencia de células inflamatorias, que son mucho más viable. Esto significa que no es la propia viabilidad que se ha incrementado, sino más bien una corriente de fresco y vivo de las células. Además, 24 horas después de la exposición a dosis bajas de IDT disminución de los niveles de los antioxidantes GSH y UA se observaron. Esto implica que el estrés oxidativo también desempeñar un papel en los mecanismos que conducen a efectos adversos para la salud, que deben ser investigadas más a fondo en futuros estudios.

Cambios sistémicos siguientes reacciones inflamatorias u otras respuestas inmunes en el pulmón es probable. Una disminución en el número de linfocitos de sangre es un ejemplo de un posible cambio sistémico. En el presente estudio, sólo se pudo observar poco después de la tarde la exposición en ausencia de lesión pulmonar y la inflamación pulmonar cuando aún no era evidente. Una pequeña disminución de los linfocitos circulantes se ha demostrado antes, como resultado de exposición a PM por instilación intratraqueal y / o inhalación en ratas [23, 35] y en humanos [36]. Un aumento de los neutrófilos circulantes coincidió con una disminución de los linfocitos a la exposición por inhalación [35, 36] mientras que la instilación de estudios, incluido el presente estudio, no reveló aumento de los neutrófilos en la sangre [23]. Aunque la importancia biológica y el impacto aún no está claro, la disminución de los linfocitos es coherente en estos estudios. En el presente estudio, la reducción de los linfocitos de sangre precedió a la BALF aumento de los linfocitos, lo que podría explicarse por el aumento de la adhesión de los linfocitos a la vasculatura pulmonar, lo que posterior a la afluencia de linfocitos vías respiratorias. Otro efecto sistémico marcador, el fibrinógeno, que es un factor de riesgo de enfermedad cardiovascular [37, 38], contribuye a la viscosidad del plasma al igual que vWF, un pro-coagulante producto de la endotelio [39]. La exposición a una alta dosis de la tarde como consecuencia un aumento de fibrinógeno plasmático, pero no se observaron cambios en los niveles plasmáticos de vWF. Diversos efectos de las partículas de contaminación en la sangre son de fibrinógeno en la literatura. Elevación, así como la reducción de ningún cambio en los niveles de fibrinógeno se han descrito en cualquiera de los seres humanos [40 - 42] o de los animales [43, 44] a la exposición a la PM bajo condiciones variables. Estos resultados contradicen podría ser debido a diferencias en la fuente de contribución, PM dosis o diferencias en las vías de exposición, momento de la evaluación, y / o la variabilidad en la respuesta dentro de los grupos. Dado que vWF también contribuye a la viscosidad del plasma vWF constante los niveles observados fueron inesperados y pueden atribuirse a un mayor efecto sobre la viscosidad de fibrinógeno [39]. Sin embargo, los niveles plasmáticos de vWF sin cambios indican que la exposición a la IDT y la EHC-93 en estas concentraciones no dio lugar a daño endotelial.

Conclusión

En el presente estudio, hemos demostrado que la dosis óptima para la determinación de la clasificación de la toxicidad ambiental derivado PM muestras que parecía ser de entre 3 y 10 PM mg / kg de peso corporal. Esto es válido para el diseño del estudio aplicado en ratas espontáneamente hipertensas. Esto se sustenta en el hecho de que, en el rango de estas dosis, las respuestas biológicas tales como la inflamación pulmonar, el estrés oxidativo y los efectos observados en la circulación pueden ser detectados sin la presencia de lesiones o toxicidad pulmonar. En dosis más bajas inflamatoria sólo algunos efectos pueden ser detectados, probablemente demasiado pocos para poder discriminar entre las muestras de la tarde mientras que una respuesta completamente diferente patrón se observó con la dosis más alta. Lo más probable es que los efectos adicionales podrían ser encontrados en la dosis más bajas por el aumento del número de animales, sino la búsqueda de una óptima utilización de dosis pequeñas cifras de animales es un argumento detrás de este estudio. Además de la dosis, 24 horas después de la exposición parece ser el momento adecuado para evaluar la toxicidad PM ya que la mayoría de los efectos en la salud se observan un día después de la exposición PM frente a los otros tiempos examinados. Las consideraciones expuestas anteriormente constituyen una buena base para la realización de la toxicidad in vivo PM estudios de cribado en las ratas espontáneamente hipertensas.

Métodos
Animales

Masculino ratas espontáneamente hipertensas (SHR / NHsd), de 11-12 semanas de edad y con un peso de 250-350 g se obtuvieron de la colonia de cría de Harlan (Indianápolis, Indiana, EE.UU.). Los animales fueron alojados en jaulas de macrolon Tipo 3 en una habitación con aire filtrado HEPA-y un constante clima (temperatura ambiente 21 ± 2 º C y humedad relativa de 40-70%) con una de 12 horas de luz / oscuridad ciclo (a la luz de 8,00 Am). Especial de roedores los alimentos (SSP-TOX estándar / eromix pellets de 10 mm no radiada; Esperanza Farms, Woerden, Países Bajos) y el agua del grifo a través de un automático de agua potable sistema fue suministrado ad libitum. Inmediatamente después de su llegada, los animales fueron pesados y asignados al azar en grupos de exposición. Los experimentos se inició después de un período de aclimatación de por lo menos 7 días. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética del Instituto Nacional de Salud Pública y Medio Ambiente.

Objetivos y diseño del estudio

El objetivo del presente estudio es determinar la dosis óptima de tiempo y después de una única exposición a PM en el que en los posteriores estudios de diversos PM muestras recogidas en toda Europa puedan ser analizados y clasificados por su potencia tóxica. Se aventura la hipótesis de que una única exposición a partículas ambientales en las ratas espontáneamente hipertensas dará lugar a una inmediata lesión pulmonar / inflamación, el agotamiento de antioxidantes. Esto puede ser consecuencia, seguido de alteraciones en los marcadores que son sintomáticos de los cambios en los factores de coagulación de la sangre y de la circulación de las poblaciones de células sanguíneas y eventualmente podría afectar a la función cardiovascular. Para hacer frente a la hipótesis, las ratas fueron expuestas a diferentes dosis de la PM recogida en el aire ambiente, cerca de un túnel de autopista utilizando técnicas de gran volumen. Además, una muestra de referencia (EHC-93, ver más abajo) se ha utilizado para permitir la comparación entre estudios. Las respuestas biológicas a estas muestras se determinó la tarde después de tres diferentes puntos de tiempo: 4, 24 o 48 horas después de la exposición. Con el fin de aumentar la sensibilidad del análisis, espontáneamente hipertensas (SH) las ratas fueron seleccionados, como representante de las personas con hipertensión sistémica [30]. Una amplia selección de los marcadores de inflamación y la toxicidad fueron examinados.

La toma de muestras y caracterización de partículas

PM se recogió en espuma de poliuretano (PUF) en la salida de un túnel en la autopista-Hendrik ido Ambacht-(EIS), en los Países Bajos utilizando un impactador de cascada de alto volumen (HVCI) [45]. Coarse (2.5-10 μ m) y la multa (0.1-2.5 μ m) Por la tarde se muestrearon por separado sobre PUF. El PUF se limpien antes de su uso en 3 baños sucesivos con 30 min sonications, en el agua, en etanol y en metanol, respectivamente. La extracción de metanol recogidos PM de PUF incluye potencialmente ventajas y desventajas. El metanol, a diferencia del agua, moja la estructura porosa de PUF y una alta eficiencia de extracción (hasta un 90-95%) de la PM recogidos en masa se ha demostrado [46]. El método ya ha sido aplicado ampliamente en varios proyectos financiados por la UE [46 - 48]. Después del lavado, PUF se secan a 50 ° C la noche a la mañana y pesó. Las muestras fueron recolectadas PM extraído de la PUF 100% en metanol por sonicating 2 ó 3 veces en 30 min, cada vez añadiendo nuevas PM metanol para incrementar el rendimiento. Posteriormente, el metanol se elimina por evaporación a 30 ° C la noche a la mañana a dar muestras secas PM. Gruesos y finos PM fracciones, recogidos durante la semana 7 y 10 en el año 2002, se agruparon en este estudio que se ha obtenido una muestra integrada PM túnel de la autopista en la EIS (Túnel de carretera polvo, IDT). Una muestra del aire urbano PM (polvo de Ottawa; EHC-93) se recuperó de la bolsa de la aspiradora por la casa de filtros de la Salud Ambiental en el Centro de Ottawa, en Canadá se utilizó en este estudio como un segundo ambiente PM muestra. La composición química y biológica de la reactividad de EHC-93 se han descrito anteriormente [49, 50]. Además, la composición química de ambos IDT y EHC-93 se determinó en el presente estudio y los resultados se muestran en la Tabla 2.

La exposición por instilación intratraqueal

La Tabla 3 muestra el material de exposición y dosis de los diferentes grupos de animales (N = 10/group) utilizado en este estudio. Las ratas fueron expuestas a la I + DT en suspensión en solución salina (0,15, 0,5, 1,5 o 5 mg / ml) después de la anestesia con halotano 4% (Ceva, Maassluis, los Países Bajos) y infundido con un volumen de 2 ml / kg de peso corporal resulta en 0,3 , 1, 3 o 10 mg / kg de peso corporal. EHC-93 (5 mg / mL) fue empleado como muestra de referencia utilizado en estudios previos [7, 51, 52]. En pocas palabras, después de unos minutos de la anestesia con halotano 4% de la rata se fijó con la forelegs en una pequeña vertical (60 grados) tabla. El cuello fue encendida y una cánula se inserta por la boca hasta la tráquea justo por encima de la bifurcación. La correcta colocación de la cánula fue comprobada con una jeringa de 10 ml de vidrio cornwall 2193F BD (Becton Dickinson, Grenoble, Francia). Con la misma jeringa hiperventilación fue inducida para obtener un período de 3 segundos sin respiración del animal. Durante ese período, el volumen de solución salina o PM muestra fue inculcado a través de la cánula con una larga aguja que termina justo por encima del final de la cánula traqueal. Inmediatamente después de la instilación, la jeringa de vidrio se utiliza de nuevo un par de veces para inflar los pulmones y difundir el volumen infundido en los pulmones.

Necropsia

Dos horas antes de la necropsia, a los animales (N = 6/group) por vía subcutánea (sc) inyectadas con 40 mg / kg de peso corporal, 5-bromo-2-deoxyuridine (20 mg / mL BrdU; Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos ). En la necropsia, los animales fueron anestesiados con una mezcla de ketamina / Rompun (1 mL / kg de peso corporal de una ip 10:4 combinación de 100 mg / mL ketamina (Aesculaap, Boxtel, Países Bajos) y 20 mg / ml Rompun (Bayer, Leverkusen, Alemania)) y se sacrificaron por exsanguination través de la aorta abdominal. La necropsia se realizó a los 4, 24 o 48 horas después de la exposición. Saline perfusión de los pulmones se realizó a través del derecho ventriculum cardiaca sólo para los animales que no recibieron BrdU (N = 4/group). En este estudio, el pulmón derecho fue utilizado para obtener BALF después de la ligadura de la izquierda bronquios. El pulmón derecho fue lavaged (tres de entrada y salida utilizando lavages mismo líquido) con un volumen de solución salina correspondiente con 27 mL / kg de peso corporal a 37 ° C. El recuperado BALF se colocó en hielo. El pulmón izquierdo fue disecada, pesadas, y preservarse para histopatología después de la fijación de una hora con una presión constante de 20 cm H 2 O con el 10% de fosfato formalina tamponada.

Histopatología

El pulmón izquierdo fue incorporado en paraplast y 5 μ m de espesor secciones de pulmón de los animales expuestos a la salina, 3 o 10 mg / kg de IDT, y de 10 mg / kg EHC-93 (grupos experimentales 1 y 4-6; Cuadro 3] que los días 24 y 48 h después de la exposición fueron teñidas con hematoxilina-eosina (HE). Las lesiones patológicas se semiquantitatively, anotó ciegamente por microscopía de luz (mínima, leve, moderado, marcado y fuerte; N = 9-10/group). Por otra parte, los fondos acumulados por la proliferación de las células fue examinado por tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-BrdU (Boehringer, Mannheim, Alemania) etiquetados con peroxidasa. BrdU-etiquetado también fue anotado por semiquantitatively estimación de las zonas con mayor inflamatoria etiquetado índice (N = 6/group).

BALF análisis

El BALF de cada animal se centrifuga a 400 g, 4 ° C, durante 10 min. La celda libre de líquido de lavado fue la utilizada para las mediciones de toxicidad celular, la inflamación y el estrés oxidativo. El lavado de la pastilla se resuspendió en 1 ml de solución salina y se utiliza para el total de células, la preparación de cytospins para diferencial de células y medición de la viabilidad celular.

Análisis de sangre

Fibrinógeno, un marcador de la respuesta de coagulación, se determinó citrato en plasma (DiaFibrinogen kit Cat. No. 305100; DiaMed Benelux nv, Turnhout, Bélgica). El marcador de lesión endotelial temprana, vWF, que se decidió en citrato en plasma por ELISA (Kordia BV, Leiden, Países Bajos) usando mezcla de citrato en plasma de ratas no expuestas a preparar una norma de referencia. Cell se determinaron diferencias en EDTA (K 3) (Terumo Europe NV, Leuven, Bélgica) sangre anticoagulada utilizando una H1-E Multi Especies Analizador de Hematología (Bayer BV, Mijdrecht, Holanda). Los siguientes parámetros medidos fueron: blanco y las concentraciones de glóbulos rojos, plaquetas y las concentraciones de hemoglobina, el número de linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos granulocitos, así como el valor del hematocrito. El ET-1 precursor bigET-1 se midió por ELISA (IBL, Hamburgo, Alemania), sólo 24 y 48 horas después de la exposición.

Análisis estadístico

Todos los parámetros de efectos biológicos son log-transformado y, posteriormente, a dos del análisis de varianza (ANOVA) fue realizado. ANOVA de dos vías se utilizaron técnicas para evaluar las diferencias debido a la PM (IDT o EHC-93) la exposición, el día a día de variación (causada por diferentes necropsia días (N = 5) para un determinado tiempo después de la exposición) y su interacción . Las diferencias mencionadas se analizaron para los tres después de los tiempos de exposición (4, 24 y 48 h) por separado y Bonferroni se utilizó para los análisis post-hoc. En caso de ingreso, la transformación no se reflejó en la distribución normal del parámetro mide el test no paramétrico de Kruskal-Wallis rango suma de prueba (que se utiliza para los siguientes marcadores: BALF linfocitos y eosinófilos; viabilidad; proteína, la albúmina, IL-6, MIP - 2, y TNF-α a las 4 h; NAG, glutatión, GSSG, GSH, GSSG: GSH ratio, y en la UA 4, así como 24 horas después de la exposición; fibrinógeno; linfocitos de sangre; granulocitos basófilos) o firmado Wilcoxon rank test (OPG) se realizó para revelar diferencias entre grupos específicos. Los valores se expresan como medias ± error estándar de la media (SEM) y valores de p <0,05 se consideraron significativas. Todos los antes mencionados análisis estadístico se realizó mediante el software S-Plus (MathSoft, Inc). Los parámetros histológicos fueron estadísticamente con la prueba no paramétrica de Wilcoxon test.

Lista de abreviaturas

ANOVA - análisis de la varianza; ALP - alkalin fosfatasa; BALF - lavado broncoalveolar; BALT - broncoalveolar tejido linfoide; BrdU - 5-bromo-2-deoxyuridine; pc - peso corporal; CC16 - Clara proteína celular; EHC-93 - urbana PM Muestra, Ottawa polvo; ELISA - ensayo inmunoenzimático; ET-1 - endotelina-1; GSH - glutatión reducido; GSSG - glutatión oxidado; Excmo - hematoxilina-eosina; EIS--Hendrik ido Ambacht-; HVCI - cascada de alto volumen Impactador; IL-6 - interleuquina-6; LDH - lactato deshidrogenasa; MIP-2 - proteína inflamatoria de macrófagos-2; MPO - mieloperoxidasa; φ M - macrófagos; NAG - N-acetil glucosaminidase; OD - densidad óptica; PM - partículas; PBS - buffer fosfato salino; PBST - 10 mM PBS con 0,1% de Tween 20; PMNs - polimorfonucleares neutrófilos; PUF - espuma de poliuretano; ROFA - aceite residual cenizas volantes; IDT - Túnel de carretera de polvo; sc - subcutánea; SEM - error estándar de la Media; SH - espontáneamente hipertensas; TNF-α - factor de necrosis tumoral α; UA - ácido úrico; vWF - factor de von Willebrand

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MEG ha diseñado, coordinado y supervisado el trabajo experimental de este estudio, participaron en las autopsias incluida la recogida de muestras BALF, procesan los datos con inclusión de cuadros y cifras, llevado a cabo el análisis estadístico, y de interpretar los resultados y redactó el manuscrito.

AJFB participado en el diseño y la coordinación del estudio, llevado a cabo los experimentos in vivo incluyendo la manipulación de muestras, y participó en el análisis estadístico.

DLACL participado en el diseño, con el apoyo de los experimentos in vivo y la recolección de muestras de sangre y tejidos, llevado a cabo varios análisis de sangre y BALF.

JAMAD apoyado colección de tejidos de los pulmones, histopatología y realizó el análisis estadístico para esta parte del estudio.

TS es el coordinador general de la HEPMEAP proyecto y participó en el diseño del estudio y la interpretación de los datos.

ROS es el coordinador general de la PAMCHAR proyecto y participó en el diseño del estudio y la interpretación de los datos.

LvB RIVM es coordinador de la HEPMEAP proyecto y participó en el diseño del estudio y la interpretación de los resultados.

FRC es RIVM coordinador de la PAMCHAR proyecto, participó en la concepción del estudio, su diseño, la interpretación de los resultados y es co-autor del manuscrito.

Todos los autores han leído, revisado, aprobado y comentó el manuscrito final.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Resultados del cuerpo y peso de los órganos, BALF y los análisis de sangre mide las 4 horas de la exposición.
Los análisis se realizaron sobre material de las partículas o solución salina SH ratas expuestas. Los valores se muestran como los medios y el 95% intervalo de confianza (IC). Los valores de p <0,05 se consideran significativas en comparación con solución salina. * P <0,05, ** P <0,01 y *** P <0,001.
Archivo Adicional 2
Resultados del cuerpo y peso de los órganos, BALF y los análisis de sangre mide 24 horas después de la exposición.
Leyenda e importancia como se indica en el
Archivo Adicional 3
Resultados del cuerpo y peso de los órganos, BALF y los análisis de sangre mide 48 horas después de la exposición.
Leyenda e importancia como se indica en el
Agradecimientos

Esta investigación se ha llevado a cabo en el marco de dos proyectos europeos, titulado «Los efectos sobre la salud de los gases de escape del motor de motor y la contaminación ambiental (HEPMEAP; QLRT-1999-01582)" y "caracterización química y biológica del aire ambiente gruesas, finas, y las partículas ultrafinas de De evaluación de riesgo para la salud humana en Europa (PAMCHAR; QLK4-CT-2001-00423) ". Ambos proyectos han sido financiados por el EC_FP5 Calidad de vida y gestión de los recursos vivos ". Así pues, gracias Vincent Renaud del Centro de Salud Ambiental, Ottawa, Canadá para proporcionar EHC-93, y el Prof Gurmukh Singh Centro Médico VA de la Universidad de Pittsburgh y de la Escuela de Medicina de la prestación de los anti-CC16 suero. También damos las gracias a Rodger Duffin del Institut für umweltmedizinische forschung gGmbH en Düsseldorf, Alemania para realizar el plan maestro de operaciones de medición. Además, los autores desean reconocer la Sra JP Vermeulen por su asistencia y histotechnical Ingeborg M. Kooter para la lectura crítica del manuscrito. Este estudio se ha presentado, en parte, en la AAAR PM Reunión en 2003.