Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 10-10 (más artículos en esta revista)

Efectos de ICI 182780 en la expresión del receptor de estrógeno, la absorción de líquidos y la motilidad de los espermatozoides en el epidídimo del capó mono

BioMed Central
Deshpande Shayu (shayu@biochem.iisc.ernet.in) [1], Chenna CS Kesava (csckeshav@yahoo.com) [3], Rama Soundarajan (ramas_18in@yahoo.com) [2], A Jagannadha Rao (ajrao @ Biochem.iisc.ernet.in) [1]
[1-560012, India
[2] Department of Medicine, Division of Nephrology, University of California San Francisco, SanFrancisco 94143, USA
[3] Department of Clinical Research, University of Bern, 120 Tiefenaustrasse 3004, Bern, Switzerland

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Resumen
Antecedentes

La importancia de los estrógenos en la regulación de la absorción de líquidos y la maduración de espermatozoides en el epidídimo de roedores se ha establecido a partir de estudios sobre los receptores de estrógenos alfa-knockout mice. Sin embargo, los estudios funcionales sobre el papel de los estrógenos en el epidídimo de primates han sido pocos. El principal objetivo de este estudio es, por tanto, a ampliar el ámbito de estas observaciones y analizar sistemáticamente la presencia y la función de receptores de estrógenos en la modulación de la función de los primates epidídimo, utilizando el capó mono (Macaca radiata) como un modelo de sistema.

Métodos

Un esteroide receptor de estrógeno (ER) antagonista, ICI 182,780 (ICI), se administró a los adultos de sexo masculino capó monos osmótica a través de mini-bombas con una duración de 30 a 180 días. La expresión de los principales genes regulados-estrógeno (ER-alfa, Na-K ATPasa alfa-1 y Aquaporin-1) ha sido analizado en puntos específicos de tiempo. Además, el efecto de ICI en la modulación de la reabsorción de líquidos en eferentes ductules se vigila, y la crítica de esperma de los parámetros de maduración se analizaron.

Resultados

Nuestros estudios en el capó mono reveló que ambos ER-ER-alfa y beta se expresaron en todas las tres regiones del epidídimo. Hemos observado un aumento de la ER-alfa ARNm y proteínas en la cabeza de ICI-monos tratados. El estado de equilibrio los niveles de mRNA de la proteína canal de agua, Aquaporin-1, fue significativamente inferior en el ICI-cápita de los monos tratados en comparación con los controles, mientras que los niveles de ARNm de la Na-K ATPasa alfa-1 sigue siendo la misma. In vitro de incubación de eferentes ductules con ICI se debió en aumento al doble en tubulares de diámetro, lo que indica la capacidad de reabsorción de líquidos afectados. Además, el esperma de ICI fueron tratados con monos immotile.

Conclusión

En conjunto, nuestros resultados apuntan a un papel integral para estrógenos en la modulación de las funciones del capó mono epidídimo. Este estudio también demuestra las posibles diferencias en la fisiología del epidídimo de los roedores y primates no humanos, y, por consiguiente, subraya la importancia de los informes como éstos, que estudiará la fisiología de los primates no humanos (a diferencia de los roedores), en un intento de comprender Eventos similares en los humanos.

Antecedentes

Espermatozoides testiculares mamíferos son incapaces de fertilizar óvulos. La metamorfosis de inmaduros en espermatozoides maduros, unidades funcionales capaces de motilidad progresiva y la fecundidad, se piensa que es el resultado de un complejo y altamente regulado serie de eventos que se producen durante su tránsito por la eferentes ductules y el epidídimo. El epidídimo consta de los túbulos que forman un conducto para atravesar los espermatozoides de la ductules eferentes a los conductos deferentes. Es anatómicamente dividido en tres partes de la cabeza (la cabeza), una pequeña porción central-el corpus (el cuerpo) y de la cauda (la cola). El epitelio de revestimiento de los túbulos segrega estos iones y de las proteínas, reabsorbs líquido testicular y crea un ambiente luminal especializados para la maduración de espermatozoides testiculares [1]. Estas importantes funciones de la eferentes ductules y el epidídimo están regulados por una compleja interacción de factores de crecimiento y hormonas.

Estudios recientes apuntan a la participación de los esteroides, la hormona estrógeno, en la regulación de la reabsorción de líquidos en el eferentes ductules [2, 3]. La acción de los estrógenos es clásicamente mediada a través de receptores de estrógenos y α - β (ER ER α y β), que están presentes en el tracto reproductivo masculino de varias especies [4]. ER ER α y β knockouts (ERKO α y β ERKO) en ratones han proporcionado información valiosa sobre el papel de los estrógenos en la fisiología de la reproducción masculina. El macho α ERKO ratones fueron infértiles [5, 6] con graves cambios morfológicos, perturbado espermatogénesis, y la dilatación de las pupilas eferentes ductules debido a la mayor acumulación de fluido [7]. En contraste, los ratones machos β ERKO eran fértiles y tenían un sistema reproductor que parece normal [8], mientras que el doble masculino (α y β) ratones knockout eran infértiles, y su tracto reproductivo tenía una α-ERKO como la morfología. En conjunto, estas observaciones sugirió que, al menos en roedores, funcional ER α es necesaria para mantener la fertilidad y la morfología normal de la ductules eferentes. En apoyo de este punto de vista, los últimos estudios en ratones han demostrado que el estrógeno podría regular la expresión de las principales moléculas implicadas en el transporte de iones, lo que resulta en la modulación de la reabsorción de líquidos en el eferentes ductules [3].

El papel de los estrógenos en el epidídimo es, sin embargo, menos claro. Si bien un alto nivel de expresión ER α se ha encontrado en la ductules eferentes de los seres humanos y los primates no humanos, la expresión de ER α en el epidídimo de la misma especie ha sido esporádica [9]. La expresión de ER β, sin embargo, se ha detectado a lo largo del tracto reproductivo masculino [9]. Ahora, es bien sabido que la maduración espermática no es intrínseca a las células de esperma sí mismos, sino que requiere la interacción de los espermatozoides con proteínas que se sintetizan y secretada por el epitelio epididimario en una manera muy regionalizado. Dada la posible importancia de los estrógenos durante el desarrollo del sistema reproductivo masculino, y la creciente posibilidad de que la expresión regional de cada gen en el epidídimo puede en realidad reflejan diferencias funcionales, la importancia de la región-el análisis de los patrones de expresión restringida de los receptores estrogénicos, es evidente. Ese análisis detallado de ER ER α y β patrón de expresión, a lo largo del epidídimo, proporcionará información valiosa en la búsqueda de determinar las funciones específicas de la región necesaria para la maduración del esperma. Asimismo, comparativa esclarecimiento de la ER α y β ER perfiles de expresión en los diferentes segmentos del epidídimo es un paso crucial hacia el descubrimiento de los reguladores y de las diferencias funcionales (si la hay) entre ellos.

Estudios en roedores han sugerido un posible papel de los estrógenos en la modulación de la función del epidídimo [10]. Ahora, si bien la organización general y funciones de los primates no humanos, epidídimo son similares a la de otros mamíferos, como los roedores [11], existen obvias limitaciones en la extrapolación de los resultados de estos modelos para los primates epidídimo. Algunos estudios realizados con babuinos y macacos utilizando tejidos han sugerido la presencia de receptores específicos para estrógenos en el epidídimo de primates [12, 13]. Sin embargo, los estudios funcionales detallado de los patrones de expresión de primates epidídimo junto con mecanicista correlaciones en el nivel molecular, ha sido escasa. Por lo tanto, con el fin de entender mejor el papel de los estrógenos en el epidídimo de los primates no humanos, que iniciaron estudios utilizando el capó mono (Macaca radiata) como un modelo de sistema. Debido a su estrecha similitud con el sistema humano, este trabajo mediante capó mono epidídimo, los permisos significativa extrapolación a los seres humanos. Esto es aún más importante, teniendo en cuenta el hecho de que es muy difícil obtener muestras humanos epidídimo (reproductivamente a una edad adecuada) para fines de investigación.

Se analizó la distribución de la ER α y β ER, en las tres regiones del capó mono epidídimo, utilizando Transcripción Reversa---Cadena de la Polimerasa-Reaction (RT-PCR), análisis de Western blot e inmunohistoquímica. Seguidamente, se estudió el efecto del estrógeno sobre el bloqueo patrón de expresión de las proteínas clave que se sabe están involucrados en la reabsorción de líquidos. El estrógeno acción fue bloqueado mediante la bien establecida antagonista de los receptores de estrógeno, ICI 182,780 (ICI), que puede obligar tanto ER ER α y β. Es importante tomar nota de que este compuesto no atraviesa la barrera hematoencefálica [14, 15] y, por lo tanto, los niveles de gonadotropinas y testosterona permanecer sin cambios durante el tratamiento [16]. Esto nos permite examinar los efectos de estrógeno auténtico. Bonnet monos fueron implantados con mini-bombas que contienen ICI osmótica de variada duración, la más larga durante un período de 180 días, que es mayor que la duración de tres rondas de la espermatogénesis en el mono [17, 18]. El efecto del tratamiento fue estudiada a nivel molecular mediante el análisis de la expresión de ER α, Aquaporin-1 (AQP-1) y Na + K + ATPasa de α1, los genes que se sabe que juegan un papel clave en la modulación de la reabsorción de líquidos. Es importante señalar que, entre las diferentes regiones del epidídimo, la cápita es la más activa en la síntesis de proteínas y de la secreción de [19]. Muchos de los genes somáticos reproductiva y estudiado, son o bien exclusivamente o exhibir expresó el más alto nivel de expresión en esta región. Por otra parte, la región de la cabeza del epidídimo se ha demostrado ser extremadamente sensible a la acción de los estrógenos [20, 21]. Teniendo en cuenta todos estos hechos, nuestros estudios se limitaron al análisis de la región cápita.

Curiosamente, además de la alteración de la reabsorción de líquidos α ERKO observado en ratones, Eddy et al, observaron que la mayoría de los espermatozoides del epidídimo recogidos, mostraron disminución de la motilidad y que incluso la pequeña fracción de espermatozoides con motilidad normal eran incapaces de fertilizar ovocitos de tipo salvaje [ 6], lo que indica, por primera vez, que el estrógeno es probablemente esencial para la función de los espermatozoides en sí, en los roedores. Nuestros propios estudios anteriores [22] en el que Tamoxifeno (otro antagonista del receptor de estrógeno) fue administrado crónicamente a través de bombas Alzet hombre adulto capó monos, reveló que estos monos son infértiles y había un porcentaje muy alto de espermatozoides anormales, que exhibió pobre motilidad, aunque No hubo efectos adversos en los niveles de testosterona sérica. Estos resultados sugieren la posibilidad de que el estrógeno puede desempeñar un papel en la maduración de espermatozoides en los primates no humanos también.

En un intento por evaluar el papel de los estrógenos en la regulación de la maduración de los espermatozoides durante su tránsito por el epidídimo, que supervisó todos los espermatozoides en el ICI-monos tratados capó, hasta 180 días. Asimismo, en los 180 días ICI monos tratados, la motilidad de los espermatozoides fue analizado. En este sentido, es pertinente señalar que la motilidad espermática se utiliza a menudo como un parámetro crucial para evaluar la maduración del esperma [23].

Materiales y Métodos
Los animales y el tratamiento

Adulto de sexo masculino capó monos (Macaca radiata; 6-8 kg de peso), de fertilidad probada, que exhibió una clara nocturna aumento de testosterona en suero, fueron reclutados en el estudio. La importancia del aumento nocturna de testosterona en suero como un índice de la función reproductora masculina que se ha descrito anteriormente [24, 25]. Todos los animales seleccionados para el estudio, mostraron recuento de espermatozoides en el rango de 150-500 millones / eyaculado. El mantenimiento de los animales se ha descrito anteriormente [26]. Todos los procedimientos de utilización de los animales fueron aprobadas por el Comité de Ética del Instituto Indio de Ciencia (Protocolo N º 21).

Animales (3 por grupo) se administraron antagonista de los receptores de estrógenos ICI 182,780 (un anti-estrógeno puro, una especie de regalo del doctor Wakeling AE, Zeneca Pharmaceuticals, UK) en glicol de propileno (250 μ g ICI / día / animal), a través de bombas Alzet ( Modelo 2ML4; Alza Corporation, Palo Alto, CA), que se cambian cada 28 días. Como control, un grupo de animales fue vehículo (propilen glicol)-tratadas. Al final del período de tratamiento (es decir, 30 o 60 días), los animales fueron sometidos a la castración unilateral en condiciones asépticas, la utilización de procedimientos quirúrgicos. El epidídimo se disecó el tejido libre de grasa, que se divide en cabeza, cuerpo y cauda regiones, lavada ampliamente en PBS (pH 7,4) para eliminar los espermatozoides, y procesadas para inmunohistoquímica y RT-PCR. La separación de las distintas regiones del epidídimo se realizó de la siguiente manera: las regiones de un cm de la anterior y posterior termina fueron disecados como cápita y cauda, respectivamente. Una región cm en el centro del epidídimo, aproximadamente equidistante de la cápita y la cauda fue delineado como corpus. Los tejidos fueron almacenados en líquido de Bouin inmunohistoquímica o flash congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -70 ° C hasta que se precise para su posterior extracción de RNA. Análisis de la motilidad de los espermatozoides se llevó a cabo con ejaculates de 180 días ICI capó monos tratados.

Medición de la hormona

Radioinmunoensayo métodos se basan en el procedimiento de normalización en el laboratorio [25]. El antisuero de testosterona se planteó en contra de la testosterona conejos 3-carboxi methyloxime BSA conjugada y la reactividad cruzada con otros esteroides resultaron ser insignificantes. La intra e inter ensayo de variación fue de 4,8% y 7,6%, respectivamente. Los valores reportados son no según la recuperación.

Semi-cuantitativos de análisis RT-PCR

Total de ARN de tejidos epidídimo se aisló utilizando el TRI de reactivos (productos químicos Sigma Co, St Louis, MO) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La integridad del ARN aislado se verificó el 1% MOPS-HCHO gel de agarosa y la cantidad de ARN estimado por espectrofotometría. Transcripción reversa se llevó a cabo tal y como se describe anteriormente [27, 28] con controles adecuados.

CDNA amplificaciones utilizado muy específicos primers adelante y atrás con un calentamiento inicial a 94 ° C durante 3 minutos, seguido por 28 ciclos de 94 ° C durante 1 minuto, temperatura de 1 minuto y 72 ° C durante 1 minuto, en una PCR Térmica Termociclador (MJ Research Inc, EE.UU.). PCR datos son compilados en la Tabla-1. Una alícuota de 10 μ l del producto de PCR fue electrophoresed en un gel de agarosa al 1,5% y visualizados a la tinción con bromuro de etidio. Cada figura es representativa de por lo menos 4 experimentos independientes. La amplificación de GAPDH (Glyceraldehyde 3-fosfato deshidrogenasa) sirvió como control interno.

La autenticidad de la RTPCR todos los productos descritos en este estudio fue confirmado por la secuencia, después de su depuración de bajo punto de fusión geles de agarosa utilizando el disponible en el comercio GFX ™ PCR DNA / Gel Band Purification kit (Amersham Pharmacia Biotech., Reino Unido). Secuenciación se realizó en el servicio de secuenciación de ADN, IISc, utilizando el ABI Prism 377 automatizados secuenciador de ADN.

Preparación de la proteína lisados

Las piezas se lavó extensamente con PBS (pH 7,4) y homogeneizada en la presencia de helado buffer de lisis (50 mM Tris pH 8.0,150 mM cloruro sódico y 0,1% de SDS, 0,02% Azida de sodio, 1% Nonidet-P40 y 0,5 Deoxycholate% de sodio), que contiene 100 μ g / ml PMSF y 1 μ g / ml aprotinina. Proteína lisados fueron aclarados por centrifugación a 15000 × g durante 20 minutos a 4 ° C, y el contenido de proteína se determinó por el ensayo de Bradford [29]. Alícuotas de las proteínas de lisado se almacenaron a -70 ° C hasta el análisis. Todos los productos químicos utilizados para la lisis fueron adquiridos de Sigma Chemical Co, St Louis, Mo

Análisis Western Blot

Igualdad de cantidades de proteínas (100 μ g) fueron electrophoresed el 10% SDS-geles de poliacrilamida y transferidas a nitrocelulosa (sartorio AG, Alemania) membranas, utilizando un semi-seco de transferencia de los aparatos. Western blot se realizó tal como se describe anteriormente [27]. Después de la hibridación, la mancha fue desnudado y re-probaron (utilizando el protocolo recomendado por los fabricantes, Amersham Pharmacia Biotech, UK) para la actina que sirvieron de control interno para la evaluación de la igualdad de proteínas de carga. ER α anticuerpo se utilizó en una dilución de 1:200. ER β actina y anticuerpos primarios fueron utilizados en la dilución de 1:400. Todos los anticuerpos se compraron desde Santa Cruz de Biotecnología Inc, CA. Cada figura es representativa de al menos 3 experimentos independientes.

Inmunohistoquímica

Monkey epidídimo tejido se fijó en líquido de Bouin, deshidratados, incluidas en parafina utilizando los métodos [30] y seccionaron a las 8 μ m de espesor. Tras deparaffinization y rehidratación, las secciones se pre-tratados con metanol-peróxido de hidrógeno a la amortiguación por actividad endógena de peroxidasa, seguido de un tratamiento por microondas en 0,01 M (pH 6,0) citrato buffer [31]. Las secciones fueron teñidas con arreglo a la doble PAP (peroxidasa-anti-peroxidasa) técnica [32] con diaminobenzidine (productos químicos Sigma Co, St Louis, MO, EE.UU.) como cromógeno. Las secciones fueron teñidas con contra-azul de toluidina, deshidratados clasificado con concentraciones de etanol y xileno y analizada por microscopía. Cabra anti-conejo IgG en suero de conejo y de cabra anti-IgG en suero, adsorbida contra proteínas humanas se obtuvo de anticuerpos Inc, Davis, CA. La cabra y el conejo-peroxidasa anti-peroxidasa complejos fueron obtenidos de los laboratorios Jackson ImmunoResearch, West Grove PA y diaminobenzidine se obtuvo de Aldrich, Inc, Milwaukee, WI. Anti-ER-ER α y β anticuerpos, adquiridos a SantaCruz Biotecnología Inc, CA, se utilizaron en una dilución óptima de 1:200.

Como control positivo para ER α tinción inmuno-peroxidasa, hemos utilizado tejidos útero de ratón [33]. Como control positivo para la tinción de ER β hemos utilizado tejido de la próstata ventral de rata [34]. Pre-incubación de la ER α anticuerpo con el correspondiente bloqueo de péptido (SantaCruz Biotecnología Inc, CA) antes de la tinción, sirvió como un control negativo. Como control negativo de la ausencia de manchas ER β, hemos utilizado el tejido hepático de rata [34]. La omisión de la primaria de anticuerpos a partir de la experiencia sirvió como otro control negativo.

Analizando el efecto de ICI sobre tubulares de diámetro eferentes ductules

Tras la castración de los monos no tratados, la eferentes ductules fueron identificados y separados por micro-disección, picada y se colocan en el medio de la composición que se detallan a continuación, durante 24 horas. Ambos extremos fueron el estéril 4-0 con ligated cat gut (Johnson, India), para impedir el flujo de en-medio. El ligated eferentes ductules fueron incubadas en medio M-199 (Sigma Chemical Co, St Louis, MO), que contiene albúmina de suero de bovino (500 μ g / ml; Sigma Chemical Co, St Louis, MO), el 17 β-estradiol (1 NM; Steraloids Inc, Wilton, NH, EE.UU.) y la dihidrotestosterona (1 nM; Steraloids Inc, Wilton, NH, EE.UU.), a 34 ° C, en el aire humidificado 95% / 5% de CO2, durante 24 horas, con ( Prueba) o sin (control), ICI (1 μ M). Al final del período de incubación total, las muestras fueron fijadas en Bouin rápidamente y posteriormente incluidas en parafina utilizando los métodos convencionales [30]. 5 μ m se cortaron secciones, manchados en hematoxilina y eosina, y analizados con microscopia de luz. El control de los diámetros de ambos tratados con ICI y eferentes túbulos fueron medidos en el punto mínimo y tabulados.

Espermatozoides y análisis de la motilidad

Los detalles de electroejaculation y análisis de esperma se han descrito anteriormente [35]. Semen de los monos fue recogida por electroejaculation por el método de pene [35]. Ejaculates se mantuvieron a 37 ° C durante todo el período de examen, que no exceda un total de 90 minutos. Espermatozoides se determinó a través de Neubauer hemacytometer siguientes 1:200 dilución del semen en la solución salina. El número de espermatozoides vivos se determinó a través de eosina-nigrosin mancha. Motilidad del semen se analizó utilizando un sistema asistido por computadora sistema de análisis de semen (CASA, Hamilton-Thorne Research, MA). Semen muestra se diluye 20 veces con Tris buffer de pH 7,4 y empleadas para el análisis. Una sola gota de la muestra de semen diluido fue añadido a la cámara de Makler (10 μ M) y se inserta en la cámara de alimentación de CASA. El esperma de cada mono se analizaron de la siguiente moción parámetros: el porcentaje de espermatozoides móviles, el porcentaje de espermatozoides móviles progresivamente, la velocidad media de camino, la velocidad curvilínea, el desplazamiento lateral de la cabeza, rectitud ([línea recta de velocidad / velocidad media de camino] × 100) y Linealidad ([línea recta de velocidad / velocidad curvilínea] × 100). El análisis se llevó a cabo con el siguiente instrumento de configuración: 30 fotogramas a una velocidad de 60 Hz; mínimo tamaño de la celda, 5 píxeles; mínimo contraste, el 80. Todos estos procedimientos se realizaron a 37 ° C.

El análisis estadístico de los datos (si procede)

Los datos se representan como media ± SE de al menos tres experimentos independientes realizados con el mismo protocolo de tratamiento. Para la comparación entre los grupos en los que participan dos columnas importancia se evaluó usando la unpaired dos colas t-test. Para la comparación de los datos en la que había tres columnas, la significación estadística se obtuvo utilizando el Test de Kruskal-Wallis ANOVA seguido de Neuman-Keuls test. En ambos casos es un valor de p menor o igual a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.

Resultados
1. RT-PCR para el análisis de ER α, AQP-1 y Na + K + ATPasa α1-en las tres regiones del epidídimo

Con el fin de determinar la presencia de ER α en el capó mono epidídimo, el RNA de la cápita, corpus y cauda fue objeto de análisis RT-PCR usando primers específicos. Todos los informes de terminación de proyecto se realizaron dentro de la gama de amplificación lineal con GAPDH como el control interno. Alto nivel de ER α mensaje se detectó en el caput, corpus y cauda regiones (Fig 1a]. Las tres regiones no difieren considerablemente en su nivel de expresión. Ha sido bien documentado que las eferentes ductules de roedores expresar componentes como AQP-1 y Na + K + ATPasa, que son importantes para la absorción de líquidos [3]. Por lo tanto si analizamos estos componentes de la maquinaria de absorción de líquidos estuvieron presentes en el epidídimo mono capó y, además, su distribución dentro de las tres regiones. Análisis del estado de equilibrio los niveles de mRNA de estos genes específicos reveló señales para cada uno de estos componentes en todas las tres regiones del mono epidídimo, con diferentes niveles de expresión. Observamos un dos veces más alta expresión de AQP-1 en la cauda en comparación con la cabeza. El nivel de expresión de la Na + K + ATPasa de α1 era cuatro veces más altos que en el corpus y cauda en comparación con la cabeza.

2. Immunolocalization de ER ER α y β en las tres regiones del capó mono epidídimo

Intensa tinción para ER α se observa en todas las tres regiones es decir, la cápita, corpus y cauda, el capó del mono epidídimo (Fig 2a]. Tinción fue localizada principalmente a los núcleos de las células del epitelio de revestimiento del lumen. Sin embargo, la debilidad de la tinción se observó también en el entorno periurbano tubular núcleos de músculo liso y en el músculo liso vascular núcleos. Pre-incubación de la primaria de anticuerpos con el péptido bloquea completamente abolido tinción constitutivo de la especificidad de los anticuerpos. Una intensa señal también se observó útero de ratón con el que se utilizó como control positivo.

Las tres regiones del epidídimo teñidas intensamente para ER β (Fig 2b]. Intensa tinción se observó en la peri-tubulares y núcleos de músculo liso vascular. Tinción fue también observado en el núcleo de células epiteliales tubulares de caput, corpus y cauda regiones. El citoplasma en estas células también fue débilmente teñidas. Esta tinción está en agudo contraste con la ER α manchas que era en su mayor parte limitada a los núcleos de las células epiteliales tubulares. Como control positivo para la tinción de ER β, hemos utilizado tejido de la próstata ventral de rata, en la que una intensa tinción nuclear podría ser observado. No se observó ninguna tinción con el tejido hepático de rata, que se utilizó como control negativo.

3. Efecto del tratamiento sobre la ICI capó mono niveles de testosterona sérica

Nuestros resultados mostraron que no hubo cambios en los niveles de testosterona en suero de 30 días, 60 días o 180 días ICI-monos tratados (Fig 3]. Nocturna aumento de testosterona en suero también se mantuvo inalterada. Esto está de acuerdo con los informes anteriores de que ICI no atraviesa la barrera hematoencefálica [15] y, por tanto, no altera el perfil hormonal.

4. Perfil de expresión de ER α, AQP-1 y Na + K + ATPasa de α1 en la región cápita de 30 días y de 60 días ICI tratados mono: RT-PCR análisis

Con el fin de evaluar el efecto del tratamiento sobre la ICI en el estado de equilibrio de los niveles de mRNA ER α, AQP-1 y Na + K + ATPasa de α1, ARN del vehículo y tratados ICI-cápita regiones fue sometido a análisis RTPCR usando primers específicos. Un aumento de 4 veces se encontró para ER α en el ICI de 30 días de tratamiento en comparación con las muestras de control del vehículo (Fig 4 bis]. También se observó un aumento significativo de la ER α mensaje en el ICI de 60 días de las muestras tratadas (Fig 4b]. Un doble reducción en el mensaje de AQP-1 se observó en la cabeza de ambos 30 - y de 60 días ICI monos tratados en comparación con los correspondientes controles de vehículos. En marcado contraste, no se observan cambios significativos en la expresión de la Na + K + ATPasa de α1 entre el vehículo y el control de las muestras tratadas con ICI (Fig 4 bis, b]. Estos resultados indicaron que el tratamiento ICI afecta significativamente ER α AQP-1 y los niveles de mRNA en la región de la cabeza del epidídimo.

5. ER α expresión en la región de la cabeza del vehículo y el ICI tratados capó mono epidídimo: Inmunohistoquímica

Para determinar si el aumento de la ER α mRNA observado en el ICI-cápita muestras tratadas fue realmente refleja a nivel de proteínas, immunolocalized ER α en estas secciones usando un bien caracterizado de anticuerpos (fig. 5]. Curiosamente, no se aprecia en la ER α señal en el ICI de 30 días de las muestras tratadas cápita (en comparación con un vehículo de control), a pesar de que había observado un aumento significativo de la ER α mRNA en este momento de punto (comparar con la figura 4]. Sin embargo, un significativo aumento de la ER α expresión se observó en los 60 días de ICI-muestras tratadas cápita (en comparación con el correspondiente control del vehículo), lo que refleja el aumento de los niveles de mRNA observado en la Figura 4.

6. Efecto de la ICI en la capacidad de reabsorción de líquidos eferentes ductules

Fin de determinar si la incubación in vitro de eferentes ductules ICI afectados con la reabsorción de líquidos. Eferentes ductules fueron escogidos para el estudio, como en informes anteriores se ha demostrado que estas absorben la mayor parte del líquido testicular y, por tanto, nos motivado que el efecto de ICI en la reabsorción de líquidos debe ser fácilmente discernible en estos túbulos. Después de 48 h de incubación de la duración total de ICI, se apreció casi dos veces más en la eferentes ductule diámetro en comparación con el control ductules incubadas sin ICI (fig. 6]. Estos resultados apoyan las observaciones (en roedores) formuladas por otros trabajadores, que mostraron que eferentes ductules son muy sensibles a la falta de estrógenos [36]. Desde este experimento se llevó a cabo con eferentes ductules normal de los monos, se descartó cualquier posible participación de los factores que se testicular modulada por en-vivo ICI tratamiento e indirectamente en la regulación de la absorción de líquidos ductules eferentes.

7. Efecto de la ICI en espermatozoides y la motilidad

A corto plazo (período de 30 días) y largo plazo (período de 180 días) ICI tratamiento no tiene efectos perjudiciales para la esperma en todos los monos en la prueba dada la dosis y la duración del tratamiento (Figura 7]. Todas las muestras analizadas tenían más de 90% de espermatozoides viables como prueba por nigrosin mancha-eosina (datos no presentados).

Discusión

A nuestro entender, este es el primer estudio que demuestra la presencia de los receptores estrogénicos, ER α y - β, en las tres regiones del capó mono epidídimo. En contraste con estudios previos [9, 37], que no se habían podido detectar ER α mono tití en el epidídimo, nuestros resultados muestran la expresión inequívoca de ER α tanto en el nivel de ARNm y proteínas en las tres regiones del capó mono epidídimo. ER α localización de la proteína fue prominente en los núcleos de las células epiteliales tubulares forrado en el lumen mientras ER β se expresó abundantemente tanto en el epitelio y el estroma. La importancia fisiológica de este patrón de tinción diferencial de los dos subtipos de receptores en Macaca radiata epidídimo es en la actualidad, claro. La presencia de ER β en la células del estroma, además del epitelio, es interesante como células epiteliales-estromales interacciones han demostrado modular la respuesta a los estrógenos [38]. Aunque hay una considerable superposición regionales en la expresión de ambos ER-α y - β, más específicos se necesitan estudios para evaluar la abundancia relativa y la co-expresión de los dos receptores. No obstante, la presencia de los receptores de manifiesto una plausible función de los estrógenos en la fisiología del capó mono epidídimo.

ER antagonistas de proporcionar una buena herramienta para estudiar el efecto de la falta de acción de los estrógenos en el tejido diana. ICI 182780, un antagonista del ER, cuando se administró a ratones durante 35 días produjo un α ERKO-efecto [39]. En el actual estudio, el efecto del tratamiento sobre la ICI cápita de la región capó mono epidídimo se examinó. ER α mRNA expresión se aumentó en la región de ambos cápita 30 - y de 60 días ICI-monos tratados. Un incremento apreciable en ER α la expresión de la proteína se observó también en la cabeza de 60 días ICI-grupo tratado. En esta coyuntura, es importante señalar que, la mayoría de los estudios en roedores han informado una disminución en el nivel de los receptores de ICI con el tratamiento [40 - 42], con la excepción del endometrio, donde no ha habido cambios en el nivel del receptor fue visto con ICI Tratamiento [43]. Curiosamente, los resultados de nuestro laboratorio también mostraron disminución de ER α expresión en la cabeza de los roedores tratados con ICI (datos no publicados). Por lo tanto, es posible que el incremento en la expresión de los receptores en el ICI-cápita de los tratados capó mono podría ser un efecto específico de la especie. Esta diferencia pone de relieve la importancia de estudios como estos, que estudiará la fisiología de los primates no humanos (a diferencia de los roedores), en un intento de entender los eventos similares en los humanos.

Alteración de la producción de esperma en ratones macho α ERKO Se ha sugerido que, debido a la interrupción de la acción de los estrógenos dentro de la células somáticas de los testículos y el sistema de conductos excurrent en que la absorción de líquidos no producen. Transporte de fluidos es predominantemente facilitado por una familia de proteínas llamadas canal de aguas aquaporins. Este movimiento del agua a través de la membrana celular depende de la gradiente de concentración, que es mantenida por intercambiadores de iones como el Na + K + ATPasa-bomba, Na +-H + intercambiadores, los canales de cloruro, etc Estudios en roedores eferentes ductules sugiere Que los estrógenos pueden intervenir en la regulación de aquaporin-1 (AQP-1) y Na + K + ATPasa de α1 expresión [39, 44], aunque el mecanismo exacto todavía no está claro.

Nuestros experimentos en el capó mono robusto reveló expresión de AQP-1 y Na + K +-ATPasa α1-en las tres regiones del epidídimo. Esto está de acuerdo con estudios previos en roedores ductules eferentes que también mostraron alta expresión de AQP-1 y Na + K +-ATPasa-α1, dos proteínas importantes para el mantenimiento del equilibrio de líquidos y de iones [2]. El efecto del tratamiento ICI sobre la expresión de estas proteínas fue similar para ambos de 30 días y 60 días de los tratamientos. Una disminución significativa se observó en AQP-1 mRNA niveles de ICI con el tratamiento, mientras que Na + K +-ATPasa-α1 niveles no varían sensiblemente. Estos resultados son consistentes con los resultados anteriores, lo que demuestra que AQP-1 expresión es modulada por los estrógenos en la eferentes ductules de roedores y monos [44, 45]. En vista de todas estas observaciones, es sorprendente que al parecer no hubo efectos adversos en la eferentes ductules en AQP1-ratones knockout [44]. Según lo propuesto, esto puede deberse a la existencia de mecanismos compensatorios como paracellular circulación de agua o la participación de otras isoformas de AQP.

Adicionalmente, se determinó que la incubación de eferentes ductules con ICI in vitro, llevado a un aumento en el diámetro de lumen que indique la ausencia de participación de los factores testicular líquido en la regulación de la absorción. Aunque el aumento de la ER α expresión a ICI tratamiento fue en agudo contraste con las observaciones formuladas anteriormente, el ICI de los efectos de tratamiento, es decir, el fallecimiento en AQP-1 de expresión y de aumento de la luz de diámetro, fueron similares a los observados en el modelo de roedores. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la absorción de líquidos en el capó mono excurrent conductos ICI se ve afectada por el tratamiento, lo que sugiere un papel de los estrógenos en este proceso.

Como final de lectura de ICI-tratamiento, analizamos crítica parámetros de maduración de los espermatozoides en el ICI de los monos tratados. Los estudios han demostrado que la administración de inhibidores de la aromatasa-redujo el tiempo de tránsito de los espermatozoides y que esos espermatozoides no son capaces de fertilización [46, 47]. Esperma de los α ERKO ratón también mostraron disminución de la motilidad [6]. En nuestro estudio también se observó que el esperma de los 180 días ICI-monos tratados, reveló una pronunciada disminución de la motilidad. El tratamiento afectó el ritmo de frecuencia y la motilidad progresiva de espermatozoides, lo que es indicativo de una pérdida en sus posibilidades de fertilización. Curiosamente, el tratamiento de estos efectos inducidos se produjo en la ausencia de cualquier alteración evidente en la morfología de los espermatozoides o de la producción de esperma, como de espermatozoides en los monos tratados fue normal. Esto indica que el tratamiento fue probablemente afectan el proceso de maduración y no tanto el proceso de producción. Se sabe que los espermatozoides y de las proteínas de la membrana se someten a varias modificaciones durante la maduración en el epidídimo. Por tanto, es razonable prever que algunos de los procesos que intervienen en la maduración puede ser alterada, conduciendo a la disminución de la motilidad espermática. Estos efectos se observaron en la ausencia de cualquier cambio detectable en los niveles de testosterona y, por lo tanto, es razonable concluir que los defectos observados en la motilidad podría ser debido a los bloqueos, la acción de los estrógenos. En apoyo de este punto de vista, un informe reciente sugiere que la expresión de aromatasa en espermatozoides humanos es importante para la motilidad del esperma [48]. La comprensión del papel de ER-α y - β en la reabsorción de líquidos y de la motilidad espermática, por lo tanto, es de gran relevancia fisiológica normal de la fertilidad. Se requieren estudios adicionales para evaluar si el observado en la reducción de la motilidad espermática también da lugar a una merma de la fecundidad. Futuros estudios son encaminados a identificar los factores de maduración de los espermatozoides candidatos que están sujetos a la regulación de estrógeno en el capó mono epidídimo.

Conclusión

En conclusión, este estudio, por primera vez, proporciona evidencia de la presencia de receptores de estrógenos en el capó mono epidídimo. Los resultados obtenidos hasta el momento establecer claramente que el capó mono epidídimo es también un objetivo de la acción de los estrógenos y que varios genes informó de que se interviene en la regulación de la absorción de líquidos en los roedores, también están regulados por el estrógeno en el mono del epidídimo. Nos muestran que ICI-epidídimo tratamiento altera la maduración de los espermatozoides y funciones. Este estudio también demuestra las posibles diferencias en la fisiología del epidídimo de los roedores y primates no humanos, y, por consiguiente, subraya la importancia de los informes como éstos, que estudiará la fisiología de los primates no humanos (a diferencia de los roedores), en un intento de comprender Eventos similares en los humanos.

Lista de abreviaturas utilizadas

ER, receptor de estrógeno; ER α, receptor de estrógeno-α, β ER, receptor de estrógeno-β; ERKO α, α-estrógeno Receptor Knockout ratón; ERKO β, β-estrógeno Receptor Knockout ratón; de Na + K + ATPasa de α1, sodio-potasio - Subunidad α1-ATPasa; AQP-1, Aquaporin-1; RTPCR, Reverse-Transcripción de la Cadena de la Polimerasa-Reacción; GAPDH, Glyceraldehyde-3-Fosfato Deshidrogenasa; CASA, Computer-Assisted Semen Análisis

Contribuciones de los autores

SD llevó a cabo la medición de la hormona de la maduración del esperma y ensayos, realizados los análisis estadísticos, y redactó el manuscrito. CCS realizó la RTPCR y análisis de Western blot. RS participado en el diseño del estudio, realizado el análisis inmunohistoquímico y ayudó a redactar el manuscrito. AJR concibe el estudio, participaron en su diseño y coordinación, y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Dr Ramachandra, Ramesh Señor, Señor Krishnamoorthy, Anbalagan doctor, y el doctor Ravi Kumar por su asistencia técnica, y la señora Shailaja y Chitralekha para ayudar en la preparación de este manuscrito. Los autores agradecen al Dr MP Hardy, el Consejo de Población, Nueva York, por su gran interés y asesoramiento en las distintas etapas de este proyecto. La ayuda financiera de DBT (Indo-US-programa "Identificación de los estrógenos-regulado epidídimo factores que intervienen en la maduración del esperma"), la Fundación Mellon, EE.UU. CONRAD, CSIR (Científico Emérito de becas para AJR), CSIR, DST, ICMR Gobierno de la India, es Agradece.