Theoretical Biology & Medical Modelling, 2005; 2: 12-12 (más artículos en esta revista)

Tirosina fosforilación de la miosina de cadena pesada durante la diferenciación del músculo esquelético: un enfoque integrado de la bioinformática

BioMed Central
DF Harney (dharney@rcsi.ie) [1], RK Butler (ryanbutler@rcsi.ie) [1], RJ Edwards (redwards@rcsi.ie) [1]
[1] Departamento de Farmacología Clínica, el Colegio Real de Cirujanos en Irlanda, 123 St Stephens Green, Dublin 2, Irlanda

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Resumen
Antecedentes

Anteriormente se ha demostrado que la insulina mediada por fosforilación de la tirosina miosina de cadena pesada es concomitante con una mayor asociación de C-terminal quinasa SRC durante la diferenciación del músculo esquelético. Hemos tratado de identificar putativo sitio (s) de la fosforilación de este evento.

Resultados

Un enfoque combinado bioinformática motivo de la predicción y la evolución y análisis de estructuras identificadas tyrosines163 y 1856 de la pesada cadena de músculo esquelético como el principal candidato a los sitios de la insulina mediada por fosforilación de tirosina.

Conclusión

Nuestro trabajo es sugestivo que la fosforilación de la tirosina miosina de cadena pesada, ya sea en el músculo esquelético o en las plaquetas, es un hecho significativo que puede iniciar la reorganización citoesqueleto de las células musculares y de las plaquetas. Nuestros estudios proporcionan un buen punto de partida para profundizar el análisis funcional de MHC fósforo eventos de señalización dentro de las células diferentes.

Introducción

Myosins, actina de motor basado en proteínas, se expresan en múltiples isoformas en todas las células eucarióticas. Son oligómeros que consta de uno o dos pesadas cadenas a las que una o más cadenas ligeras no son covalentemente adjunto. Myosins se han clasificado en 18 familias basado en la secuencia de aminoácidos diferencias en el N-terminal de cabeza dominios, que contienen regiones altamente conservadas incluidos-actina y sitios de unión de nucleótidos-[1, 2]. La cola de la miosina es la más variable de dominio y parecen ser los responsables de la función específica miosina desempeña en la célula.

Funcional de las actividades de la mayoría de los myosins como actina-ATPasa dependientes de la actividad o la capacidad para mover los filamentos de actina in vitro se regulan de varias maneras, principalmente por fosforilación de la cadena ligera de reglamentación, Ca 2 + vinculante, o la fosforilación de la pesada cadena [1, 3] Se ha reclamado anteriormente que la miosina de cadena pesada (MHC) sufre fosforilación de tirosina mediada por insulina en el músculo esquelético diferenciación, por lo tanto, la vinculación de la transducción de señales a la gran asamblea ordenó la miosina [4]. La insulina modula una asociación de la miosina con C-terminal quinasa SRC (Csk), una tirosina quinasa molécula de señalización, y estas interacciones son fundamentales en la diferenciación del músculo esquelético. Aunque las reivindicaciones de la fosforilación de la tirosina MHC in vivo siguen siendo algo controvertido, la fosforilación de la tirosina no músculo MHC II bis también ha sido implicado como un evento temprano en la activación plaquetaria humanos [5]. Para resolver esta controversia-y establecer la función, en su caso, la fosforilación de la tirosina MHC es importante identificar los sitios de fosforilación en la que estos acontecimientos pueden ocurrir.

Hemos mapeado potenciales sitios de fosforilación en el músculo esquelético la miosina de cadena pesada utilizando un enfoque integrado de la bioinformática, el apoyo basado en la web con motivo de las predicciones de evolución y datos estructurales. De todos los sitios analizados en el enfoque de la bioinformática, los datos sugieren Y163 y Y1856 como los principales candidatos a la insulina mediada por fosforilación de la tirosina.

Métodos
Fosforilación de la tirosina predicciones

Fosforilación de la tirosina sitio predicciones se hicieron con dos diferentes recursos en línea usando las secuencias se describe a continuación. NetPhos red neuronal produce 2,0 predicciones basadas en la secuencia y la estructura [6]. Scansite predice objetivo motivos para diferentes cinasas utilizando una matriz de selectividad posicional péptido basado en la biblioteca de detección de datos [7, 8] Además, Scansite predicciones se hicieron conocidos por la fosfotirosina reconocimiento motivos para pruebas de los eventos de señalización. Todos Scansite predicciones se hicieron en la 'Baja Stringency' para identificar al mayor número posible de sitios putativo. Estos sitios fueron apoyadas o rechazadas sobre la base de un análisis más detallado, tal como se describe a continuación.

Análisis evolutivo

Secuencias de la proteína para adultos músculo esquelético pesadas cadenas de la miosina (MYHSA) 1 y 2 fueron extraídos de la base de datos SwissProt [9] MYHSA1 [SwissProt: MYH1_HUMAN, P12882]; MYHSA2 [SwissProt ID: MYH2_HUMAN, Q9UKX2] y utilizados como consulta para extraer secuencias de cerca Relacionados con las proteínas homólogas. En primer lugar, BLAST [10] se utilizó para la búsqueda SwissProt-TrEMBL [9] y la conocida, y la novela-Genscan predice EnsEMBL péptidos de cinco bases de datos del genoma (humano, ratón, rata, Fugu, Zebrafish) [11] secuencias redundantes y se eliminaron ALIGN [12, 13] se utilizó para hacer pairwise alineaciones de cada homólogo con MYH1_HUMAN y para calcular el porcentaje de identidad en toda la longitud de la proteína. Vertebrados homólogos con al menos el 60% mundial de identidad fueron procesados mediante un homólogo en la propia herramienta de procesamiento, HAQESAC [14]. Homólogos fueron alineados utilizando CLUSTALW [15] y mal alineados secuencias eliminadas de la base de datos. Un vecino de unirse a los árboles con 1000 repeticiones de arranque fue construido usando CLUSTALW y las secuencias se agruparon en ortólogos subfamilias de las proteínas. El clado correspondiente al músculo esquelético pesadas cadenas de la miosina en Amniota (mamíferos, reptiles y aves), fueron utilizados como secuencias de fosforilación de la tirosina motivo de predicción, tal como se describe más arriba.

Predicción de estructura secundaria

Estructura secundaria se hicieron predicciones para MYH1_HUMAN utilizando el PSIPRED V2.3 sitio web [16]. Debido a la extensión de la proteína, que se presentó en dos trozos superpuestos: los residuos 1-814 y 800 +.

Análisis de la estructura 3D

Estructuras 3D se obtuvieron del Banco de Datos de Proteínas (AP) [17] y con el visto RasMol espectador [18]. Tres estructuras de la miosina de cadena pesada se identificaron: 2MYS, Chicken adultos músculo esquelético la miosina de cadena pesada; 1BR2, molleja de pollo músculo liso miosina de cadena pesada, y 1B7T, Aequipecten irradians (Bahía de ostión) de músculo estriado miosina de cadena pesada. Las secuencias correspondientes SwissProt [Swiss-Prot: 2MYS: MYSS_CHICK, P13538], [suizos-Prot1BR2: MYHB_CHICK, P10587], [suizos-Prot1B7T: MYS_AEQIR, P24733] fueron descargados y alineados con MYH1_HUMAN Humanos y MYH2_HUMAN usando CLUSTALW. Esta alineación se utilizó con el músculo esquelético pesadas cadenas de la miosina (arriba) para asignar putativo de fosforilación tirosina sitios a sus correspondientes residuos en la homóloga estructuras 3D. Visualización con RasMol DSSP disolvente y la accesibilidad de datos [19] se utilizó para inferir si los posibles sitios de fosforilación de la tirosina-fueron expuestos superficie o enterrados.

Resultados

En total, veinte y tres miosina pesada cadena de secuencias se utilizaron para la fosforilación de la tirosina motivo de predicción, que se dividieron en cinco grupos de ortólogos secuencias (Figura 1]. Importante motivos es probable que se conserva durante la evolución por lo que considera únicamente los sitios que se prevé que se fosforilación motivos en todas las secuencias de al menos un grupo de ortólogos. Porque fosforilación sitio predictores tienen una tendencia a la sobre-predecir, que el aumento de rigor aceptando sólo los motivos que NetPhos recibió una puntuación de 0,8 o superior, o se prevé por tanto NetPhos y Scansite, por lo menos en un esqueleto humano adulto miosina de cadena pesada. De este modo se obtuvieron catorce putativo sitios (Tabla 1]. De ellos, seis fueron predichas por ambos métodos, entre ellos dos motivos que se conserva en todas las secuencias (MYH1_HUMAN Y163 y Y1856).

Para ser fosforilados, residuos de tirosina debe ser accesible en la superficie de la proteína. A pesar de que la conformación tridimensional de las moléculas de miosina homóloga no será idéntico, el alto grado de conservación de secuencia entre humanos adultos músculo esquelético pesadas cadenas de la miosina y los tres secuencias presentes en la miosina permitió a la AP inferencia de disolvente accesibilidad. Esto fue confirmado por el buen acuerdo en general, la accesibilidad de medidas de superficie entre ambos modelos, y entre las diferentes cadenas de la miosina 1BR2 (datos no presentados). A partir de estos datos, dos sitios (Y286 y Y435) fueron enterrados mientras que otros dos (Y313 y Y504), bajo la accesibilidad disolvente (Tabla 1]. 3D no se disponía de datos para los cuatro tyrosines en el C-terminal de la proteína.

Si la fosforilación de la tirosina MMHC-II es parte de una cascada de señalización, es probable que algunas otras proteínas se van a encontrar con la fosfotirosina. Se utilizó Scansite a buscar la fosfotirosina interacción motivos y encontró tres SH2 reconocimiento de dominio que coincidan con los motivos expuestos potencialmente sitios de fosforilación. Scansite porque también identifica la interacción de proteínas, que la interrogaron sobre genética [20] Tarjetas de entrada para cada dominio SH2 quinasa y de los patrones de expresión. Sólo cuatro quinasas y dos dominios SH2 había pruebas de UniGene [21] o [22] SAGE de expresión en el músculo esquelético, mientras que sólo una quinasa (INSR) y un dominio SH2 (PIK3R1) había pruebas de ambos (Tabla 2]. Curiosamente, ambas de este último par se prevé que la interacción con el mismo, totalmente conservadas, motivo (MYH1_HUMAN Y163). Además, ambos están implicados en la insulina mediada por las vías (ver Discusión). Dos quinasas expresadas en el músculo esquelético se prevé que interactúan con Y1856. Estos son un SRC quinasa y ABL1, que interactúa con SORBS1 después de la estimulación de insulina [23].

Discusión

Bioinformática por sí solo no puede identificar un motivo funcional, el apoyo a los experimentos será siempre necesaria para pruebas concluyentes. Sin embargo, mientras que en otros sitios no se puede excluir categóricamente, la combinación de los datos presentados aquí Y163 identificar y Y1856 como más probable para los sitios de fosforilación de tirosina eventos en el músculo esquelético. Ambos NetPhos y Scansite predijo estos motivos para todos los mamíferos adultos esquelético miosina pesada cadena de secuencias analizadas, lo que indica fuertes evolutivo de conservación (figura 1]. Una quinasa predijo que será responsable de la fosforilación de cada sitio se expresa en el músculo esquelético, como es un dominio SH2 proteína que se predijo para interactuar con una fosfotirosina en Y163. Análisis de las estructuras secundarias y predijo homóloga 3D estructuras indica que estos sitios se puede acceder a través de la proteína de superficie. La posición de Y163 como parte de una hélice alfa dentro de la cabeza de la miosina de dominio globulares plantea la preocupación de que es potencialmente difícil phosphorylate, a pesar de que es en la superficie del dominio. No obstante, en función de la relación de las conformaciones resuelto pollo in vitro en comparación con las estructuras de la miosina en vivo humanos miosina, Y163 puede que sigan estando disponibles para la fosforilación. Y1856 es en la región de baja predijo estructura secundaria (Tabla 1], indicativo de una región más flexible bucle generalmente asociada a los sitios de fosforilación.

La miosina de cadena pesada (MHC) sufre durante la fosforilación de tirosina mediada por insulina en la diferenciación de los músculos esqueléticos y el grado de fosforilación aumenta en consonancia con la diferenciación [4]. Curiosamente, el más fuerte candidato para la fosforilación tirosina sitio, Y163, tanto la quinasa y la interacción de dominio SH2 predicha por Scansite participan en la insulina mediada por las vías. La quinasa INSR es un receptor transmembrana que se une la insulina [24] mientras que el SH2 dominio PIK3R1 proteína es necesaria para el aumento de insulina estimulada en la captación de glucosa y la síntesis de glucógeno en los tejidos sensibles a la insulina [25]. Por lo tanto, podemos concluir que Y163 sigue siendo un fuerte candidato para el sitio de insulina mediada por la fosforilación de la tirosina miosina de cadena pesada, a pesar de la preocupación por la accesibilidad.

Como fosforilación sitios se encuentran a menudo en las colas de las proteínas, la tyrosines fuera de los principales dominios globulares, es decir, Y1379, Y1492 y Y1856, también son posibles candidatos para la fosforilación. La más fuerte de ellas es Y1856, que es a la vez C-terminal y predijo que se fosforilados por las quinasas SRC y ABL1, que se encuentran en el músculo esquelético (Tabla 2]. Tal vez de mayor interés es ABL1, una proteína que se sabe están asociados con la "Sorbin y dominio SH3 que contiene 1" (SORBS1) durante señalización de la insulina en otras líneas celulares [23]. SORBS1 es altamente expresado en el músculo esquelético (datos no presentados) y está implicado en la formación de las fibras de actina estrés y adherencias focales; su orthologue, PAC, ha sido identificado como un importante adaptador en la señalización de insulina en ratones [26 - 28]. Además, la SORBS1 gen ha sido implicado en la patogénesis de los trastornos humanos con resistencia a la insulina [29].

Csk ha demostrado ser asociados con la hormona de 1, 25 (OH) 2 vitamina D-3 resulta en la estimulación del crecimiento relacionados con la mitogen-activated proteína quinasa (MAPK). La forma de MAPK fosforilada se trasladaron al núcleo donde induce la expresión de c-myc oncogénica asociados a la proliferación del músculo esquelético [30]. Además, Csk también ha sido implicado en la regulación de las integrinas y el control de la célula de la forma y [31] Goel et al. Mostraron que la insulina puede phosphorylate miosina, dando lugar a una asociación con Csk y, en consecuencia, a una disminución de la actividad de c-Src. Esto también se ha demostrado en líneas celulares de fibroblastos después de la estimulación factor de crecimiento tipo insulina I-receptor [32]. Esto demuestra el potencial de diferenciación de músculo esquelético después de la fosforilación de Y163 y / o Y1856 del MHC.

Harney et al. Han demostrado que no musculares la miosina de cadena pesada tipo IIA en las plaquetas se someten a la fosforilación de tirosina y posterior dephosphorylation en una forma dependiente del tiempo [5]. En común con otras células, el citoesqueleto de las plaquetas se compone de filamentos de actina, los microtúbulos y moléculas de miosina. Myosins forma dentro de los anillos de plaquetas que mantener una forma esférica y varias líneas de evidencia sugieren que estos anillos de reorientar siguientes activación plaquetaria para permitir la difusión de [33, 34]. Si bien la función de la miosina, por lo tanto, parece fundamental para la difusión de las plaquetas, los estudios que utilizan inhibidores de citoesqueleto han demostrado que por lo menos los primeros eventos de la activación plaquetaria no dependen de los cambios citoesqueleto [35]. Nuestro trabajo es sugestivo que la fosforilación de la tirosina miosina de cadena pesada, ya sea en el músculo esquelético o en las plaquetas, es un hecho significativo que puede iniciar la reorganización citoesqueleto de las células musculares y de las plaquetas. Nuestros estudios proporcionan un buen punto de partida para profundizar el análisis funcional de MHC fósforo eventos de señalización dentro de las células diferentes.

Información suplementaria

Completo de la predicción de resultados, la secuencia de alineaciones y enlaces a mecanismos de software usado se puede encontrar en: http://www.bioinformatics.rcsi.ie/ ~ redwards / phos /

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a la Dra G. Cagney (GC) y el Dr Patricia Maguire (PBM) para muchos comentarios durante el análisis y la preparación del manuscrito. Además esta obra fue financiada en parte por una beca de Enterprise Ireland (PBM), la Junta de Investigación de la Salud de Irlanda (PBM) y la Autoridad de Educación Superior de Irlanda (GC) y por un premio Science Foundation Ireland (concesión no. 02 / IN.1/B117).