Journal of Translational Medicine, 2005; 3: 13-13 (más artículos en esta revista)

La respuesta inmune antitumoral en HER-2 positivo, los pacientes con cáncer de mama metastásico

BioMed Central
Zorica D Juranic (juranicz@ncrc.ac.yu) [1], Neskovic Zora-Konstantinovic (konsta@eunet.yu) [2], Tatjana P Stanojkovic (tanjast@lycos.com) [1], Zeljko Zizak (zizakz @ Ncrc.ac.yu) [1], Tatjana Srdic (srdict@ncrc.ac.yu) [1], Nevenka Stanojevic-Bakic (nevenkasb@ncrc.ac.yu) [1], Dusanka Milosevic (milosevicd@ncrc.ac . Yu) [1], Danica Jovanovic (jovmar@veranet.yu) [3]
[1] Departamento de Oncología Experimental, el Instituto de Oncología y Radiología de Serbia, Pasterova 14 Belgrado, Serbia y Montenegro
[2] Departamento de Oncología Médica, Instituto de Oncología y Radiología de Serbia, Pasterova 14 Belgrado, Serbia y Montenegro
[3] Departamento de Patología, Instituto de Oncología y Radiología de Serbia, Pasterova 14 Belgrado, Serbia y Montenegro

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Resumen

El objetivo de este estudio fue determinar la base para la lucha contra el tumor de la reactividad inmune observada en los pacientes con factor de crecimiento epidérmico humano receptor-2 (HER-2) (3 +), carcinoma de mama in vitro utilizando un modelo en el que el papel de la HER - 2-anticuerpo monoclonal específico Herceptin también fue investigado. Los pacientes con cáncer de mama metastásico que habían tenido su tumor primario resecado se incluyeron en este estudio. De células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la citotoxicidad dependiente de la presencia o ausencia de Herceptin se evaluó a través de la supervivencia de la meta de adenocarcinoma de mama MDA-MB-361 células como parámetro en una (3 - (4,5-dimetil-2-thiazolyl ) -2,5-Difenil-2H-tetrazolio (MTT) bromuro de prueba. Se observó un aumento significativo en PBMC citotoxicidad dependiente de suero autólogo cuando se introdujo en el ensayo. Además, la adición de Herceptin aumenta significativamente su citotoxicidad. Estos datos sugieren Que contiene suero autólogo constitutivamente los factores que podrían afectar PBMC dependientes de la actividad citotóxica contra HER-2 positivo células cancerosas.

Introducción

Con el fin de mejorar los resultados de vacío estándar actuales enfoques para el tratamiento del cáncer de mama, estrategias terapéuticas adaptadas a los pacientes individuales "fenotipo tumoral basado en una mejor comprensión de la biología del cáncer de mama debe ser considerado. Por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico humano receptor-2 (HER-2/ErbB-2) es de más-expresó en 25-30% de los cánceres de mama y de ovario y se ha utilizado ampliamente como un objetivo para los pasivos immunotherapeutical intervenciones en [1] Particular con la humanizado anti-HER-2 anticuerpo monoclonal trastuzumab (Herceptin) [2]. Los mecanismos de la actividad anti-tumor de Trastuzumab son complejos y aún no se entienden plenamente. Trastuzumab induce la rápida desaparición de HER-2 a partir de la superficie celular, lo que reduce la formación de heterodimer fundamental para la acumulación de ciclina dependiente de la quinasa p27 inhibidor resultando en la detención del ciclo celular [3]. También parece que Trastuzumab suprime la expresión del VEGF, inhibe la angiogénesis mediada heregulin tanto in vitro como in vivo, invierte citoquinas resistencia, y restaura E-cadherina expresión [4]. Trastuzumab también inhibe constitutiva división HER-2 / derramamiento de metalloproteases y, en consecuencia, la generación de fosforilados p95 [3, 5, 6]. Desde Trastuzumab contiene una inmunoglobulina G1 humana (IgG1) Fc región, es posible que el anticuerpo puede participar en la citotoxicidad mediada por complemento (CMC) y / o de anticuerpos dependientes de la citotoxicidad mediada por células (ADCC). Sin embargo, Trastuzumab citotoxicidad por CMC no puede ser documentado experimentalmente [7], posiblemente debido a la presencia de membrana complemento de las proteínas reguladoras (mCRP) como factor de aceleración de la decadencia (DAF, CD55), cofactor de proteínas de membrana (MCP, CD46), O protectin (CD59) en la superficie de células de carcinoma de mama. Sin embargo, a través de su citotoxicidad ADCC se ha confirmado [5, 6, 8]. Herceptin dependientes de la citotoxicidad mediada por células de acción podría estar sujeta a la activación de Fc γ RI (CD64) en células dendríticas y monocitos y / o activación del Fc γ RIII, (CD16) en monocitos / macrofages y de las células asesinas naturales, que pueden liberación gránulos citotóxicos como perforin y Granzymes objetivo de destruir las células tumorales.

Represión de Herceptin podría ser la citotoxicidad mediada por Fc γ RII (CD32), constitutivamente expresado en monocitos, células B, las plaquetas, las células dendríticas, eosinofils, basophiles y neutrófilos. Se observa que Trastuzumab es particularmente eficaz en pacientes con fuerte (inmunohistoquímica Resultado, IHC Resultado = +3) sobreexpresión del HER-2 receptor, o medio de expresión (IHC Resultado +2) [9]. Sin embargo, la inmunoterapia pasiva del cáncer de mama con Herceptin parece prometedor; no queda claro por qué algunos pacientes con HER-2 positivo tumores no responder adecuadamente a la terapia. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue identificar in vitro, inmune, en los pacientes con carcinoma de mama que pueden ser pertinentes a la lucha contra el tumor de la modulación inmune, y para estimar la capacidad in vitro de Herceptin para aumentar la actividad anti-tumor en los pacientes Con cáncer de mama y controles normales.

Pacientes, material y métodos

Catorce HER-2 positivo pacientes con cáncer de mama avanzado se incluyeron en el estudio. Todos los pacientes habían demostrado histológicamente cáncer de mama invasivo, diagnosticado en la fase metastásica de la enfermedad inmediatamente antes de la inclusión (1 paciente), o antes en el funcionamiento clínico (13 pacientes). Como consecuencia de la anterior citotóxicos y / o endocrino tratamiento, la mayoría de los pacientes eran posmenopáusicas al entrar al estudio. Sin embargo, los pacientes han sido sin ningún tipo de sistema endocrino o terapia citotóxica por lo menos un mes antes de la toma de muestras de suero. Todos los pacientes tenían afectación visceral, en su mayoría incluidas las metástasis hepáticas. Todos los pacientes HER-2 (3 +) positivo primaria de los tumores de acuerdo con el examen de inmunohistoquímica utilizando DAKO HercepTest embebidos en parafina especímenes de tumor de mama. En el momento de la inclusión, que fueron seleccionados para la aleatorización en el estudio clínico de la quimioterapia con o sin trastuzumab. Sus características se presentan en la Tabla 1.

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado por escrito.

Veinte donantes sanos, rango de edad: 20-55 años, sirvieron como controles. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y la citotoxicidad PBMC y citotoxicidad dependiente de Herceptin se evaluó indirectamente, a través de la determinación de la meta, HER-2 positivo (3 +), adenocarcinoma de mama MDA-MB-361 la supervivencia celular, por 3 - (4,5 - Dimetil-2-thiazolyl) -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro) MTT prueba [10]. Veinte mil objetivo MDA-MB-361 células (T) se mezclaban con efectores PBMC (E), en efectores a la meta (E: T) ratios de 0:1 y 5:1 durante 48 h, en medio RPMI 1640 con 10% Control de suero (pool de sueros de individuos sanos), o de estas células objetivo fueron incubadas en medio RPMI 1640 con 10% de suero autólogo y en PBMC E: T ratio: 0:1, 1.25:1, 2.5:1 y 5:1, con o Sin 21 μ g / ml de Herceptin. Después de 48 h 20 μ l de solución MTT (5 mg / ml de buffer fosfato salino) y se agregaron 4 h más tarde de 100 μ l 10% de dodecil sulfato de sodio se añadieron. La absorbancia a 570nm de MTT manchadas pozos se lee en 570 nm con 24 horas de este último.

Para obtener la supervivencia celular, la absorbancia a 570 nm de MTT manchadas células objetivo (A) incubados:

• nutrientes en el medio con suero autologuous (Na),

• o en el medio con nutrientes autologuous suero efector más células (Na + E),

• nutrientes en el medio o con el control de suero (Nc),

• nutrientes en el medio o con el suero de control de las células más efector (Nc + E),

Siempre se divide con la absorbancia de control de las células (Ac), es decir, apuntar las células incubadas en medio nutriente con suero control (Nc)

S (%) = A / Ac

Se suponía que la absorbancia de blanco correspondiente AB fue siempre restará de una de las muestras, o de A, de los controles. Por lo tanto, la ecuación final es:

S (%) = (A (T + Na + E)-A (Na + E)) / (A (T + Nc)-A Nc)

Porcentaje de células CD16 + se determinó por inmunofluorescencia directa de ensayo utilizando el anti-CD16 FITC anticuerpos monoclonales según las instrucciones del fabricante (Becton Dickinson, San José, Ca, EE.UU.). Recopilación y análisis de datos se realizó sobre FacsCalibur ™ flujo cytometer (BDIS), utilizando el software CellQuest (BDIS).

El análisis estadístico se realizó mediante dos colas Prueba t de Student, con un mínimo umbral de significación de P <0,05).

Resultados

Suero aislado de controles sanos no alteró MDA-MB-361 en comparación con el crecimiento de las células agrupados suero. Sueros de los pacientes no significativamente el crecimiento del tumor de las células objetivo (P = 0,05006) en relación a su crecimiento en mezcla suero La supervivencia de las células diana crecido en medio de nutrientes con el suero de control de personas sanas o con suero de los pacientes en el Presencia de 21 μ g / ml de Herceptin tampoco fue afectado significativamente (Figura 1].

PBMC de donantes sanos manifiesta una tendencia no significativa hacia la más alta en comparación con la citotoxicidad PBMC de los pacientes de cáncer cuando el control mancomunados suero se utilizó (como se ve en la Figura 2]. Tras la sustitución del control de suero con suero autólogo, la actividad citotóxica de los pacientes PBMC fue mayor, pero no de forma significativa (P = 0,09) que la que PBMC de los controles (Figura 2]. Del mismo modo, los pacientes PBMC actividad fue estadísticamente mayor (P <0,003) por la presencia de suero autólogo en comparación con su actuación en mezcla suero control (Figura 3]. Estos datos sugieren que el suero autólogo de pacientes con cáncer de mama puede contener una soluble facilitador de PBMC citotoxicidad mediada, que es específica para cada paciente.

Este anti-tumor inmunidad humoral presente en el suero autólogo, que contribuyen a la mejora (≥ 30%), de la citotoxicidad PBMC, se observó en 5 / 14 HER-2 positivo pacientes con carcinoma de mama, y en 4 / 13 de control sanos Por tanto, parece Que no se trata de un paciente de cáncer de mama fenómeno específico.

La adición de Herceptin a PBMC de los controles y de pacientes con cáncer de mama, mejora de forma significativa la supresión de la meta en la supervivencia celular E: T ratio 5:1 (P <0,02 y P <0,004, respectivamente) (Figura 4]. Esto significa que los pacientes PBMC de los pacientes con cáncer de mama no han soltado su capacidad para matar las células malignas a través de Herceptin.

No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el porcentaje de células CD16 + en pacientes y controles.

La importancia clínica del nivel de citotoxicidad dependiente de Herceptin en algunos pacientes tratados con Herceptin no está disponible en este momento.

Discusión

Además de los dirigidos HER-2-pasivo inmune específica para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama pueden servir de complemento a la terapia convencional [11]. Sin embargo, algunos pacientes no responden satisfactoriamente a ese tratamiento. Como Herceptin es en primer lugar un agente inmunológico el potencial de Herceptin para mejorar la lucha contra el cáncer de la respuesta inmune in vitro podría guiar la selección de los pacientes para la terapia con Herceptin. Nuestros datos sugieren que MDA-MB-361 células, sobre-expresión de HER-2 no son muy susceptibles a la directa Herceptin acción anti-proliferativa. Esto puede ser debido a la pérdida del gen supresor tumoral PTEN por MDA-MB-361 células que desempeña un papel central en la transmisión de señales inhibidoras de crecimiento inducido por Herceptin [12].

Además, parece ser de acuerdo a nuestras observaciones que PBMC de los pacientes con cáncer de mama no tienen significativamente menor potencial citotóxico contra MDA-MB-361 en comparación con las células aisladas de PBMC donantes sanos. Sin embargo, los pacientes PBMC en presencia de suero autólogo significativamente (P <0,003) mejoraron su reacción inmunitaria posiblemente debido a la espontánea humoral HER-2 inmunidad anti-tumor. Estos resultados están de acuerdo con Disis et al. [13] se informa de la existencia de la inmunidad humoral en algunos pacientes con cáncer de mama. Inesperadamente, la lucha contra el tumor de la inmunidad humoral, lo que conduce a una disminución de la supervivencia de células malignas se encuentran también en una minoría de las personas sanas.

La importancia de la existencia de una efectiva inmunidad antitumoral in vitro en algunos pacientes con carcinoma de mama, que no es eficaz en la destrucción de tumores in vivo sigue siendo poco clara. Posiblemente, algunas proteínas pueden inhibir la acción de perforin líticas y granzymes. Una de esas proteínas se podrían calreticulin inhibitorio que ejerce varias acciones, como por ejemplo la inhibición de complemento C1q dependientes de la activación [14]. Esta proteína, junto con perforin, está presente en el gránulo de citolítica NK y células T citotóxicas protegerlas de la destrucción de la libre perforin [15]. Se ha sugerido que calreticulin estabiliza las membranas e indirectamente polyperforin evita la formación de poros, por lo tanto, la inhibición de susceptibilidad a la meta de células efectoras de células matanza [16, 17]. La sobre-expresión de serpinas por algunas células tumorales también puede inhibir o granzim A granzyme B líticas actividad demasiado [18, 19]. Los resultados obtenidos en este trabajo apuntan a los nuevos experimentos con el objetivo de determinar la utilidad de las pruebas inmunológicas in vitro para la predicción de la respuesta de los pacientes a la inmunoterapia, es decir, la pertinencia de los diferentes niveles de calreticulin y / o serpinas en las células diana utilizado in vitro y en células De los tumores malignos en los especímenes inmunológicos tumor escapar necesidades que se determinen.

La ausencia de diferencias estadísticamente significativas entre el porcentaje de células CD16 + en los pacientes y en los controles sugieren que la ADCC mediada por células NK puede preservarse en pacientes con carcinoma de mama.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Ciencia y Protección del Medio Ambiente de Serbia, (número de concesión 1614). Los autores gracias Sra Tatjana Petrovic y del Sr Filip Stojanovic por su excelente asistencia técnica.