Virology Journal, 2005; 2: 21-21 (más artículos en esta revista)

Molecular de la diversidad biológica de la yuca begomoviruses en Tanzania: geminiviruses evolución de la yuca en África y el África oriental pruebas para ser un centro de diversidad de la yuca geminiviruses

BioMed Central
J Ndunguru (jndunguru2003@yahoo.co.uk) [1], JP Legg (jlegg@iitaesarc.co.ug) [3], TAS Aveling (terry.aveling @ fabi.up.ac.za) [4], G Thompson (gthompson@arc.agric.za) [5], CM Fauquet (iltab@danforthcenter.org) [2]
[1] Plant Protection Division, P.O. Box 1484, Mwanza, Tanzania
[2] Laboratorio Internacional para la Biotecnología Agrícola Tropical, Donald Danforth Plant Science Center, 975 N. Warson Rd., St Louis, MO 63132 EE.UU.
[3-7878, Kampala, Uganda
[4] Department of Microbiology and Plant Pathology, University of Pretoria, Pretoria 0002, South Africa
[5] ARC-Instituto de cultivos industriales, Private Bag X82075, 0300 Rustenburg, Sudáfrica

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Resumen

La yuca está infectado por numerosas geminiviruses en África y la India, que causa pérdidas devastadoras para los agricultores pobres. Estamos aquí describir la diversidad molecular de siete geminiviruses representante del mosaico de la yuca (CMGs) infectando la yuca desde varias ubicaciones en Tanzania. Se presenta por primera vez la presencia de dos cepas aisladas en el este de África: (EACMCV-[TZ1] y EACMCV-[TZ7]) de las especies de África oriental Camerún virus del mosaico de la yuca, descrito originalmente en el África occidental. La secuencia completa de nucleótidos de EACMCV-[TZ1] ADN y ADN-A-B componentes compartían un alto general de la secuencia de identidad a EACMCV-[CM] componentes (92% y 84%). El EACMCV-y [TZ1] - [TZ7] genómica han recombinaciones componentes de la misma en las regiones del genoma EACMCV-[CM], pero también tiene más recombinaciones en ambos componentes. Prueba de secuencia de análisis sugiere que las dos cepas tienen el mismo origen y la antigüedad no son recientes presentaciones. EACMCV-[TZ1] ampliamente producido en la parte meridional del país. Otros cuatro CMG aislamientos fueron identificados: dos fueron cerca de la cepa EACMV-Kenia (nombre EACMV-[KE / TZT] y EACMV-[KE / TZM] con 96% de identidad de secuencia), un aislamiento, TZ10, había un 98% de homología a EACMV-UG2Svr y fue nombrado EACMV-UG2 [TZ10], y por último una cepa fue del 95% idénticos a EACMV-[TZ] y el nombre EACMV-[TZ / YV]. Una cepa de virus africano del mosaico de la yuca con un 97% de identidad de secuencia con otros aislamientos de ACMV fue nombrado ACMV-[TZ]. Representa el primer ACMV aislar de Tanzania para ser secuenciados. La variabilidad molecular de CMGs También se evaluó usando parcial componente B, de 13 de las secuencias de nucleótidos EACMV aisladas de Tanzania. Uso de las secuencias de todos los CMGs disponibles en la actualidad, hemos demostrado la presencia de una serie de fragmentos putativo de recombinación que son más prominentes en todos los componentes de EACMV que en ACMV. Este nuevo conocimiento sobre la diversidad molecular CMG en el este de África, en Tanzania y en particular, nos ha llevado a la hipótesis acerca de la probable importancia de esta parte de África como fuente de la diversidad y el cambio evolutivo, tanto durante las primeras etapas de la relación entre CMGs Y la yuca y, en tiempos más recientes. La existencia de múltiples CMG aislamientos con alta diversidad de ADN del genoma en Tanzania y moleculares de las fuerzas detrás de esta diversidad constituyen una amenaza para la producción de yuca en todo el continente africano.

Antecedentes

Geminiviruses son una gran familia de plantas con los virus circular, de un solo varados DNA (ssDNA) envasados dentro de los genomas geminate partículas. La familia Geminiviridae se divide en cuatro géneros (Mastrevirus, Curtovirus, Topocuvirus, y Begomovirus) de acuerdo a su genoma organizaciones y propiedades biológicas [1, 2]. Los miembros del género Begomovirus han causado significativas pérdidas de rendimiento en muchos cultivos en todo el mundo [3], y son transmitidos por moscas blancas (Bemisia tabaci) a plantas dicotiledóneas. El genoma de la yuca mosaico geminiviruses (CMGs) en el género Begomovirus consta de dos moléculas de ADN, el ADN y ADN-A-B, cada una de unos 2,8 kbp [1], que son responsables de las diferentes funciones en el proceso de infección. ADN-A codifica los genes responsables de la replicación viral [AC1 (Rep), y AC3 (Ren)], la regulación de la expresión génica [AC2 (Trap)] y de partículas encapsidation [AV1 (CP)]. ADN-B codifica para dos proteínas, BC1 (MP) y BV1 (NSP) que estén implicados en la célula a célula de circulación dentro de la planta, la gama de los huéspedes y la modulación de síntomas [1]. CMGs se han registrado en muchos países productores de yuca de África y de la enfermedad del mosaico de la yuca (CMD) inducida por ellos constituye una amenaza formidable para la producción de yuca [4].

Representantes de seis especies distintas CMG se han encontrado para infectar la yuca en África: África del virus del mosaico de la yuca (ACMV), África Oriental virus del mosaico de la yuca (EACMV), África Oriental Camerún virus del mosaico de la yuca (EACMCV), África Oriental Malawi virus del mosaico de la yuca (EACMMV ), África Oriental Zanzíbar virus del mosaico de la yuca (EACMZV) y Sudáfrica virus del mosaico de la yuca (SACMV) [5]. Estudios recientes han descubierto mucha variación en CMGs incluidas pruebas de que algunos CMGs, cuando se presenta en las mezclas, el empleo pseudo-recombinación o redistribución estrategias y recombinación en ciertos puntos calientes tales como el origen de replicación [6 - 10] desemboque en la creación de "nuevos 'Virus alterado con virulencia. Por ejemplo, una ACMV-EACMV recombinante componente A, designado EACMV-UG2, y un pseudo-componente B recombinante, designado EACMV-UG3 [10], han estado implicados en la pandemia de graves CMD devastadores mandioca en la actualidad gran parte de este y central África [4]. En 1997, sólo ACMV y EACMV se sabe que ocurren en la ex Tanzania con que ocurren sólo en la parte occidental del país [11]. El descubrimiento de EACMZV en la isla de Zanzíbar [12], junto con la reciente propagación en Tanzania de la EACMV-UG2 asociados pandemia de graves CMD [4, 13], ha agravado la situación CMD. En consecuencia, hay mucho que aprender acerca de la identidad, distribución, la variabilidad molecular, y la amenaza que plantean estos nuevos geminiviruses de la producción de yuca en Tanzania, y en general en África.

En 1997, la primera de recombinación entre dos especies de geminiviruses se registró [7, 8]. Este mecanismo se conoce ahora a ser ampliamente utilizados por todos los geminiviruses y es probablemente el más importante mecanismo molecular para la generación de cambios genéticos que permiten la novela geminiviruses para explotar nuevos nichos ecológicos [2, 14].

En este artículo se describen los resultados de un estudio molecular de las secuencias de CMGs recogidos de las principales zonas de cultivo de la yuca de Tanzania, en un esfuerzo hacia la determinación, la determinación de la variabilidad molecular y cartografía de la distribución de CMGs. Además, dado que el África oriental parece ser excepcionalmente rica en diversidad biológica y virus debido a que la más reciente pandemia de la yuca se registró por primera vez en el este de África, se determinó la medida de inter-CMG recombinaciones y examinado su papel en la evolución de CMGs en África.

Resultados
Evaluación de los síntomas CMD

Más del 80% de la yuca en los campos mostraron síntomas graves CMD con yuca en la cuenca del Lago Victoria expresar la más grave de los síntomas, seguidos de los de las regiones meridionales. Los síntomas de la infección yuca muestras recolectadas en el campo fueron reproducidas en condiciones controladas para examinar la variabilidad de los síntomas. De un total de 35 seleccionados esquejes plantados, 25 (71%) se estableció con éxito en la cámara de crecimiento. En todos los casos, independientemente de los cultivares, los síntomas expresados en el campo, ya sea moderada o grave, fueron reproducidas en la cámara de crecimiento y las plantas no recuperarse de la enfermedad, incluso 12 meses después de la plantación (Fig. 2]. Del mismo modo, las plantas que muestran síntomas moderados en el terreno mostró un síntoma similar en la cámara de crecimiento como en el caso de las plantas infectadas por separado con ACMV-[TZ] (Fig. 2].

La detección de los genomas virales componentes

Productos de amplificación de PCR (2.7-2.8 kbp) se observaron para todos los aislamientos probados utilizando CMG primer UNIF / UNIR (Tabla 1] diseñado para amplificar una situación próxima al pleno de la longitud del ADN-A, de CMGs. Bandas no se observaron con el control negativo (ácido nucleico preparación saludable de las plantas de yuca). Del mismo modo, una determinada (2,7 kbp) producto se observó al utilizar terrenos colindantes primers TZ1B-F / R diseñado desde un 560 pb B fragmento de ADN inicialmente usando PCR-amplificación de los primers universales EAB555 / F EAB555R y general para la detección de ADN-B CMGs. ADN-B parcial de los fragmentos (544-560 kbp) fueron siempre amplificado por PCR usando primers EAB555 y EAB555-F-R (Tabla 1] para todos los enfermos CMD-muestras previamente para contener EACMV aislamientos recogidos de las principales zonas de cultivo de la yuca en Tanzania [13].

Secuencia completa de nucleótidos de CMGs características de Tanzania

La completa secuencias de ADN Un representante CMGs de siete de las principales zonas de cultivo de la yuca se determinará a partir de la representante aislamientos seleccionados y cultivados en las cámaras de crecimiento. Un ACMV aislar de Tanzania (ACMV-[TZ]) se ha demostrado que son más relacionados con los ACMV-UGMld de Uganda identidad con una secuencia de 97%. Su ADN-A de nucleótidos (nt) secuencia se creó para ser destinatario de 2779 de longitud. Tiene un alto general de la identidad de secuencia (> 90%) con todos los demás ACMV publicado secuencias de los aislamientos (Cuadro 2] con la que los grupos en el árbol filogenético presentado en la Figura 3. La secuencia de ADN-Una organización típica de un begomovirus, con dos marcos de lectura abierta (ORFs) (AV2 y AV1) en el sentido de ADN-virus, y cuatro ORFs (AC1 a AC4) en el sentido complementario, separados por una región intergénicas (IR). Complete nt secuencias de los genomas de ADN-A de los diferentes EACMV Tanzanía y ACMV aislamientos se compararon con las secuencias publicadas (Tabla 2].

Dos aislamientos, TZ1 y TZ7, con el destinatario de 2798 y 2799, respectivamente, recogidos de Mbinga distrito en el suroeste de Tanzania, fueron los más estrechamente relacionados con los aislados de las especies de África oriental Camerún virus del mosaico de la yuca de Camerún y de Costa de Marfil, África occidental, (EACMCV-[ CM], - [IC]), con 89-90% de identidad de secuencia nt. Son claramente aislados de EACMCV y les hemos llamado EACMCV-[TZ1] y EACMCV-[TZ7] para indicar que eran de Tanzania, a fin de distinguirlos de los originales EACMCV-[CM] aislar de Camerún. Las dos cepas fueron también prácticamente idénticos el uno al otro de haber elevado la conservación general de la secuencia del ADN (93% de identidad de secuencia nt). El análisis filogenético de la ADN-A nt secuencias agrupadas EACMCV-[TZ1] y EACMCV-[TZ7] en el mismo grupo con EACMCV-[CM] y EACMCV-[IC] (Fig. 3]. La secuencia completa de la nt EACMCV-[TZ1] ADN-B componente está decidido a ser destinatario de 2726 de largo y tiene la mayor secuencia de identidad (85%) con EACMCV-[CM] ADN-B con el que se agrupa en el árbol filogenético (Fig. 4]. Tuvo menos de 72% de homología con el ADN de otros Bs EACMV aisladas de África oriental.

La completa del ADN del genoma-A de CMG aisladas de Yombo Vituka (YV) y Tanga (TZT) en la zona costera de Tanzania están decididos a ser destinatario de 2800 y 2801 de largo, respectivamente. Aislar YV mostró alta (95%) general nt secuencia de identidad a la que se caracteriza EACMV-[TZ] y es, por tanto, el nombre EACMV-[TZ / YV] en el Dar-es-Salaam región. También ha elevado la identidad global de la secuencia (87-96%) con otros aislamientos de Tanzania EACMV caracterizado en este estudio (Tabla 2]. El análisis filogenético de la secuencia completa de EACMV nt-[TZ / YV] agrupados con su pariente más cercano, EACMV-TZ (Fig. 3]. CMG aislar TZT habían alta identidad de secuencia (96,5%) con EACMV-[KE/K2B] de Kenia y es nombrado EACMV-[KE / TZT]. Asimismo, otro aislar CMG (TZM) de la región de Mara en la zona del Lago Victoria se observa un alto general de la secuencia de identidad (96%) con EACMV-[KE/K2B], y que hemos denominado-que EACMV [KE / TZM]. Este aislar, en 2805 destinatario de longitud, junto con EACMV-[KE / TZT], agrupadas con EACMV-[KE/K2B] en el árbol filogenético (Fig. 3]. Otra cepa de la región de Kagera, en el noroeste de Tanzania (TZ10) mostraron en general muy alto de ADN-A nt secuencia de identidad (98,8%) con la secuencia publicada del EACMV-UG2Svr. Su completa de ADN-A nt secuencia 2804 fue destinatario de largo y es nombrado EACMV-UG2 [TZ10].

Determinación de la diversidad genética de ADN-B EACMV utilizando secuencias parciales

La diversidad de los diferentes aislamientos CMG se analizó utilizando un parcial de ADN genómico B, que abarca la región N-terminal de la región BC1 a la región intergénicas (IR). Las identidades de estas secuencias con las de los correspondientes análisis de ADN genómico B de otras regiones CMGs se determinaron en GenBank. Generalmente, el EACMV aislados mostró poca divergencia genética entre los aislados entre sí y recogida en la misma zona alta está representada nt secuencia de identidad. TZB7 aislamientos TZB1 y de la parte meridional de Tanzania comparte la más alta (98%) nt secuencia seguida de identidad TZB3 y TZB8 (94%), así como TZB y TZB10, todos de la costa este ámbito. TZB2 fue más relacionadas con el 91% y comparte con TZB4 secuencia de identidad, ambos recogidos de la zona costera. Ninguno de los aislados del sur o las zonas costeras compartidas> nt 85% de identidad de secuencia con los de la cuenca del Lago Victoria (TZB9 y TZB12).

El árbol filogenético generados a partir de un múltiplo de 13 EACMV alineación con aislamientos seleccionados begomovirus bipartita y secuencias EACMCV-[TZ1] componente B se muestra en la Figura 4. Los 13 aislamientos de Tanzania estudiado agrupado con la referencia EACMVs, con TZB6 están más relacionados con los aislamientos de Uganda (EACMV-UG3Svr, EACMV-UG3Mld y EACMV-UG1) (Fig. 4] nt compartir el 97% de identidad de secuencia. Cuatro aislamientos (TZB3, TZB5, TZB8 y TZB9) formado un grupo estrechamente relacionados, con TZB8 y TZB9 siendo los más estrechamente relacionados. Los aislados TZMB, TZB5 y TZB11 cada agrupan por separado. Ninguno de los aislamientos agrupados EACMV con ICMV y SLCMV del subcontinente indio (Fig. 4].

Cápside de proteínas (CP) el análisis de secuencias de genes y la comparación con los virus seleccionados

El CP secuencias genéticas de los siete CMGs identificados en nuestro estudio fueron publicados en comparación con secuencias (Tabla 3]. ACMV-[TZ] comparte la secuencia más alto nt identidad (97,4%) con ACMV-UGMld de Uganda seguido de ACMV-[CM], un aislado del Camerún. La identidad de secuencia más bajo (63,2%) se registró con TGMV-YV (Cuadro 3], un americano begomovirus. Ambos EACMCV-[TZ1] y EACMCV-[TZ7] eran más del 92% idénticos a EACMCV-[CM], pero también tienen muy alta nt secuencia de identidad (95%) con EACMZV de Zanzíbar y EACMV-[KE/K2B] (Tabla 3] y el 96% entre unos y otros. Curiosamente, EACMV-[KE / TZT] y EACMV-[KE / TZM] colectivamente compartida alta (97%) con identidad EACMZV seguido por EACMV-[KE/K2B] (96-97%) y hasta 96% entre unos y otros . Además, la EACMV-[TZ / YV] CP secuencia genética mostraron muy alta identidad con EACMV-[TZ] (96%) y EACMZV (96%), seguido de EACMV-[KE/K2B] (95%) (Tabla 3]. El EACMV-UG2 [TZ10] secuencia compartido una muy alta nt secuencia de identidad (99%) con EACMV-UG2Svr de Uganda y de identidad de alta (98-99%) con otros aislamientos de Uganda EACMV. Como era de esperar, EACMV-UG2 [TZ10] comparte 90% de homología de secuencia con ACMV (Cuadro 3], lo que sugiere que contiene la recombinación de genes en el PP a nivel de informes anteriores [7, 8] para EACMV-UG2.

El análisis filogenético de la CP de Tanzanía CMGs dado un árbol (Fig. 5] que está de acuerdo con la relación predicha por pairwise secuencia de la comparación (Cuadro 4]. ACMV-[TZ] agruparse con otros ACMV aislados mientras EACMV-UG2 [TZ10] agrupados con Uganda aislados de EACMV. EACMCV-[TZ1], EACMCV-[TZ7], EACMV-[TZ / YV], y los dos virus, EACMV-[KE / TZT] y EACMV-[KE / TZM] agrupado con otros, ya sea EACMV aisladas de Kenya o Camerún . No CMG aislar identificados en este estudio agrupadas con EACMMV de Malawi, SACMV de Sudáfrica, ICMV, o SLCMV desde el subcontinente indio cuando su CP gen se compararon las secuencias de nucleótidos (Fig. 5].

El común de las regiones (CRs), de la República Unida de Tanzanía CMGs

El nonanucleotide conservadas en la horquilla de ciclo, TAATATTAC, que es característico de los miembros de la familia Geminiviridae y la caja TATA AC1, fueron identificados en la CR de todas las secuencias de Tanzania CMGs (Fig. 6a, 6b]. La CR de ACMV-[TZ] 170 fue destinatario de largo mientras que los de EACMV fueron entre 152 y 157 destinatario de longitud. Cuando la secuencia de CR-ACMV [TZ] se comparó y se suman a la publicación de secuencias CR-infectar otros yuca ACMV aisladas de África (Fig. 6a], que es evidente que ACMV-[TZ] era prácticamente idéntico a todos los aislamientos ACMV . Las reiteradas motivo aguas arriba de la caja TATA para todos los publicados ACMV aislados se AATTGGAGA AATTGGAGA (Fig. 6a]. El motivo para ACMV-[TZ], AATTGGAGA AATTGGAGA, era idéntico. Figura 6b se presenta la alineación de los CRs de la República Unida de Tanzanía EACMVs con secuencias de todos los publicados EACMVs. Se encontró que todos los aislamientos que figuran las distintas características de begomoviruses. El putativo Rep vinculante secuencias (iterons) fueron GGTGGAATGGGGG GGTGGAATGGGGG GGTGGAATGGGGG para todos los aislamientos de Tanzania, salvo EACMV-[TZ / YV] que había diferentes iterons (GGGGGAACGGGGG GGGGGAACGGGGG GGGGGAACGGGGG) y un total de 23 desajustes en todo el CR. Cabe señalar que a pesar de los genomas de los dos aislamientos de EACMZV son EACMV base, sus CRs son más similares a ACMV que a EACMV y la iteron es AATTGGAGA.

Las comparaciones de las secuencias de la nt CRs de Tanzanía CMGs con otros CMGs reveló una alta identidad de secuencia (> 90%) de la ACMV-[TZ] a publicado secuencias de aislamientos y otros ACMV identidad bajo (61-62%) a las especies EACMV . Del mismo modo, todos los tanzanos EACMV aislados fueron relacionados con la identidad de secuencia entre 83-97% CRs de la ADN-Ay ADN-B. La CR de EACMV-[TZ / YV] mostraron una secuencia relativamente bajo otra identidad a los aislados. EACMCV-[TZ1] (ADN-Ay-B) y la EACMCV-[TZ7] mostró alta nt secuencia de identidad a EACMCV (Cuadro 4].

Distribución geográfica de la CMGs en Tanzania

El representante aislados secuenciados aquí han sido elegidos porque representan una variedad de diferentes patrones de RFLP encontrado durante un gran conjunto de 485 muestras recogidas en toda Tanzania [13]. Sin embargo, la selección de cepas de la secuencia se basa en las diferencias en los patrones de RFLP y no en su frecuencia de aparición en el país. Figura 7 muestra los distintos lugares de estas muestras representadas por los aislados secuenciados aquí. El EACMCV-[TZ1] es el medio más extendido, que se encuentra en 50 muestras ubicadas principalmente en la parte sur de Tanzania en el Distrito Mbinga de Ruvuma Región. EACMCV-[TZ7], el pariente cercano de EACMCV-[TZ1], se encuentra sólo en una muestra en el mismo distrito de Mbinga. EACMV-[KE / TZT] se encuentra sólo en las zonas costeras, en diez muestras, principalmente en las regiones de Tanga y Pwani. EACMV-[KE / TZM] se encontró en diez muestras, sólo en la Región de Mara de la Cuenca del Lago Victoria y en un grado muy limitado en la isla de Ukerewe, en el Lago Victoria. El resto de los CMGs, EACMV-UG2 [TZ10], ACMV-[TZ], así como EACMV-[TZ / YV], tenía una distribución geográfica limitada (Fig. 7].

Las comparaciones de los de África oriental y África occidental aislados de EACMCV
Recombinación análisis mosaico de la yuca geminiviruses

Pairwise El análisis realizado sobre todos los virus de la yuca de África secuenciado hasta la fecha, con dos indios como los virus de la yuca-grupos, y entre ellos el virus aislado en Tanzania (aquí descritos), mostró una serie de fragmentos putativo recombinante para ambos componentes. Figura 9 muestra un mapa genómico de cada componente y se resumen los resultados obtenidos para los componentes A y B.

La cuantificación del porcentaje de EACMV de tipo y de tipo SACMV secuencias en cada virus

A partir de la recombinación y análisis filogenético de resultados, está claro que-al igual que todos los virus EACMV compartir una porción de la columna vertebral EACMV secuencia. La recombinación de ruta fue utilizada para calcular estos porcentajes, se indica en la figura 9 para cada uno de los componentes. Este porcentaje varía de 38 a 100% dependiendo de cada virus de la A componentes y del 22 al 100% para la B componentes. Un cálculo similar se puede hacer para que las secuencias son SACMV de tipo y los resultados varían entre el 0 y el 60% para los componentes A, y de 0 a 16% para los componentes de la B (Fig. 9]. La figura 11 muestra un reparto de estos porcentajes de acuerdo a los diferentes virus clonados y de acuerdo a un transecto entre Uganda y Sudáfrica, lo que indica que la columna vertebral EACMV secuencia disminuye hacia Sudáfrica, en tanto que la de tipo SACMV secuencia aumenta.

Discusión

En el presente estudio se confirmó la presencia de los representantes de 3 especies de CMGs en Tanzania: una cepa de la ACMV, cuatro aislamientos de EACMV, y otros dos aislamientos de EACMCV. El ADN-A completar las secuencias de nucleótidos de estas cepas fueron determinados.

ACMV

Se desprende de los resultados de este estudio que existen en varios CMGs Tanzania mostrando una alta diversidad genética. El ACMV caracterizado desde Tanzania se observa un muy alto general del ADN-A nt secuencia de identidad a todos los demás aislamientos de ACMV secuenciado hasta el momento. Como no existe una relación entre el origen de ACMV aislamientos y su secuencia de la relación con otros aislados, es imposible saber si la que se encontró en Tanzania es más relativos a una ACMV aislar que otro. Como se trata de la primera aislar a ser secuenciado de Tanzania, la llamó ACMV-[TZ]. Este virus, como todos los demás ACMVs, mostradas no detectables de recombinación de ADN en su genoma.

EACMCV

EACMCV-[TZ1] y EACMCV-[TZ7] ha elevado global ADN-A nt secuencia de las identidades, así como de alta y CP CR secuencia de identidad a los miembros de la especie EACMCV de África Occidental, lo que confirma su relación con esa especie. Los dos aislamientos de Tanzania son diferentes alrededor del 8%, mientras que cada una de ellas es más de un 10% diferente a cualquiera de los aislamientos de África occidental. Los dos cameruneses aislados están muy cerca el uno con el otro (> 99%) y alrededor de 3-4% diferente de la de Côte d'Ivoire aislar. Además, el virus de Tanzania mostró la misma recombinación, en relación con EACMV tipo de secuencias, como el EACMCVs de Camerún y de Costa de Marfil, que abarca la C-TerAC1-AC2-AC3 región. Sin embargo, señaló que los aislamientos de Tanzania han perdido o nunca adquirió una pequeña secuencia recombinante al comienzo del genoma, ya presente en el África Occidental aislamientos. El EACMCV-[TZ1] componente B mostró la misma como la recombinación EACMCV-[CM] y EACMCV-B [IC] componentes, que abarca parte de la región BC1. Sin embargo, la EACMCV-[TZ1] B tuvo un componente adicional de dos fragmentos putativo recombinante (250-1700 y 2350-2800 destinatario destinatario) no presentes en el África Occidental aislamientos. Teniendo en cuenta la secuencia identidad de los dos componentes, el hecho de que la secuencia de todas las diferencias se encuentran dispersas a lo largo de sus genomas y el hecho de que existen diferencias en los patrones de recombinación, se sugiere fuertemente que los dos grupos de virus procedentes de África oriental y occidental se han separado Durante mucho tiempo y no son el resultado de una reciente introducción en cualquier dirección. Una recombinación de ADN-A, y uno en el ADN-B, ya que son idénticos, antes de la fecha de su separación, aunque no es posible en este momento a la fecha de la separación. EACMCV-[TZ1] ocurrido ampliamente en el sur de Tanzania, estando presente en más del 98% de los enfermos CMD-las muestras obtenidas de la parte sudoeste de Tanzania Ruvuma, en la Región cerca del lago Malawi, en la misma zona donde EACMCV-[TZ7] fue encontrado. El hecho de que las dos secuencias en Tanzania muestran de dos a tres veces más variabilidad de secuencias y dos fragmentos extra recombinante, junto con el hecho de que el padre EACMV no se ha encontrado hasta el momento en el África occidental, África oriental sugiere un origen de este virus de las especies , Y, por tanto, una posible propagación del Este al Oeste, como se indica en la Figura 10.

EACMV-TZ,-KE, UG -

El resto de los CMGs clonado en este estudio están estrechamente relacionadas con las que se registraron en los países vecinos de Uganda, Kenia o la anteriormente caracterizada Tanzanía aislar de EACMV. Estos fueron EACMV-[TZ / YV], que se asemeja a la EACMV-[TZ] caracterizado anteriormente [19], y EACMV-[KE / TZT] que muestran una alta identidad de secuencia con EACMV-[KE/K2B] de Kenya, en la De su base global de ADN-A nt secuencias. Si bien el PC de EACMV-[TZ / YV] muestran una alta identidad de secuencia con EACMV-[TZ] y EACMZV-[ZB] de la isla de Zanzíbar [12], EACMV-[KE / TZT] de la región de Tanga, mostró alta nt secuencia Identidad con su pariente cercano EACMV-[KE/K2B]. Del mismo modo, EACMV-[KE / TZM] también comparte alta CP nt secuencia de identidad con EACMZV-[ZB]. Se encontró en sólo diez muestras y muy localizada en la propagación en la región. Las plantas infectadas por separado-con-EACMV [KE / TZM] expresó muy graves síntomas tanto en el campo y cámara de crecimiento. Ya sea que este fenotipo es el resultado de la naturaleza de la EACMV-[KE / TZM] Un genoma de ADN aún no se ha establecido. El EACMV-UG2 [TZ10] compartido muy alta de ADN y una identidad de secuencia con CR EACMV-UG2Svr de Uganda. La CR también mostró el 100% de identidad de secuencia con nt EACMV-UG2Svr así como altos CP secuencia de identidad a ACMV aislados, ya que tiene la misma recombinación como su pariente más cercano, EACMV-UG2Svr, que fue probada la participación de dos virus (ACMV y EACMV) [7, 8]. Esta CMG fue localizado en la parte noroeste de Tanzania en la zona posterior a la epidemia. Es evidente que este virus, que ha invadido una gran parte de África central, en unos pocos años [4] (Fig. 8], todavía no ha llegado a la parte sur y el este de Tanzania.

Recombinación de los componentes AyB

El uso de secuencias de todas las CMG disponibles hasta el momento, hemos demostrado que tanto AyB de la mayoría de los componentes de la exposición CMGs putativo recombinante fragmentos de diversos orígenes conocidos o desconocidos. A pesar del menor número de secuencias de ADN-B, los componentes y el menor número de fragmentos putativo recombinante, es interesante observar que, en cuanto a los componentes A, parece que existen "puntos calientes" para la recombinación. Estos puntos calientes de recombinación aparente pueden ser el resultado de las restricciones físicas en las secuencias de virus o simplemente el resultado de las limitaciones funcionales de proteínas recombinantes tener que mantener estructurales y las funciones biológicas. Esos hotspots ya se han mencionado en otros estudios generales de geminivirus recombinación [14], así como en estudios específicos de determinados grupos de geminiviruses [20].

Dos categorías de CMGs en África

Sobre la base de análisis de la recombinación, es evidente que hay en realidad dos categorías distintas de CMGs. ACMV El grupo no tiene fragmentos de ADN geminivirus extranjeros en sus genomas. Por el contrario, todos los demás grupos de especies de África CMG de manifiesto la existencia de amplias recombinación. También es significativo el hecho de que EACMCV aislamientos obtenidos de cada una de las partes del continente africano parecen compartir la misma estructura genética de recombinación y patrón. Esto sugiere que estos virus tienen un origen común, probablemente en el este de África, pero divergieron hace mucho tiempo. Recombinación acontecimientos han demostrado ser factores clave en el desarrollo de CMD epidemias [7, 8, 19] y se ha sugerido que la recombinación es un contribuyente importante a geminivirus evolución [14]. Recombinación de la CP secuencia ha informado de EACMV-UG2 de Uganda [7, 8, 10], un virus que se ha asociado con la actual CMD pandemia que ha devastado la yuca en la región oriental y central de los países de África [4, 21], aunque Actualmente no hay pruebas de que este evento ha sido el factor clave que impulsan la propagación de la pandemia.

B componentes de CMGs en Tanzania

La diversidad de los componentes del ADN-B de EACMV de Tanzania se investigó el uso parcial de ADN-B nt secuencias (BC1-CR), de ~ 560 pb. En general, hubo poca divergencia genética entre los aislamientos en comparación con la excepción de TZB6 que comparte el 97% de identidad de secuencia EACMV-UG1 (AF230375) y el 96% con EACMV-UG3 de Uganda. TZB1 aislar y TZB7 agrupado con EACMCV-TZ1 y probablemente son de Bs EACMCV A componentes. Sin embargo, por el otro aislados o agrupados que formó su propio grupo en el análisis filogenético, es difícil especular en cuanto a lo que representan en parte a que el ADN-de Bs EACMV-[TZ], EACMV-[CE], y todavía no han EACMMV Para ser secuenciados. Sin embargo, estos breves fragmentos indicaron una agrupación, además de EACMV-UG EACMCV y, en 4 grupos adicionales que podrían reflejar una mayor diversidad molecular en el B, los componentes de CMGs en el Este de África de lo que actualmente reconoce.

EACMV evolución

La agrupación de todos los EACMV similares a los virus en una especie ha sido el tema de mucho debate científico en los últimos años. ICTV (Comité Internacional de Taxonomía de Virus) finalmente decidió dividir en 5 especies (por ahora), en su mayoría para dar cumplimiento a las directrices para las especies ICTV demarcación, pero es evidente que estos virus están estrechamente relacionados y ha antepasados comunes. Todos EACMV similares a los virus, con la excepción de EACMCV ocurren en el África oriental, y en su mayor parte este del Valle del Rift. La evidencia presentada aquí y en otras partes proporciona ahora un fuerte caso para un Oriente origen africano para el EACMVs. EACMCV está ampliamente distribuida en toda el África occidental, aunque a baja incidencia [4]. Aunque parece probable que este es el resultado de una introducción temprana o introducciones del África oriental, por el momento no es claro si dicha introducción (s) podría haber tenido lugar. Incluso es posible que la propagación de este virus se produjo en otro de acogida, mucho antes de la yuca se introdujo en África.

Por último, la rápida expansión EACMV-UG2 asociados pandemia de graves CMD en África Oriental y Central representa un contraste, y en la actualidad probablemente único, escenario en el que la combinación de un virulento virus recombinante, superabundant las poblaciones de vectores y locales susceptibles de germoplasma de yuca han dado lugar a una Rápida expansión en la región geográfica de EACMV UG-con el consiguiente efecto devastador en el cultivo de la yuca. Además, es significativo el hecho de que al considerar la proporción de secuencias de pura EACMV columna vertebral en la A todos los componentes de la EACMV similares a los virus, es un claro gradiente de África oriental a Sudáfrica, pasando de 100 a 38%, lo que sugiere que en primer lugar estas Los virus están muy relacionadas y en segundo lugar, que el origen de la EACMVs podría haber sido el África oriental, por lo tanto, las flechas verdes en las figuras 8 y 11. Del mismo modo, un gradiente inverso de la SACMV-como secuencia, que va del 8 al 60% de Zanzíbar a Sudáfrica, sugiere que el antepasado SACMV se encuentra en Sudáfrica. Debido a la recombinación sólo puede ocurrir cuando los dos virus originales se encuentran en la misma planta, es lógico esperar una relación espacial entre los diferentes virus y de los patrimonios genéticos. Sin embargo, es la primera vez que esos gradientes se han demostrado para geminiviruses. La situación para los componentes de B es completamente diferente. No hay EACMV-como gradiente de norte a sur, ya que la mayoría de las secuencias disponibles muestran una gran proporción de EACMV-como secuencias. Sin embargo, es evidente que EACMCV ha capturado a B componente completamente diferente de EACMV, con sólo un pequeño fragmento EACMV similares. Este resultado es concordante con la idea de que B componentes pueden ser contratados independientemente de la naturaleza genética de A componentes como ya se ha sugerido para SLCMV y ICMV [17].

África oriental

África Oriental ha sido la cuna de muchos organismos biológicos a partir de la humanidad. From this work, it is also apparent that Tanzania may also be a potential source of origin of the family of EACMVs. The revealed strain diversity further exemplifies the wealth of this part of Africa with respect to cassava geminiviruses. Some of these viruses have been introduced very recently, such as EACMV-UG2 [TZ10], while others, such as ACMV and the EACMVs, have clearly been present much longer. The East-African Arc Mountain is known to be the main bio-diversity hot-spot in Africa, and an important refuge for plants and animals [ 22 ], therefore it is plausible that some of the geminiviruses that were invading local host plants were spread throughout Africa in their local hosts (for many millions of years), as it was suggested for Rice yellow mottle virus [ 23 ] colonizing the domesticated host in very recent history (a few hundred years). The same type of geminiviruses would have colonized cassava wherever they might be, beginning with that crop's introduction into the African continent in the XVI th century, as these viruses would have had the same potential for such colonization. This might have been the case for EACMCV for which our data presented here suggest an old East African origin for the now widely distributed EACMCV in West Africa. In addition to this scenario, it is certain that cassava geminiviruses have been exchanged throughout the movement of virus infected cassava cuttings via human intervention and by the natural vector Bemisia tabaci . The latter may account for the EACMV/SACMV gradient between East Africa and South Africa, favoured by a natural corridor along the eastern Rift Valley and created by the recombination capacity of CMGs present in the same region.

However, more sequences are required in order to compare and contrast variability within and between the virus populations and to strengthen the understanding of their evolutionary interrelationships. The rapid spread of the EACMV-UG2 associated pandemic has been driven through superabundant whitefly populations [ 24 ], but other important forces in CMG movement and evolution include movement of cassava cuttings and transmission from and into alternative weed hosts. Although cassava was brought to Africa in the XVI th century, it attained its current Africa-wide distribution as recently as the XIX th century. Most current movement occurs informally as farmers move cuttings locally. Wider distribution is less frequent but may be more significant in enabling major displacements of CMGs, such as that hypothesized for the introduction of EACMCV from East to West Africa. Although rapid spread of up to 100 km per year has been reported for the EACMV-UG associated pandemic [ 4 ], elsewhere there appears to be much less local spread of CMGs by whitefly, and physical barriers including lakes, forests and regions where cassava is not grown, appear to be effective in curtailing local spread of CMG. This would seem to account for the apparent 'island' of EACMCV in southern Tanzania as well as the absence of ACMV from coastal East Africa.

Conclusión

In conclusion, we have established the existence of different CMG isolates, strains and species in Tanzania with some isolates resembling those reported previously in East African countries and two isolates very similar to the geographically distant EACMCV from West Africa. This study demonstrates that East Africa is rich in CMGs and could be the cradle for CMG diversification in Africa. It also highlights the urgent need for more information. Only through building a thorough understanding of these important plant pathogens and the evolutionary processes underpinning their emergence can we hope to develop effective and sustainable approaches to managing the disease they cause.

Methods
Collection of plant samples

A total of 510 samples were collected during September 2002 from the northeastern coast (60), east coast (74), southeastern coast (68), southern region (70) and the Lake Victoria Basin (238), representing the major cassava-growing areas in Tanzania. Cassava leaf samples and cuttings (25–30 cm in length) were collected from plants expressing CMD symptoms in fields located at a minimum of 5 km intervals. Leaf samples were kept in a cool box for DNA processing. Selected cassava cuttings were transported to the Donald Danforth Plant Science Center, St. Louis, MO for replanting in controlled growth chambers.

Symptom reproduction in the growth chamber

Selected cassava cuttings collected from the fields were planted in a growth chamber at 25°C with a 16 hours day length and 50% relative humidity and watered twice weekly. CMD symptoms were recorded daily on the newly formed leaves for the first three months and every three days in the subsequent months for an eight month period. Symptom severity on the top five fully-expanded leaves was scored using a scale described by Fauquet et al [ 25 ].

DNA extraction

Total DNA was extracted from the symptomatic cassava leaves collected in the field and growth chamber as described by [ 26 ].

Polymerase chain reaction, cloning, and sequencing

Full-length copies of DNA-A were amplified from total cassava plant DNA extracts using sets of primers (Table 1 ). UNI/F and UNI/R are degenerate primers with annealing positions in the AC1 gene designed to amplify near full-length DNA-A of CMGs (2.7–2.8 kbp) leaving an unamplified portion of ~17 nts. From the near full-length CMG sequences, primers were designed to amplify the remaining partial DNA-A sequences including the missing 17 nts from the original samples. Partial fragments consisting of a region between the BC1 gene and intergenic region (IR) of DNA-B components of EACMV isolates from different cassava-growing areas were amplified by universal primers EAB555-F and EAB555-R (Table 1 ) designed to amplify PCR products of about 540–560 kbp depending on the virus isolate. In order to amplify the DNA-A and DNA-B full-length, PCR was performed with 94°C denaturation followed by 35 cycles of 1 min at 94°C, 59°C for 1 min and 2 min at 72°C. For amplification of the partial DNA-B fragment (BC1/IR), PCR conditions were 30 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min and an extension cycle of 10 min at 72 °C. PCR products of the expected sizes were electrophorezed in a 1% agarose gel in TAE buffer (10 mM tris-acetate, 1mM NaEDTA, pH 8.0), purified, and cloned into the pCR 2.1 vector using the TA cloning kit (Invitrogen, San Diego , CA). Clones containing putative viral sequences were identified by miniprep screening and confirmed positive for inserts by PCR amplification using their respective PCR primers, and inserts were subsequently sequenced in both directions. The complete and partial nucleotide sequences of CMGs were determined by the dideoxynucleotide chain termination method using an ABI automatic sequencer on both orientations at the Protein and Nucleic Acid Chemistry Laboratories (PNACL), Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, USA ( ABI377 DNA sequencer, Perkin Elmer, Foster City, CA). Sequence fragments of < 600 kbp were generated using M13 universal primers. Moreover, to obtain overlapping data from opposite strands of large or full-length fragments, single primers were constructed for genome walking. Sequences were submitted to GenBank and the accession numbers are as follows: Complete nucleotide sequence of DNA-A named EACMCV-[TZ1] (AY795983); EACMCV-[TZ7], (AY795984); EACMV-UG2 [TZ10], (AY795988) ; EACMV-[KE/TZM] (AY795986); EACMV-[KE/TZT], (AY795985); EACMV-[TZ/YV], (AY795987); ACMV-[TZ] (AY795982); and DNA-B for EACMCV-[TZ1](AY795989). Partial DNA-B (BC1/ICR) sequences of EACMV isolates from Tanzania named TZB (AY800251), TZB1 (AY800252), TZB2 (AY800253), TZB3 (AY800254), TZB4 (AY800255), TZB5 (AY800256), TZB6 (AY800257) , TZB7 (AY800258), TZB8 (AY800259), TZB9 (AY800260), TZB10 (AY800262), TZB11 (AY800261), and TZB12 (AY800263).

Computer analysis of CMG sequences

Virus sequences were edited using BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, 1999) and SeqEdit (DNAStar, Madison, WI) to obtain a consensus sequence for each. Reference geminiviruses for full length CP and CR sequence alignments were compiled by extracting the complete DNA-A and DNA-B sequences, the CP ORF (approximately 765–777 bp) and CR sequences (approximately 150–170 bp) from sequences available in GenBank (accession # are provided in the figures). Multiple sequence alignments of the full-length DNA-A, DNA-B, capsid protein (CP) gene and common region (CR) were carried out using the Clustal Program (MegAlign, DNAStar). The phylogenetic trees were constructed from the multiple alignments by the neighbor-joining majority rule consensus. Multiple alignments were analyzed by maximum parsimony with full-length DNA-A, DNA-B and CP phylogenetic trees using Phylogenetic Analysis Using Parsimony (PAUP) [ 27 ] and a bootstrap analysis with 1000 replicates was performed. Only values above 50% were reported on the trees in the figures. Virus specific iterons in the CR of selected CMGs were identified and compared with the analogous iterons of the Tanzanian isolates of CMGs.

Recombination analysis for cassava mosaic geminiviruses

The pairwise comparison sequence analysis (PCSA) method compares the profile of a pair of sequences to that of an average profile of sequences that are selected a priori , based on knowledge that the selected sequences are related to the species or the isolate levels [ 20 ] . According to the guidelines established by the ICTV Geminiviridae Study-Group, two geminivirus sequences sharing more than 89% identity of their A component sequences are considered strains or isolates of the same species. Where homology is less than this, they are considered to be members of different species [ 5 ]. However, viruses that share between 80 and 90% sequence identity are often found to be recombinants [ 2 ], therefore, in the PCSA, we consider viruses sharing less than 80% identity as different species. PCSA profiles were carried out between sequences of different species and of different isolates and an average profile for the considered cluster of viruses was calculated for these two categories with increments of 50 nts along the genome sequence. A standard deviation value for each segment was calculated and minimum and maximum values corresponding to two standard deviation values were also calculated (Fig. 1 ). Each chosen pairwise analysis for putative recombinant sequences was then compared to the species average profile and the pertaining of each 50 nts fragment to this category is examined. Segments different from more than 2 standard deviation values were considered to be putative recombined fragments. For each PCSA, a putative recombination percentage for the genome is calculated and a corresponding map can be drawn. It is verified ( a posteriori ) that the particular representatives of species and isolates selected for the 'Species and Isolate Average Curves' are 100% non-recombinant at the time of the analysis [ 20 ]. No statistical test is applied to PCSA.

Competing interests

The author(s) declare that they have no competing interests.

Authors' contributions

Design and conception of the study (JN, JPL, TASA, GT, CMF); execution of the experiments (JN); manuscript preparation (JN, JPL, CMF); sequence analysis, alignment and phylogeny (JN, CMF). All authors read and approved the final manuscript.

Agradecimientos

This study was funded by the Crop Protection Programme of the UK's Department for International Development (DFID) through the Tropical Whitefly IPM Project of the System-wide Programme for Integrated Pest Management (SP-IPM). SP-IPM is an inter-centre programme established by the Consultative Group for International Agricultural Research (CGIAR). The senior author was also supported through a graduate fellowship from the International Institute of Tropical Agriculture (IITA) and by the Donald Danforth Plant Science Center, which supported some of the costs in St. Louis. The assistance of Mr. Cyprian Alloyce Rajabu of Plant Protection Division in Mwanza during sample collection is highly appreciated. Special thanks are due to other colleagues for helping in various ways, especially Dr. Justin Pita of the Noble Research Foundation, Ardmore, Oklahoma, USA, and Ismaël Ben F. Fofana of the International Laboratory of Tropical Agricultural Biotechnology (ILTAB), Donald Danforth Plant Science Center, St. Louis, MO, USA for his technical assistance. The views expressed do not necessarily represent those of DFID.