Virology Journal, 2005; 2: 22-22 (más artículos en esta revista)

Modulación de las funciones de los macrófagos por sheeppox virus proporciona explicaciones para entender la interacción del virus con el sistema inmune del huésped

BioMed Central
Abdel-Aziz S Abu-EL-Saad (elsaad1@yahoo.com) [1], S Ahmed Abdel-Moneim (a_s_abdel_moneim@yahoo.com) [2]
[1] Departamento de Zoología, Facultad de Ciencias, Universidad de El Cairo,-Beni Suef, Egipto
[2-62511, Egipto

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Resumen
Antecedentes

Poxviruses codificar una serie de genes inmunomoduladores para subvertir o evadir los desafíos planteados por la innata y la respuesta inmune adaptativa. Sin embargo, la inactivada poxviruses inmunoestimulantes poseía la capacidad y se utiliza como profiláctico o metaphylactic aplicación eficiente que la reducción de la susceptibilidad a las enfermedades infecciosas en diferentes especies. Este hecho es intensamente estudiado en diferentes géneros de poxviruses. Sin embargo, poco se sabe acerca de los mecanismos básicos adoptados por el virus de sheeppox (SPPV). SPPV causa una enfermedad aguda de las ovejas que recientemente, se ha observado a reinfect su acogida a pesar de la vacunación.

Resultados

Mediante la inyección de sheeppox atenuados o inactivados SPPV virus de la vacuna en ratones suizos adulto de sexo masculino, se encontró SPPV para reducir los macrófagos' funciones en un evento local que se produce en el lugar de aplicación 12 h tras la administración de la vacuna, como se indica por el aumento de nivel de IL-10 y la disminución de Nivel de SOD cultivadas de macrófagos peritoneales. En contraste el aumento de los niveles de IL-12, y la actividad de SOD cultivadas esplénica macrófagos, linfocitos respuesta a la PHA-P, y en vivo de respuesta a T-dependiente se detectaron Ag. Estos efectos se observaron en los dos SPPV inactivados y atenuados, pero más atenuados en uno.

Conclusión

Los resultados de este estudio ayudarán a dilucidar, el fenómeno de la existencia natural de las infecciones en SPPV ovejas en lugar de la vacunación y de los mecanismos básicos responsables de la capacidad de los inmunoestimulantes sheeppox virus. A nivel local, SPPV muestra pruebas de un mecanismo de escape inmune que alivia la respuesta inmune del huésped. Más tarde y de forma sistémica, el virus protege el anfitrión de cualquier fatales consecuencias de la supresión del sistema inmunológico.

Antecedentes

Sheeppox virus, un virus de ADN epitheliotropic, está clasificado como un miembro de Capripox virus de género que representan uno de los ocho géneros dentro de la subfamilia chordopox virus de la Poxviridae. Género Capripoxvirus se compone de sheeppox virus, goatpox virus, y con nódulos virus de la enfermedad de la piel que causa la enfermedad en ovejas, cabras o ganado, respectivamente. Estos virus son responsables de algunas de las enfermedades económicamente más importantes de los rumiantes domésticos en África y Asia [9, 10]. SPPV vivos atenuados y subunidad formulaciones se han utilizado experimentalmente y en enzoótica, así como las zonas con brotes como las vacunas contra la sheeppox, goatpox, desiguales y enfermedad de la piel [8, 9].

El Poxviridae son los principales virus conocidos [10] que tienen fuertes propiedades inmunogénicas. Poxviruses modular la respuesta inmune en los hosts infectados mediante la inhibición de la síntesis y liberación de IL-1 de las células infectadas; codificación de los receptores solubles de citoquinas tumoral TNF-α, β-TNF, IL-1, y esto es importante, IFN-γ; sintetizar virus - Codifican citocinas como el factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento transformante, que antagonizar los efectos de los receptores de citoquinas antivirales proceso de la mediación [16, 26]. Además, la inducción de apoptosis en un número significativo de células presentadoras de antígenos-[20], así como la inducción de IL-10 en libertad que tiene la capacidad de afectar a la iniciación de una respuesta inmune adquirida [16, 21]. Si el virus no se secretan proteínas tales inmunomoduladora, como cuando los respectivos genes o se suprimen los virus son inactivados, la fuerte inmunogenicidad de los virus inmune del huésped puede inducir reacciones que ya no son inhibidas [19]. Esto se sustenta en estudios anteriores que revela una mayor fagocitosis, natural killer (NK), la actividad de células, y la liberación de IFN-α mediante el uso de la inactivada poxviruses [7, 24]. Además, la secreción de TNF-α, IL-2, y la colonia de granulocitos y macrófagos, factor estimulante también se puede mejorar [23, 30]. Esta premisa lleva a la recomendación de utilizar como profiláctico poxviruses inactivadas o metaphylactic herramienta en la reducción de la susceptibilidad a las enfermedades infecciosas [31]. Sin embargo, se ha informado recientemente de que parapoxvirus ovis inactivado, fue capaz de inducir la apoptosis de las células presentadoras de antígeno (APC) [20].

En este estudio, el virus de sheeppox inmunomoduladora efectos inducidos se caracterizaron por esclarecer los mecanismos básicos responsables de la comprensión de la interacción con SPPV sistema inmune del huésped. Como marcadores para la pronta reacciones inmunológicas, las células peritoneales fueron probados in vivo después de tratamiento con SPPV para la liberación de IL-10 y las actividades de la SOD. Marcadores para finales de las reacciones fueron la proliferación de esplenocitos respuesta a la PHA-P, la IL-12 en libertad, y la actividad de SOD, de los macrófagos cultivados esplénica de los animales tratados. La respuesta de anticuerpos a CRBC también se evaluó en diferentes grupos de tratamiento.

Resultados
La secreción de IL-10 por los macrófagos peritoneales

A las 12 h después del tratamiento, ambos grupos vacunados mostraron aumento de la IL-10 (P <0,05) en comparación con el placebo. Atenuado SPPV grupo vacunado mostró significativa (P <0,01) incremento en comparación con el placebo. No se observó una variación significativa entre los grupos tratados SPPV Fig. 1.

Secreción de SOD por macrófagos peritoneales

A las 12 h después del tratamiento, ambos grupos tratados presentaron SPPV significativa disminución de la actividad SOD (P <0,05) en comparación con el grupo sin tratamiento. No se observó una variación significativa entre los grupos tratados SPPV Fig. 2.

La secreción de IL-12 por los macrófagos esplénica

A los 6 días después del tratamiento, SPPV ambos grupos tratados mostraron un aumento de la IL-12 (P <0,05) en comparación con el grupo sin tratamiento Fig. 3a. Atenuado SPPV grupo tratado mostró valor altamente significativo (P <0,01) que la registrada con el placebo ratones. A los 9 días post inoculación atenuada SPPV grupo tratado mostró significativo aumento de la secreción de IL-12 (P <0,01) en comparación con los dos inactivada SPPV grupo tratado y sin tratar un Fig. 3b.

Esplenocitos blastogenic respuesta

No se detectaron diferencias significativas entre los distintos grupos a las 12 h, 3 y 6 días después del tratamiento. Esplenocitos significativo aumento de la proliferación de respuesta a la PHA-P (P <0.01) se observó en 9, y 12 días post inoculación en atenuados SPPV de placebo. Atenuado grupo mostraron un aumento de inactivadas, tanto en grupo 9 (P> 0,05) y 12 días (P> 0,01). No se observó una variación significativa entre inactivada SPPV y grupo de control a los 12 días después del tratamiento el cuadro. 1.

Secreción de SOD por macrófagos esplénica

No se detectaron diferencias significativas entre los distintos grupos a las 12 h después del tratamiento. A los 3 días post inoculación significativo aumento de la actividad se observó SOD (P <0,01) en SPPV atenuado en comparación a los otros grupos. Significativo aumento de la actividad SOD (P <0,05) se observó a los 6 meses (P <0,05), 9 (P <0,01), y 12 (P <0,01) días post inoculación SPPV en ambos grupos de tratamiento en comparación con el grupo sin tratamiento Cuadro. 2.

La respuesta inmune a CRBC

SPPV ambos grupos tratados mostraron aumento significativo en los títulos de anticuerpos haemagglutinating a CRBC (P <0,05) en comparación con el grupo sin tratamiento Fig. 4.

Discusión

Inactivado poxviruses mostró capacidad inmunoestimulantes. Esa capacidad es común a poxviruses de diferentes géneros [11]. Este hecho hace que poxviruses vectores comunes en el desarrollo de vacunas. Por otra parte, poxviruses expresar una amplia variedad de proteínas que no son de virus de replicación in vitro, sino ayudar al virus a evadir la respuesta a la infección de acogida que a su vez puede afectar a la respuesta inmunológica contra el virus vivos. Esa no incluye las proteínas solubles de los receptores de IFN α, β, TNF α, SOD-como las proteínas, etc .. [16, 26, 35]. Estos hechos, junto con el SPPV recurrencia de la infección entre los rebaños vacunados [33] vamos a estudiar en primer lugar, el posible papel fundamental en la inducción de SPPV inmunosupresión local como un mecanismo crucial de escape inmune, y en segundo lugar, para evaluar el potencial efecto beneficioso de la sistémica SPPV sobre el sistema inmune del huésped.

A principios de SPPV respuesta inmune en el sitio de la inoculación se ofrece una explicación de la capacidad de SPPV inducir a la represión local en el lugar de la inoculación, como se indica por el aumento de la secreción de IL-10 y la disminución de actividad de la enzima SOD 12 h después de la inyección. IL-10, un anti-inflamatorio prototypic de citoquinas, que inhibe la función de la APC y, en definitiva, la inducción de la inmunidad anti-virus [12], impide la diferenciación de los monocitos de DC [5], e inhibe en la regulación de endocitosis mediada por receptores y Macropinocytosis tras la exposición a un inmunógeno soluble [25]. Además, la IL-10 reduce la producción de IL-2, IFN y TNF murino por las células Th1 [14], así como la producción de IL-12 por la APC [18]. IL-10 puede también, intervenir en el nivel de antígeno de procesamiento dentro de la célula de modo que el antígeno no es degradado de manera eficaz y moléculas MHC de clase II no carga con péptido [13]. En consecuencia, el aumento de la secreción de IL-10 por SPPV tiene la capacidad de inhibir la presentación de antígenos de células (APC), así como función de la respuesta innata y, por tanto, menoscabar el inicio de una respuesta inmune adquirida. Tal efecto inhibe la generación de la memoria inmunológica a la inmunidad necesaria en la exposición posterior [2]. Curiosamente, ambos inactivados y atenuados SPPV incrementaron significativamente en la producción de IL-10 de macrófagos peritoneales. Por otra parte, la disminución de la SOD actividad in vitro de macrófagos peritoneales cultivadas SPPV observado en dos grupos de tratamiento también puede mejorar la supervivencia del virus in vivo, y en presencia de los fagocitos. Superóxido se genera deliberadamente por los fagocitos durante la explosión respiratoria para matar los microorganismos [3]. La regulación de los celulares poxvirus-SOD en las células infectadas podría perturbar el equilibrio de los oxidantes y antioxidantes. Los radicales superóxido surgir durante numerosos oxidaciones en ambos sistemas de vida y de ser humano y puede actuar directamente como oxidantes o generar otros productos reactivos que son tóxicos para las células, causando daños a los lípidos de membranas, ácidos nucleicos, carbohidratos y proteínas. SOD scavenges especies activas de oxígeno generados durante el metabolismo aeróbico. En consecuencia, la existencia aeróbico se acompaña de un persistente estado de sitio oxidativo, y la supervivencia de una célula está determinado por su equilibrio de los intermediarios reactivos del oxígeno y antioxidantes. Perturbación de este equilibrio puede conducir a la enfermedad [17]. Además, puesto que el estrés oxidativo puede inducir la apoptosis [6], este virus puede ayudar a la difusión, hecho registrado poxviruses con otros [20]. Además, un aumento en el estado de resultados oxidante celular en la activación de factores de transcripción, como el NF-κ B [28], que pudieran ser necesarias para la replicación de algunos virus [27, 37]. Virulenta del virus SPPV Mayo defensor similares mecanismos de evasión inmune que desviar el aborto y la regulación de la inmunidad celular.

Con el fin de obtener más información sobre los procesos en que se basa la posible efecto estimulante inmune de la vacunación con SPPV, el ex-vivo de los niveles de IL-12, SOD esplénica en los macrófagos, y la magnitud de splenocyte respuesta proliferativa a PHA-P, así como la In vivo sobre SPPV efecto de la respuesta inmune humoral a Ag TD; CRBC se estudiaron. Los datos obtenidos mostraron que los ratones vacunados con éxito SPPV muestran aumentos significativos en los niveles de IL-12 en 6 y 9 días posteriores a la vacunación en comparación con ratones no vacunados. IL-12 fue examinado en ese momento, dado que es probable que un mínimo de cinco días es necesario para crear una barrera eficaz por poxvirus mediada por células T de activación y secreción de citoquinas [11]. Curiosamente, SOD, y linfocitos blastogenesis así como a la respuesta inmune humoral CRBC fue significativamente mayor en los ratones vacunados SPPV especialmente en el grupo tratado con SPPV atenuados que pueden estar relacionados con la replicación del virus. Aumento de linfocitos T esplénica respuesta a la PHA-P en ratones vacunados SPPV indica que puede ayudar en el mantenimiento óptimo de respuesta de células T después de la vacunación. Estos efectos también podrían basarse en el aumento de las cantidades de SPPV inducida por aumento de la IL-12 debido a la capacidad de la IL-12 inducen a la primera fase de Nagorno-Karabaj y de la activación de células T [34]. Utilizando como modelo de CRBC TD Ag, se ha demostrado que era capaz de SPPV mejorar TD Ab respuestas. Curiosamente, el incremento se observó en los ratones vacunados con cualquiera de las dos SPPV atenuados o inactivados. Además, el aumento de linfocitos blastogenesis SOD y que se relacionó. Estos resultados son los primeros en demostrar un efecto de SPPV inmunoestimulantes. Aumento de las respuestas a la TD en Ags SPPV ratones vacunados puede deberse a la mejora de la producción de IL-12, el aumento de capacidad de respuesta de los linfocitos T y de la actividad de SOD que se registraron en este estudio. IL-12 mejora podrá iniciar tales cascada como se ha constatado a ser el factor dominante en el desarrollo del fenotipo Th1 y también directamente, de sus asociados o de la liberación de citoquinas tipo 1, aumenta la activación y la producción de inmunoglobulinas asociadas Th1-[ 1]. Además, la IL-12 no es sólo un elemento conectivo entre las células y los linfocitos de accesorios, pero también es una molécula clave para la programación de los macrófagos y las células dendríticas funciones [4]. Uno de los principales efectos de la IL-12 en los macrófagos y las células dendríticas es la inducción de IFN-γ, resultando en una respuesta positiva capaz de activar en diferentes situaciones [15].

Nuestras observaciones indican que la SPPV inducida por la reducción de los macrófagos' funciones en un evento local que se produce en el lugar de aplicación 12 h después de la administración. Por el contrario, 3 a 12 días después de la inyección de cualquiera de SPPV inactivados o atenuados, funciones mejoradas esplénica de los macrófagos y el aumento de la capacidad de respuesta de los linfocitos resultaron ser significativamente mayor que fue más pronunciada en la atenuada vacuna inactivada en lugar de uno. La combinación de los mecanismos de represión y estimulantes es una complicada mezcla de estrategia de supervivencia viral.

Conclusión

A nivel local, SPPV muestra pruebas de un mecanismo de escape inmune que alivia la respuesta inmune del huésped a las proteínas virales y, por tanto, genera la posibilidad de replicar en el país de acogida a pesar de la vacunación. Dicha estrategia sugiere una mayor replicación parece ser esencial para la continuación de la existencia de SPPV. Sorprendentemente, la inyección de inactivadas SPPV producido efectos similares, pero en menor medida que denota: evadir la respuesta inmune del huésped por SPPV no depende de la infectividad del virus. Más tarde y de forma sistémica, el virus protege el anfitrión de cualquier fatales consecuencias de la supresión del sistema inmune por aumento de las actividades de compensación de los macrófagos y los linfocitos esplénicos. Esta cascada de eventos inmunológicos sería una excelente estrategia para el virus para sobrevivir.

Métodos
Animales

Ocho semanas de edad suizos ratones machos (biológicas Supply Center, el Instituto de Investigación Theodar Bilharz (TBRI), El Cairo, Egipto) se han utilizado en este estudio. Los ratones fueron criados convencionalmente, y recibieron la dieta estándar de laboratorio, así como de agua ad libitum.

Virus

SPPV vacuna atenuada (producción de vacunas y sueros y el Instituto de Investigación, Abbasia, El Cairo, Egipto) se utilizó. Las Vacunas se reconstituyó en 2 ml de PBS estéril (pH 7,4), con ajuste en la membrana chorioallantoic de 10 días de edad, libres de patógenos específicos huevos embrionados de pollo (SPF Nilo, Koom Oshiem, Fayoum, Egipto). La mitad de la población del virus de preparación fue inactivada mediante β propiolactone como ha sido descrito previamente [23].

Animal inoculación

Noventa ratones se dividieron en tres grupos (30 ratones por grupo). Ratones en el grupo 1 y 2 fueron inoculados con 10 7 EID 50 / 0,2 ml inactivados y atenuados de la vacuna SPPV, ip, respectivamente, por la vía de inoculación. Ratones, en el grupo 3 se mantuvieron como un placebo y inoculados con PBS estéril por la misma ruta.

Los análisis de la IL-10 y de la SOD cultivadas macrófagos peritoneales

Los macrófagos peritoneales se recolectaron 12 h después de la inoculación ip SPPV por lavado peritoneal. Las células fueron lavadas dos veces con PBS estéril, incubadas en la placa y 24 (Costar, Cramlington, Reino Unido) en una concentración de 1 × 10 6 células / ml en RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Grand Islas, NY) durante 4 horas a 37 ° C en el 5% de la tensión de CO 2. No adherente células fueron retirados por tres repetidos lavados y macrófagos peritoneales incubados con lipopolisacárido 1 μ g / ml (Sigma Chemical Co, EE.UU.) durante 48 horas a 37 ° C. Al final del tiempo de incubación, la cultura sobrenadantes fueron recolectados, aclaró por una baja velocidad de centrifugado a 250 g durante 10 min, y se mantuvo a -20 ° C hasta su procesamiento para la IL-10, a través del ratón IL-10 kit de inmunoensayo (BioSource International Inc EE.UU.), con arreglo a la fabricación de instalación. SOD también se evaluó la actividad en macrófagos peritoneales de los sobrenadantes la cultura a través de la inhibición de la pirogálico autoxidation como se describe [22]. Una unidad de SOD actividad se define como la cantidad de enzima requerida para inhibir autoxidation en un 50% a 25 ° C.

Esplenocitos preparación

Proliferación de ensayo se realizó a las 12 h, 3, 6, 9, 12 días post inoculación SPPV. Aséptica bazo fueron removidos y colocados en el hielo frío estéril PBS, (pH 7.4). Cada bazo se exprimió con un émbolo de la jeringa de 5 ml para dar forma a las células. Suspensiones de células fueron centrifugadas a 250 g durante 10 minutos. Pildoradas células se resuspendió en 5 ml de buffer de lisis (Tris 0,17 M y cloruro de amonio 0,16 M, pH 7,2) y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 min a lyse los glóbulos rojos. Suspensiones de células se lavaron dos veces con PBS y viabilidad celular determina utilizando colorante azul de tripan método de la exclusión.

Splenocyte proliferación de ensayo

Esplenocitos se suspendieron en RPMI-1640 con 10% de FCS. Un centenar de micro-litros de suspensión de las células (1 × 10 5 células por cada 100 ul) se han añadido a cada uno de los 96-y así placa microtiter (Costar, Cramlington, Reino Unido). Esplenocitos fueron estimulados con PHA-P (Sigma, Chemical Co.USA) a una concentración final de 10 ug /. Los cultivos de células fueron incubadas durante 48 horas a 37 ° C con 5% de la tensión de CO 2. Splenocyte proliferación se midió usando 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT) bromuro de tinte descrito como método de absorción [32]. Los linfocitos blastogenesis se expresó como índice de estimulación (SI): SI (%) = A2-A0/A1-A0. A2 es la absorción de las culturas con la APS-P; A1 es la absorción de las culturas sin mitogen; A0 es la absorción de blanco (sólo medio de cultivo).

Los análisis de la IL-12 y de la SOD cultivadas esplenocitos

El esplénica macrófagos fueron incubados en placas de 24 y en una concentración de 1 × 10 6 células / ml en RPMI 1640 durante 4 horas a 37 ° C en el 5% de la tensión de CO 2. No adherente células fueron retirados por tres repetidos lavados y esplénica macrófagos se incubaron con lipopolisacárido 1 μ g / ml durante 48 horas a 37 ° C. Al final del tiempo de incubación, la cultura sobrenadantes fueron recolectados, y se mantuvo a -20 ° C hasta su procesamiento para la IL-12 a través del ratón IL-12 kit de inmunoensayo (BioSource International Inc EE.UU.), con arreglo a la fabricación de instalación. El ensayo reconoce tanto naturales como libre subunidad p40. SOD también se evaluó como se describió anteriormente.

Efecto de la SPPV sobre la respuesta inmune a CRBC

Ratones en todos los grupos fueron inoculados ip con 1 × 10 7 CRBC en día 7. Suero se obtuvo CRBC siete días después de la inmunización, la prueba del agglutinins contra CRBC por microhaemagglutination la prueba de acuerdo a [36].

Análisis estadístico

Análisis de la varianza (ANOVA) se realizó la prueba de las diferencias entre los grupos tratados con arreglo a [29].

Lista de las abreviaturas

Ab, de anticuerpos; Ag, antígeno; Ags, antígenos; attenu. Atenuados; APC, la presentación de antígenos de células; CRBC, pollo glóbulos rojos; DC, de células dendríticas; Th; T-helper; IL, interleucina; inactivadas., Inactivado; INF, el interferón; NK, células natural killer; PHA-P, phytohaemagglutinin-P; SOD, superóxido dismutasa; SPPV, sheeppox virus; SI, índice de estimulación; TD, T-dependientes; TNF, factor de necrosis tumoral.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Abu-Saad El-participó en el diseño del estudio, llevado a cabo el trabajo con los ratones, con la asistencia en el trabajo experimental y redacción del manuscrito. Abdel-Moneim concibe el estudio, diseñado y llevado a cabo el trabajo experimental y de redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.