Virology Journal, 2005; 2: 24-24 (más artículos en esta revista)

Mecanografía de rotavirus humanos: nucleótidos desajustes entre el primer y VP7 genes están asociadas con el fracaso de genotipos

BioMed Central
Mustafizur Rahman (mustafizur.rahman @ uz.kuleuven.ac.be) [1], Rasheda Sultana (rasheda_sultana@yahoo.com) [1], Goutam Podder (gpodder@icddrb.org) [1], Abu Faruque SG (faruque @ Icddrb.org) [1], Jelle Matthijnssens (jelle.matthijnssens @ uz.kuleuven.ac.be) [2], Khalequz Zaman (kzaman@icddrb.org) [1], Robert F Breiman (rbreiman@cdcnairobi.mimcom . Netas) [1], David A Sack (dsack@icddrb.org) [1], Marc Van Ranst (marc.vanranst @ uz.kuleuven.ac.be) [2], Tasnim Azim (tasnim@icddrb.org) [1]
[1-1212, Bangladesh
[2-3000, Leuven, Bélgica

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Resumen
Antecedentes

Rotavirus genotipo se realiza mediante el uso de PCR con transcripción inversa de tipos específicos de los cebos. Debido a la alta tasa de mutación rotavirus genera una amplia variación genómica, el Grupo de los diferentes tipos específicos de primer conjuntos se aplican en distintos lugares geográficos. En Bangladesh, una proporción importante (36,9%) de las cepas de rotavirus aislados en el año 2002 no podía ser mecanografiado G-utilizando el utilizado habitualmente primer set. Para investigar la razón por la que fueron untypeable, secuenciación de nucleótidos de los genes VP7 se realizó.

Resultados

Cuatro sustituciones de nucleótidos en el G1-primer sitio de unión de los genes VP7 de rotavirus G1 Bangladesh dictó una proporción importante de las cepas circulantes en untypeable utilizando la rutina primer set. El uso de un conjunto alternativo ejemplo, podríamos identificar rotavirus G1 como el genotipo más frecuente (44,8%), seguido de G9 (21,7%), G2 (15,0%) y G4 (13,8%).

Conclusión

Debido a la variación natural en el rotaviral secuencias de genes, una estrecha vigilancia de rotavirus genotipo métodos es importante.

Antecedentes

Los rotavirus siguen siendo la causa más común de gastroenteritis aguda en todo el mundo y causa un estimado de 600000 muertes en niños menores de 5 años de edad [20]. La elevada carga de morbilidad por motivos importantes esfuerzos para desarrollar una vacuna contra el rotavirus adecuado. Sin embargo, la eficacia de la vacuna está siendo cuestionada por la amplia diversidad de la cepa de rotavirus "[3, 7 - 9, 13, 14].

Los rotavirus pertenecen a la Reoviridae, y su genoma consiste en 11 segmentos de ARN doble varados. El gen que codifica la serie de sesiones de la glicoproteína VP7 es la base de genotipo rotavirus en el grupo A por lo menos 15 G-genotipos. Entre ellos, G1, G2, G3, G4 y G9 son los más comunes Grupo de los tipos en los seres humanos [5, 15, 16, 19, 21, 23]. La importancia de tipo inmunológicos específicos de la protección contra la enfermedad por rotavirus aún está en discusión [13].

G-genotipificación se realizó a través de tipos específicos de la base-primer RT-PCR. Dos conjuntos de primer comunes introducidos por Gouvea et al. [6] y Das et al. [2] se utilizan actualmente en los rotavirus G-escribir los programas de vigilancia [22]. El fracaso en el genotipo o mistyping ya se ha informado de diferentes partes del mundo. Estos informes mostraron que las diferencias entre la secuencia de nucleótidos de la región de orientación de los respectivos genes y secuencias de los primers utilizados para escribir conducido a la determinación del genotipo fracaso [1, 10, 11, 17].

El hospital de Dhaka ICDDR, B, situado en el centro de Bangladesh, y el hospital de Matlab, ubicada a 45 km al sureste de Dhaka, respectivamente, sobre el tratamiento de la diarrea 100000 y 15000 pacientes cada año. Un hospital sistema de vigilancia se ha establecido en estos hospitales por ICDDR, B para reunir información sobre investigación clínica, epidemiológica y las características demográficas de los pacientes atendidos en el hospital desde 1978. En Bangladesh, las cepas de rotavirus han sido previamente mecanografiadas usando una variedad de técnicas. Serotipificación fue presentado por Ward et al. [28] con los especímenes recolectados durante 1985-1986 en Dhaka utilizando neutralización con antisueros hiperinmune contra las cepas prototipo de rotavirus G1, G2, G3 y G4. Llegaron a la conclusión de que epitopic variaciones entre las cepas de rotavirus influido en la sensibilidad de la serotipificación. Diversión et al. [4] detectado los principales tipos de rotavirus (G1 a G4) por hibridación con el RNA serotipo-específicas sondas de oligonucleótidos sintéticos, pero este método no podía tipo 33,3% de la de Bangladesh rotavirus ". Asimismo, la RT-PCR según el tipo de oligonucleótidos específicos de tipo no una parte importante de rotavirus ". Rotavirus vigilancia de los estudios en Bangladesh entre 1987 y 1997, informó de que 1095 (43,7%) muestras de 2515 se G-untypeable [25 - 27].

En este estudio, se caracteriza por rotavirus positivo muestras de heces recolectadas en el Dhaka Matlab y hospitales durante el año 2002 mediante el uso de RT-PCR basada en el primer conjunto descrito por Das et al. [2]. Se encontró que una proporción importante de los especímenes fueron untypeable. Las secuencias de nucleótidos de los genes VP7 se han realizado para investigar la razón por la que se untypeable rutina con el primer set. El untypeable especímenes se caracterizan por seguir utilizando otro primer conjunto descrito por Gouvea et al. [6].

Resultados y Discusión
La detección de cepas de rotavirus

En 2002, un total de 3803 pacientes con historia de diarrea fueron incluidos en el sistema de vigilancia del hospital. En Dhaka y Matlab, 535 (27,2%) y 358 (19,4%) muestras fueron positivas para el grupo A rotavirus antígenos por enzimoinmunoensayo.

G Das escribir usando el primer conjunto

Rotavirus G-escribiendo se llevó a cabo para todas las muestras positivas de rotavirus Matlab y uno de cada cuatro de las muestras positivas de rotavirus de Dhaka. Algunas muestras fueron excluidos de este estudio debido a la falta de suficiente cantidad de muestras de heces para la realización de pruebas. G-escribiendo se realizó en 433 rotavirus-ELISA positiva muestras de heces por RT-PCR utilizando el primer conjunto descrito por Das et al. [4], que se utilizan habitualmente en nuestro laboratorio. Las más frecuentes fueron el G G9 (20,5%), G2 (14,6%) y G4 (13,8%). G1 representaban sólo el 11,6% de los aislamientos y el 36,9% de las muestras positivas de rotavirus fueron untypeable.

Análisis de secuencias de genes VP7

Amplificamos la VP7 genes seleccionados al azar de cinco untypeable cepas (Dhaka162-02, Dhaka18-02, Dhaka164-02 Dhaka165-02 y Matlab26-02) a través del consenso VP7 primers Beg9-End9 descrita por Gouva et al. [6] y la secuencia completa de su marco de lectura abierta [GenBank: AY631050, GenBank: AY631054]. Ellos han sido escritos como rotavirus G1 utilizando BLAST búsquedas de homología (99-100% de nucleótidos y aminoácidos con las identidades indias cepa de rotavirus G1, ISO-4). Para compararlos con los typeable G1 secuencias, la VP7 genes de dos typeable cepas G1, Dhaka8-02 [GenBank: AY631049] y Matlab159-02 [GenBank: AY631055] fueron secuenciados. Se halló que las secuencias de nucleótidos de la typeable la untypeable G1 y 100% de las cepas eran idénticas en el G1-primer sitios de unión. Hemos alineado el objetivo G1 VP7 secuencia con el primer G1 Das secuencia (primer invertir, 9T1-1; 5'-TCTTGTCAAAGCAAATAATG-3 '; nt 176-195, prototipo de cepa Wa [GenBank: M21843]) para determinar si existe algún desajuste Entre ellos. Cuatro desajustes se encontraron en el primer G1 Das, 9T1-1, a los 5 'finales (Fig. 2]. Debido a que esos errores, el primer G1 Das no detectar la mayoría (75%) de las cepas G1. Dado que, el primer conjunto perfecto había coincidencias en el extremo 3 ', que puede detectar el 25% de los rotavirus G1. Cuando se comparó la secuencia con el objetivo Gouvea G1 primer orden (avance ejemplo, aBT1; 5'-CAAGTACTCAAATCAATGATGG-3 '; nt 314-335, prototipo de cepa Wa), que sólo encontró un desajuste (Fig. 2]. Por lo tanto, el primer Gouvea G1 se encontró que era más adecuado para escribir nuestras cepas G1.

Distribución de los tipos G utilizando Gouvea primer conjunto

El untypeable especímenes han sido escritos utilizando el primer conjunto descrito por Gouvea et al. [6]. Después de teclear con los Gouvea primer conjunto, la distribución de rotavirus G-tipos cambiado drásticamente (Fig. 1]. Tipo G1 ahora representaban el 44,8% de los aislamientos y se convirtió en el genotipo más frecuente, y el número de cepas untypeable se redujo del 36,9 al 2,1%. Los otros tipos son comunes G G9 (21,7%), G2 (15,0%) y G4 (13,8%). Los estudios anteriores en Bangladesh informó de que el G4 cepas más prevalentes fueron las cepas durante 1992-1997 y un número importante de cepas de rotavirus se untypeable utilizando el Das primer conjunto [26]. Es probable que el Das primer conjunto no puede detectar la mayor parte de los rotavirus G1, en los años anteriores y que una mayoría de los untypeable rotavirus fueron las cepas G1.

Conclusión

Debido a la variación natural en el rotaviral secuencias de genes, una estrecha vigilancia de rotavirus genotipo métodos es importante. Los resultados descritos en este documento será importante para las estrategias de genotipado en la vigilancia de rotavirus estudios.

Materiales y métodos
Recogida de muestras

Se recogieron muestras de heces de pacientes con diarrea que se presentaron a los hospitales de Dhaka y Matlab de ICDDR, B, en 2002. En el hospital de Dhaka, muestras de heces son recogidos de forma rutinaria cada 50 ª paciente y Matlab en el hospital, todos los pacientes con diarrea presenta una muestra de heces para la realización de pruebas.

Detección de antígeno de rotavirus

Antígenos de Rotavirus (grupo A-proteínas específicas VP6) fueron detectados en la muestra de heces utilizando una fase sólida de tipo sándwich inmunoensayo enzimático Dakopatts el modelo de equipo comercial incorporando conejo hiperinmune antisueros en ICDDR, B, y un anti-rotavirus humano-peroxidasa de rábano conjugada (Dakopatts , Copenhague, Dinamarca), utilizando los mismos criterios para la determinación de positividad, como los utilizados por la Dakopatts kit [26].

La extracción de RNA

El QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen / Westburg, Leusden, Países Bajos) fue utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la extracción de rotavirus RNA de las muestras de heces.

RT-PCR

A la transcriptasa inversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) se llevó a cabo utilizando el Qiagen OneStep RT-PCR Kit (Qiagen / Westburg) que se describió anteriormente por Das et al. [2] y Gouvea et al. [6] para los tipos G-rotavirus (G1, G2, G3, G4 y G9), utilizando el tipo de oligonucleótidos específicos. La reacción se llevó a cabo con un primer paso en la transcripción reversa de 45 ° C durante 30 min, seguido por 35 ciclos de amplificación (30 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 50 ° C, 1 min a 72 ° C), y una Extensión final de 7 min a 72 ° C en un termociclador (Eppendorf, Hamburgo, AG). Productos PCR se ejecutan en un gel de agarosa al 2%, y teñidos con bromuro de etidio. Serie de sesiones específicas para los diferentes tamaños de los tipos G se visualizaron bajo luz UV-.

Secuenciación de nucleótidos

Los productos de amplificación de PCR se purificaron con el QIA rápido PCR purification kit (Qiagen / Westburg), y la secuencia en los dos sentidos usando la dideoxy-la terminación de la cadena de nucleótidos método con el ABI PRISM BigDye Terminator ® Ciclo de Secuenciación de Reacción kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, California), el secuenciador automático (ABI PRISM ™ 3100). El Beg9 y End9 RT-PCR primers se utilizaron como cebadores de secuenciación.

Análisis de secuencias

El cromatograma archivos de la secuencia se inspeccionaron usando Chromas 2.2 (Technelysium, Queensland, Australia), y secuencias de consenso se prepararon utilizando SeqMan II (DNASTAR, Madison, WI). Múltiples secuencia de alineaciones se realizaron con CLUSTALX 1,81 [24]. Secuencias fueron editados manualmente en la versión 2.6.002 alineación GeneDoc editor [18].

Secuencia de presentación

La secuencia de nucleótidos de datos fueron depositados en GenBank utilizando el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, Bethesda, MD) Sequin 5,15 herramienta de presentación en virtud de la adhesión http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/ números AY631049-AY631055.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MR llevado a cabo las pruebas de laboratorio y escribió el manuscrito; RS y GP llevado a cabo pruebas de RT-PCR; JM realizó la secuenciación experimentos; AF, KZ, RB y DS supervisó el programa de vigilancia de rotavirus y revisado críticamente el manuscrito; MVR y supervisó la TA Estudio.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por el Programa de Tecnología Sanitaria Apropiada (PATH), el número de concesión GAT 770-790-01451-SPS. ICDDR, B reconoce con gratitud el compromiso de PATH a los esfuerzos de investigación del Centro.