Virology Journal, 2005; 2: 25-25 (más artículos en esta revista)

Dos dimensiones VOPBA revela receptor de laminina (LAMR1) la interacción con los serotipos del virus del dengue 1, 2 y 3

BioMed Central
Phaik Hooi Tio (phtio@yahoo.com) [1], Wan Wui Jong (ww_jong@yahoo.com) [1], Mary Jane Cardosa (janecardosa@yahoo.co.uk) [1]
[1] Institute of Health and Community Medicine, Universiti Malaysia Sarawak, 94300 Kota Samarahan, Sarawak, Malaysia

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Resumen
Antecedentes

La búsqueda de los receptores de los virus del dengue ha generado muchos candidatos a menudo identificadas únicamente por el peso molecular. La amplia gama de huéspedes de los virus in vitro en combinación con múltiples enfoques para la identificación de los receptores de la (s) ha llevado a la idea de que muchos receptores de las proteínas o archivo adjunto puede ser que se trate y los diferentes serotipos del virus del dengue pueden utilizar diferentes receptores de las mismas celdas que Así como sobre los diferentes tipos de células.

Resultados

En este estudio se utilizó la extracción secuencial de PS Clon D monocapas de células con el detergente β-octylglucopyranoside seguida de sodio deoxycholate para preparar una membrana de la célula fracción rica. A continuación, utiliza 2 dimensiones (2D) electroforesis en gel para separar las proteínas de membrana y aplicado un virus modificado de superposición de unión a proteínas de ensayo (VOPBA) para demostrar que el virus de los serotipos del dengue 1, 2 y 3 de interactuar con todos los 37 kDa kDa/67 receptor de laminina ( LAMR1), la cual no integrina proteína de superficie en muchos tipos de células.

Conclusión

Por lo menos 3 de los 4 serotipos de dengue interactuar con los 37 kDa kDa/67 receptor de laminina, LAMR1, que puede ser un jugador de virus dengue en la superficie celular interacción.

Antecedentes

El virus del dengue se han convertido en reconocido como de importancia a nivel mundial patógenos que causan fiebre hemorrágica de dengue no sólo en el Sudeste de Asia, sino también en América del Sur y Central y en el Caribe. [1, 2]. Hay 4 estrechamente relacionados con los virus del dengue denominado DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4 [3]. Son virus de mosquitos con un solo sentido positivo varados genoma ARN alrededor de 11 kilobases de longitud, y son capaces de infectar tanto de mosquitos y humanos anfitriones. Una amplia gama de tipos de células de varias especies es susceptible a la infección con el virus del dengue in vitro. Numerosos estudios han tratado de identificar los receptores de la superficie celular o de los receptores utilizados por el virus del dengue para ganar entrada en las células susceptibles, pero utilizando diferentes enfoques múltiples líneas celulares y diferentes cepas de virus de dengue han generado muchos candidatos DENV interactúan las proteínas identificadas, en algunos casos, sólo por molecular Masa [4 - 11]. Heparán sulfatos [12] y de la C-lectinas tipo DC-SIGN y L-SIGN se han indicado para mediar en la infección por virus del dengue [13] y, más recientemente, los estudios utilizando un estándar de superposición de unión a proteínas del virus de ensayo (VOPBA) han sugerido que en El hígado línea celular HepG2, DENV diferentes serotipos utilizar diferentes moléculas de superficie celular [14]. Más concretamente, los métodos de espectrometría de masas se han utilizado para identificar las bandas reactivas usando VOPBA y se ha sugerido que DENV-2 interactúa con GRP78 [15] mientras DENV-1 interactúa con los 37 kDa kDa/67 receptor de alta afinidad de laminina [16].

En un nivel VOPBA, complejo de proteínas preparativos están separados de acuerdo a la masa molecular en una sola dimensión y trasladado a las membranas que se probaron con el antígeno del virus [17, 18]. Cuando se utilizan mezclas complejas a menudo hay muchos compañeros de la migración de las proteínas que no pueden ser resueltos de manera adecuada para una adecuada interpretación de los datos de espectrometría de masas sola dimensión cuando las separaciones se utilizan. Hemos utilizado dos dimensiones (2D) electroforesis en gel [19] para la separación de la membrana celular preparativos. Después de electrotransfer de 2D-gel para separar las proteínas de membranas de nitrocelulosa, que probaron las membranas con diferentes preparaciones de antígeno del virus de dengue. 2D VOPBA Este enfoque ha facilitado la separación de múltiples proteínas de masa molecular similar a lo largo de un gradiente de pH. Reactiva spots recuperados utilizando este método se identificaron compañero en 2D utilizando geles matriz asistida por láser de ionización-desorción tiempo de vuelo de la espectrometría de masas (MALDI TOF MS) [20]. Un diagrama esquemático de nuestro diseño experimental se muestra en la figura 1. Sobre la base de nuestros conocimientos, esta es la primera descripción de la utilización de 2D VOPBA para la identificación de las proteínas que interactúan con flaviviruses.

Resultados
Identificación de los puntos de referencia de proteínas en extractos de detergente PS Clon D monocapa celular

La proteómica perfil del 1% de sodio deoxycholate (NaDOC) de las proteínas solubles PS Clon D monocapas de células se muestra en la figura 2 bis. Muchos sitios fueron vistos y es necesario tratar de fraccionar los componentes de la monocapa celular por tratamiento secuencial con 1% de octilo β-glucopyranoside (β OG), seguido de 1% NaDOC. Beta-octil glucopyranoside proteínas solubles y post-β-OG residual NaDOC extrajeron las proteínas fueron resueltas por separado en geles de 2D. Las principales manchas de proteínas fueron recogidos y sometidos a la tripsina en la digestión-gel seguida de MALDI-TOF MS. Se encontró que la β OG extraer contenidos tanto citoplásmica así como algunas proteínas de membrana mientras que el post-β OG residual NaDOC extracto figuran principalmente núcleo citoesqueleto y proteínas asociadas. Figuras 2b y 2c muestran algunos de los principales puntos y utilizado como la identificación de características cuando se comparan superposiciones de Ponceau S manchadas con blots VOPBA desarrollado blots. En la figura 2b muestra la separación de extractos β OG, BiP o GRP78 fue destacado como fue calreticulin, alfa enolasa, HSP70, PDI y actina. Manchas en círculos se reactiva en el 2D VOPBAs describe más adelante y se muestran aquí para proporcionar la proteína paisaje en el que estas proteínas existen reactivos. En la figura 2c, que muestra la separación de β-OG-insoluble NaDOC extrajeron las proteínas, BiP/GRP78 fue menos destacado pero nucleophosmin y vimentina fueron muy prominentes. Una vez más el círculo manchas marca las posiciones de puntos VOPBA-reactiva, que muestra la ubicación de estas proteínas de muy escasa en el paisaje de la proteína mucho más abundantes manchas.

2D VOPBA de β-glucopyranoside extracto de octilo

2D gel blots de β OG PS Clon D extrajeron células se probaron con un cóctel de antígenos preparados a partir del 4 de diferentes serotipos de dengue virus cultivados en células de mosquito C6/36. Encuadernación dotación de proteínas (S) se detectó utilizando el anticuerpo monoclonal 4G2, un flavivirus-reactivas de anticuerpos anti-E [21]. Replicar blots También se probaron con los distintos serotipos de dengue por separado. Preparados a partir de antígenos de las células no infectadas de mosquitos se utilizaron como controles negativos con el fin de identificar el dengue no específicas interacciones presente en todos los blots. Estos blots se muestran en la figura 3. En el 2D VOPBA blots probaron con un antígeno de virus dengue o de cóctel, 2 reactiva se observaron manchas. El blots determinada con dengue cóctel, DENV-1, DENV-2 y DENV-3 había idéntico reactividades. El principal punto que es claramente reacción fue de alrededor de 45 kD en masa molecular con un pI de 4-5. A más débiles, menos obvia reacción fue visto con un lugar en 50-60 kD y una proporción ligeramente superior pI de alrededor de 5. MALDI-TOF MS-péptido generado masa huellas digitales identificadas estas manchas como 37 kDa kDa/67 laminina o de la proteína de unión del receptor de laminina (LAMR1), y un dominio SH3 que contienen proteínas, Hip 55, respectivamente. La mancha determinada con DENV-4 no mostró reactividad con LAMR1 pero hubo una débil reacción con Hip 55. Por otra parte, una reacción claramente par de puntos identificados como proteína p47 (cofactor de NSFL1/p97) fue visto en el DENV-4 VOPBA.

2D VOPBA de sodio deoxycholate extracto de células previamente extraídas de octilo con β-glucopyranoside

Residual de la proteína PS Clon D tratados con células β OG se NaDOC y tratados con el extracto resultante se utilizó para preparar 2D gel blots. VOPBAs se realizaron al anterior y en el gráfico 4 muestra la persona VOPBA blots. Al igual que con el extracto de β-OG, LAMR1 se encontró que se reactiva en VOPBA blots determinada con dengue cóctel, DENV-1, DENV-2 y DENV-3, pero no DENV-4. En cambio, el DENV-4-probaron blot mostró una clara reacción con una proteína de masa molecular superior y superior que pI LAMR1. Esta proteína fue identificada que se lamina B1, una proteína de membrana nuclear.

MALDI TOF MS

Péptido masa huellas digitales se obtuvieron usando DE Voyager STR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) y la masa se presentaron listas para la búsqueda de proteínas en contra de la base de datos NCBI (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE.UU.), utilizando el motor de búsqueda MASCOT [ 22]. Spectra y sus correspondientes listas de masa generados por el análisis de los compendios tríptico se ofrecen como archivos adicionales 1, 2, 3, 4, 5.

Inmunoblot confirmación de LAMR1 y lamina B1 manchas en 2D gel blots

El NaDOC proteínas solubles de β OG PS Clon D extrajeron células se utilizaron para preparar 2D gel blots y estos se probaron con anticuerpos específicos para LAMR1 lamina y B1. Figura 5a muestra una Ponceau S manchadas blot y la reacción antígeno de virus dengue son manchas en círculos. La ubicación de la tinción de anticuerpos específicos para LAMR1 lamina y B1 en el 2D blots fueron confirmados para estar en las posiciones de los puntos identificados por MALDI TOF MS como LAMR1 y lamina B1 (figuras 5b y 5c].

LAMR1 se expresa en la superficie de las células PS Clon D

Clon D PS Cuando las células fueron fijadas con paraformaldehido LAMR1 tinción se observó en la superficie de las células. En consonancia con las observaciones sobre los de Hoog y compañeros de trabajo [23] encontramos que las células individuales en los bordes de la monocapa se muestra constantemente brillantes fluorescentes parches en la superficie de células que muestran altos niveles de expresión de LAMR1. En los centros de las monocapas de células donde se inhibió de contacto, LAMR1 tinción fue más silenciado y más distribuida uniformemente a lo largo de las células (véase el gráfico 6].

Discusión

La investigación de los acontecimientos de principios de la infección de células susceptibles por virus del dengue es importante en la búsqueda de comprender la capacidad de este grupo de mosquitos virus para infectar los insectos y células de mamíferos y, sin embargo, parecen tener un tropismo restringido de tejidos en el huésped humano . Determinación de la naturaleza de las primeras interacciones de los virus que infectan con moléculas en la superficie de células susceptibles prevé la posibilidad de que este conocimiento puede conducir al desarrollo de los agentes terapéuticos que pueden utilizarse para inhibir la infección por el virus. La laminina receptor ya ha sido descrito como un receptor de DENV-1 por única dimensión VOPBA seguido por MS / MS [16]. Los resultados de la MASCOT [22] búsqueda presentaban múltiples golpes en este estudio, lo que indica varias posibilidades, incluida la ATP sintasa cadena β, β actina y la laminina receptor, pero los autores seleccionados la puntuación más baja del receptor de laminina para proseguir la investigación. Esta era una opción razonable ya que esta molécula ha sido identificada como un receptor para el alphaviruses virus Sindbis [24] y el virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) [25] y el flavivirus la encefalitis transmitida por garrapatas virus (TBEV) [26].

En nuestro estudio, 2D VOPBA se utilizó para eliminar el problema de la co-migración de las bandas en una sola dimensión y la masa lista generada a partir de la digestión de la tripsina, el más relevante reactiva lugar acudieron numerosos éxitos lista inequívocamente la misma proteína, conocida como proteína de diversas 40 KD, laminina de la proteína de unión, 34/67 kDa receptor de laminina, laminina receptor 1, LAMR1, Lamr1 proteína, 67 kDa receptor de laminina, proteína ribosómica 40S SA, y así sucesivamente. Contrariamente a anteriores sugerencias que LAMR1 es un DENV-1 receptor específico [14, 16], en nuestras manos, DENV-1, DENV-2 y DENV-3 se muestran todos de interactuar con la misma molécula LAMR1 aunque DENV-4 no . Por lo tanto, es probable que en el PS para clonar células D que hemos estudiado, por lo menos 3 de los 4 diferentes serotipos de dengue utilizar la misma proteína de superficie para obtener la entrada a las células. En nuestro estudio también no halló pruebas de DENV-2 vinculante a BiP/GRP78 como se ha demostrado utilizando única dimensión VOPBA [15].

LAMR1 es una organización no interactúan con los receptores de la integrina la matriz extracelular. Se acepta en general que los 37 kDa forma es el precursor de los 67 kDa forma, aunque todavía no es claro cómo se produce esta transición. Hemos utilizado una venta en el comercio de anticuerpos policlonales de conejo planteado contra una proteína recombinante que corresponde a los aminoácidos 110-250 de LAMR1 humanos para mostrar que esta proteína se encuentra en parches en la superficie de las células PS clon D que no están en contacto con inhibió in vitro. Esta distribución de LAMR1 es coherente con las conclusiones de Donaldson et al [27], y, por lo tanto, es posible que LAMR1 puede ser utilizado como un receptor por el virus del dengue. Otros grupos que ya han demostrado LAMR1 funcional es un receptor para el virus Sindbis, VEEV, TBEV y DENV1 [16, 24 - 26]. No hemos incluido los estudios funcionales en el presente trabajo, ya que este estudio pretende ser un estudio exploratorio del virus dengue que interactúan las proteínas en las células PS Clon D 2D VOPBA utilizando como herramienta el interrogatorio. No cabe duda de que el tratamiento de los extractos de células limita la capacidad de este método para identificar las interacciones depende de las estructuras conformacionales, sin embargo, nos las arreglamos para identificar LAMR1 que confirma observaciones anteriores por otros investigadores [27]. Además, hemos demostrado que LAMR1 interacción no se limita a DENV-1 solamente, sino que DENV-2 y DENV-3 también interactuar con LAMR1 y que este puede ser un receptor para el virus de dengue entrada en las células.

Muchos integrinas se ha demostrado que funcionan como receptores de distintos virus, por ejemplo, la α6 integrinas mediar entre el virus del papiloma humano [28], β3 integrinas media de células entrada por hantavirus. [29], la integrina α2β1 es un receptor humano para echovirus 1. [30 , 31], α5β1 integrina se une parvovirus humano B19 [32], y α2β1 α x β2 mediar la infección por rotavirus [33] y α v β3 es el receptor de los flavivirus el Virus del Nilo Occidental (VNO). [34]. Muchos de los virus se sabe que infectan a las células a través de un proceso en el que participan múltiples unión a la superficie de la célula seguido de la internalización, a menudo a través de la interacción con más de una molécula de superficie. Fuera-en unión de integrinas también conduce a la transducción de señales, y esta activación funcional se ha demostrado que sea necesario para la internalización como en el ejemplo de parvovirus humano B19. En el caso de adenovirus, la integrina agrupación debido a los receptores vinculante inicia la señalización necesaria para la internalización de los acontecimientos [35]. El descubrimiento de que DENV-1, DENV-2 y DENV-3 interactúan con el receptor de laminina es, pues, coherente con este creciente cuerpo de trabajo que describe la utilización de los virus de la matriz extracelular de proteínas de receptores para ganar entrada en las células.

En este estudio también se han identificado virus dengue sobre la interacción proteína actina con una proteína de unión Hip55, que se ha mostrado de participar en endocitosis, transporte vesicular y transducción de señales [36]. Hip55 también ha demostrado interactuar con CD2v de proteína del virus de la peste porcina africana (ASFV) y colocalizes a zonas aledañas a las fábricas perinuclear virus en las células infectadas ASFV [37]. El papel de Hip55 en el ciclo de vida del virus dengue debe investigarse más a fondo.

En nuestros preparativos de antígenos del virus del dengue, DENV-4 antígeno había reactividad a los más débiles en el ELISA (datos no presentados), sugiriendo una titre de antígeno que los otros serotipos 3, pero el DENV-4 2D VOPBA no muestran un patrón diferente reactividad, recogiendo Lamina B1 a cabo en lugar de LAMR1. Lamin B1 no es una proteína de membrana plasmática, pero es parte de la membrana nuclear [38, 39] y por lo tanto es poco probable que sea una alternativa para los receptores de DENV-4. La importancia de la reacción de DENV-4 con lamina sobre de proteína B1 no está clara y será objeto de nuevos estudios. También es interesante el hecho de que DENV-4 dotación también reaccionó con otra proteína implicada en el transporte de vesículas de membrana y la meta de fusión, la proteína p47 cofactor de NSFL1/p97 [40]. La similitud de la función de la proteína p47 con el de Hip 55, que se reactiva con los 4 serotipos de dengue, sugiere que DENV-4 pueden utilizar una vía diferente que DENV-1, DENV-2 y DENV-3 en el curso de la infección De una celda en particular.

Conclusión

Bidimensionales VOPBA se utiliza para identificar proteínas de membrana celular que interactúan con envoltura de proteína del virus del dengue. Este enfoque identificado varios interactors incluidos LAMR1, no integrina laminina proteína de unión, que ha sido sugerido como un receptor de DENV-1, pero no otros serotipos del virus del dengue. Uso de las herramientas más rigurosa, hemos demostrado claramente que no sólo LAMR1 interactúa con DENV-1, sino también con DENV-2 y DENV-3. Además, hemos demostrado que la envoltura de proteína del virus de dengue de los 4 serotipos también interactúa con una proteína de unión de actina y Hip55 que DENV-4 difiere de los otros tres serotipos del virus del dengue en el sentido de que la dotación de proteína interactúa con lamina B1 y p47 y no interacciona con LAMR1.

Métodos
Preparación de antígenos del virus

4 El prototipo de los virus de dengue se utilizaron en este estudio. Todos los virus se propagan en células de Aedes albopictus C6/36 Leibovitz crecido en 15 medios de comunicación suplementada con 5% inactivado por calor suero fetal de ternera, los antibióticos y el 10% de caldo de triptosa fosfato. Los antígenos fueron preparados inoculando monocapas de células C6/36 con los diferentes serotipos DENV como se describe anteriormente [41], y recogidos en la formación de sincitio fue extensa. Cultivo de células de los líquidos fueron aclarados por centrifugación antes de su uso. Preparado a partir de los fluidos de manera similar simulacros de las células infectadas C6/36 se utilizaron como controles negativos antígeno.

Preparación de la membrana celular y extractos

Recién confluente frascos de la línea celular de riñón porcino PS Clon D se utilizaron en la preparación de los extractos de detergente para la separación por electroforesis en gel de 2D. Monocapas se lavaron dos veces con buffer fosfato salino (PBS), antes de someter a tratamiento con 1% de octilo β-glucopyranoside (β OG) en una hipertonía del buffer que contiene 10 mM HEPES, 1,5 mM de MgCl 2, 5 mM KCl y un cóctel inhibidor de la proteasa (Boehringer Mannheim GmbH, Alemania), pH 7,5 mecedora a 4 ° C por 1 hora. La solución fue removido y designado β-OG extracto.

El resto de las membranas, citoesqueleto y núcleos fueron lavados durante 1 hora a 4 ° C con una solución que contiene 2% CHAPS en el mismo buffer, tal como se describe más arriba. La solución resultante fue descartado y el material residual solubilizados por mecedora a 4 ° C durante 1 hora en la solución tampón que contiene por encima de un 1% de sodio deoxycholate (NaDOC). La solución resultante fue removido y designado β-OG-insoluble NaDOC extracto.

Todos los extractos fueron hilar en un microfuge a 14000 rpm durante 10 minutos, y los sobrenadantes almacenados a -20 ° C hasta su uso.

Preparación de la muestra para el gel de electroforesis 2D

Todas las muestras se prepararon para 2D mediante electroforesis en gel de la Listo Prep 2-D Kit de Limpieza (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante.

Electroforesis en gel de 2D

Proteína pellets fueron resolubilized en IPG franja solución de rehidratación (8 M urea, 2% CHAPS, 40 mM TDT, el 0,5% de amortiguación pH3 IPG-10, azul de bromofenol) a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego hilar en un microfuge a 14000 rpm durante 10 Min. 125 ul del sobrenadante resultante se utilizó para cada tira IPG (ReadyStrips pH 3-10, 7 cm, BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) y la rehidratación se logró en el 50 uA durante 15 horas a 20 ° C utilizando el sistema IPGphor IEF (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). IEF Posteriormente se llevó a cabo durante 30 minutos a 500 V, 30 minutos a 1000 V y 2 a 2,5 horas en 8000 V con un paso-y celebrar-gradiente hasta un total de 8500 horas-voltios que se había logrado.

IPG tiras fueron lavadas con agua destilada y luego por balanceo equilibrado durante 20 minutos a temperatura ambiente en equilibrio SDS buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,8, 6 M urea, el 30% de glicerol, 2% SDS), que contiene 10 mg / ml TDT , Permitiendo por lo menos 5 ml de buffer por banda.

Tiras fueron lavadas con agua destilada y se coloca en la parte superior de la segunda dimensión de gel que es un 10% SDS gel de poliacrilamida polimerizado noche a la mañana. Marcadores de peso molecular se aplicaron en pequeños trozos de papel de cromatografía y se incluirán junto a cada franja en la parte superior de cada gel, después de que las láminas y los marcadores fueron sellados con el 0,7% de agarosa en 0,125 M Tris-HCl pH 6,8. La segunda dimensión de la separación de proteínas de masa molecular se logró en una constante de 140 V (Mini proteiforme 3, BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.).

Electrotransfer geles de 2D a nitrocelulosa

El Hoefer TE serie Transfor Unidad de Electroforesis (Hoefer instrumentos científicos, San Francisco, CA, EE.UU.) se utilizó para electrotransfer proteínas 2D de geles a membranas de nitrocelulosa a 200 mA durante 1 hora en hielo frío Towbin buffer (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% de metanol). Nitrocelulosa blots fueron teñidas utilizando Ponceau S. Un registro de las posiciones de las manchas visibles de proteína en cada mancha se realizó mediante el escaneo de la Ponceau S probaron blot utilizando ImageScanner (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y el software ImageMaster Labscan v3.00 (Amersham Biosciences, UK). Tras la digitalización, la Ponceau S fue despojado por el lavado en agua y luego se la acaba bloqueado por mecedora durante 1 hora en PBS que contenía 5% de leche desnatada.

Unión a proteínas del virus de la superposición de ensayo (VOPBA)

El 2D blots se incubaron durante la noche con mecedora a temperatura ambiente con aclaró antígeno preparativos y simulacros de infectados controles. Los blots fueron lavados con PBS y se incubaron con el anti-flavivirus anticuerpo monoclonal 4G2 otro en la noche a la mañana de incubación a temperatura ambiente. Después de un lavado con PBS, la blots fueron incubadas con conejo anti-ratón-HRP Ig (DAKO, Glostrup, Dinamarca) en la dilución 1:1000 en el 5% de la leche desnatada en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Los blots fueron lavadas con PBS y reactive protein spots se visualizan mediante el desarrollo con el sustrato cromogénico, 4-chloro-1-naphthol/hydrogen peróxido. Reacción fue detenido después de 1 hora por un lavado con agua. Las membranas fueron digitalizadas y en comparación con el Ponceau S imágenes previamente escaneadas usando Adobe Photoshop LE versión 5,0 (Adobe Systems Inc, San Jose, CA, EE.UU.).

En tripsina-gel digestión y análisis por MALDI-TOF MS

Reactiva spots visto en la blots fueron identificados en la Ponceau S exploraciones que se habían registrado anteriormente y de los correspondientes anuncios en la coomassie azul manchado de gel fueron recogidos y almacenados en UHQ en 0,5 ml de agua microfuge tubos a 4 ° C. Durante todos los pasos en el proceso de la digestión de amortiguación utilizada fue de 5 mM NH 4 HCO 3. Gel spots fueron destained con un 50% de metanol grado HPLC. Destained spots fueron deshidratados con acetonitrilo durante 10 minutos antes de la incubación con 10 mM DTT durante 50 minutos a 55 ° C. Esto fue seguido de incubación con 55 mM iodoacetamide (AIA) durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Los anuncios fueron lavados dos veces con tampón durante 20 minutos cada vez, con acetonitrilo deshidratados durante 10 minutos y rehidratada con amortiguación. Por último, el gel spots fueron deshidratados con acetonitrilo dos veces durante 10 minutos cada vez y se seca completamente mediante centrifugación al vacío (ADN DNA110 Speed-Vac, Savant Instruments Inc, Farmingdale, NY, EE.UU.) durante 10 minutos. Cada lugar de gel se reswelled en 5 ul de 12,5 ng / ul secuenciación grado de tripsina (Promega, Madison, WI, EE.UU.) en 5 mM NH 4 HCO 3 durante 45 minutos en hielo. El exceso de solución de tripsina fue eliminado, las manchas fueron cubiertos en 5 ul de amortiguación y la digestión se le permitió proceder a 37 ° C durante la noche. Digests se almacenaron a -20 ° C hasta el análisis.

Análisis por MALDI-TOF MS

Por MALDI análisis, resúmenes fueron descongelados, hilar en un microfuge a 14000 rpm durante 10 minutos. Una ul del sobrenadante se mezclan en una proporción de 1:1 con una dilución de 1:10 saturados α-cyano-4-hydroxycinnamic ácido (ACCA) en la matriz de ácido trifluoroacético 0,25%, el 50% de acetonitrilo, 50% de agua. Esta mezcla fue avistada en placas MALDI objetivo y espectros fueron adquiridos utilizando Voyager STR-DE Biospectrometry de trabajo (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Péptido masa listas se presentaron para la búsqueda contra la base de datos NCBI (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE.UU.), utilizando el motor de búsqueda MASCOT (Matrix Science, Londres, Reino Unido). No se establecen limitaciones para las especies, pero carbamiodomethylation de residuos de cisteína y la posible perdida de fisuras fueron incluidos.

Inmunomarcación de 2D gel blots

El 2D blots fueron incubadas con antisueros policlonales de conejo contra LAMR1 y Lamin B1 diluido 1:200 en PBS con el 5% de la leche desnatada a temperatura ambiente, la noche a la mañana con la mecedora. Después de un prolongado lavado con PBS, el obligado se detectaron con anticuerpos anti Ig de conejo conjugado con peroxidasa de rábano, y visualizados utilizando el sustrato cromogénico de peróxido de 4-chloro-1-naphthol/hydrogen como se ha descrito anteriormente. Antisueros se obtuvieron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.).

Tinción de la superficie de las células y photomicrography

Las células se resuspendió en el 1 × 10 5 células por ml en Leibovitz 15 medios de comunicación que contiene un 3% inactivado por calor suero fetal de ternera, los antibióticos y el caldo de triptosa fosfato. Resuspendido células se entregaron en 25 ul volúmenes a los distintos pozos de multitest diapositivas (Erie Co Ciencia, Portsmouth, NH, EE.UU.) y se permite que se adhieran noche a la mañana en un cuadro de húmedo a 37 ° C. Las células fueron lavadas en PBS y fija con 3,7% paraformaldehye en PBS a pH 7,4 durante 15 minutos seguido por un cambio a un 2% paraformaldehido en PBS a pH 8,5 para otros 15 minutos. Después de lavado en PBS diapositivas aire se seca y se almacena a -20 ° C hasta su uso.

Antes de la tinción, diapositivas fueron incubadas en 50 mM de cloruro de amonio en PBS durante 5 minutos, se lavan a fondo y bloqueado en el 1% de suero fetal de ternera en PBS por 30 minutos. Inmunofluorescencia tinción de la superficie de las células se ha logrado mediante la incubación durante 1 hora con antisueros policlonales de conejo contra LAMR1 en la dilución 1:25 en PBS con 1% de suero fetal de ternera. Después de un lavado con PBS las células fueron incubadas con anticuerpos anti Ig de conejo conjugado con Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.) a 1:1000 dilución durante 30 minutos después de un lavado con PBS. DAPI se utilizó para counterstain núcleos. Las láminas fueron vistos usando un Axiovert 200 (Zeiss, Alemania) con filtro de conjuntos apropiados para FITC y DAPI.

Photomicrography se logró mediante un CCD enfriado monocromo 12 bits cámara Evolución QEi y 5,0 Image-Pro software (Media Inc Cibernética, Canadá) se utiliza para la preparación de compuestos de imágenes de fluorescencia con pseudocolor. Adobe Photoshop versión 5,0 LE se utilizó para componer y presentar la figura de collage.

Conflicto de intereses

El autor (s) de no declarar los intereses en competencia en relación a este trabajo.

Contribuciones de los autores

PHT y WWJ realizó la proteómica trabajo, MJC y PHT preparado la virología y los reactivos de inmunofluorescencia. Todos los autores contribuyeron al análisis y la redacción del documento.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Spectra adquiridos con masa lista presentada para la búsqueda
Imagen de los espectros obtenidos por MALDI-TOF para el terreno de las 2D gel de β OG extractos identificados como LAMR1.
Archivo Adicional 2
Spectra adquiridos con masa lista presentada para la búsqueda
Imagen de los espectros obtenidos por MALDI-TOF para el terreno de las 2D gel de extractos NaDOC identificados como LAMR1.
Archivo Adicional 3
Spectra adquiridos con masa lista presentada para la búsqueda
Imagen de los espectros obtenidos por MALDI-TOF para el terreno identificado como lamina B1.
Archivo Adicional 4
Spectra adquiridos con masa lista presentada para la búsqueda
Imagen de los espectros obtenidos por MALDI-TOF para el terreno identificado como Hip 55.
Archivo Adicional 5
Spectra adquiridos con masa lista presentada para la búsqueda
Imagen de los espectros obtenidos por MALDI-TOF para el terreno identificado como proteína p47.
Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en parte por Venture Technologies Sdn Bhd y por la Universidad de Sarawak, Malasia.