Análisis de la CCR3 promotor revela una región de reglamentación en el exón 1 que se une GATA-1

CCR3, eotaxinas el receptor, es el principal receptor de quimioquinas expresadas en los eosinófilos, basófilos y una subpoblación de linfocitos Th2 [1 - 10]. Recientemente, CCR3 ha demostrado ser upregulated sobre monocytoid U937 neutrófilos y células in vitro por los interferones y que se manifestó por las células endoteliales, células epiteliales y mastocitos [11 - 16]. La relevancia de estos hallazgos y de la función de CCR3 leucocitos en la no aún no se han dilucidado, ya que la única células que se acumulan constantemente siguientes eotaxinas administración in vivo son células mieloides (principalmente los eosinófilos) [17 - 20].

Hasta la fecha, el ARNm completo de la organización genómica y sólo un número limitado de receptores de quimioquinas se ha descrito [21 - 26]. Estos estudios han demostrado que el 5 'no traducidas región (5'UTR) pueden ser complejas y contener hasta 11 exones como en el gen CXCR2. Como resultado de ello, la transcripción y splicing alternativo dirigido por varios promotores puedan dar lugar a la variable mRNA isoformas. La función de estos 5 'sin traducir exones no ha sido examinado a excepción de un único estudio se centró en CCR2, demostrando una función transcripcional para el exón 1 [24]. Anteriormente hemos caracterizado a la estructura genómica y promotor de la función de genes humanos CCR3 [27]. El CCR3 gen contiene al menos 4 exones que dan lugar a múltiples especies de mRNA splicing alternativo. Los primeros 1,6 kb de los 5 'de acompañamiento región del exón 1 con un fuerte promotor en la actividad eosinofílica, linfoide y líneas de células del epitelio respiratorio. Supresión análisis reveló la regulación diferencial de la CCR3 promotor en eosinofílica y líneas de células epiteliales que sugiere la presencia de elementos específicos de linaje. Curiosamente, el exón 1 aumento de la actividad del promotor. Desde nuestra caracterización inicial, otros dos grupos han estudiado el CCR3 promotor [28, 29], sin embargo, sus estudios se centraron en linfocítica y monocitos líneas de células, respectivamente, en lugar de los eosinófilos. Scotet et al. [29] demostraron que el ser humano CCR3 promotor es activo in vitro en líneas celulares linfocítica. También demuestran una función para la remodelación de la cromatina en la regulación de la expresión de CCR3 células Th2. Vijh et al. [28] demostraron que el ser humano CCR3 promotor es activo en líneas celulares de monocitos y definió el promotor mínimo que consiste en un elemento promotor abajo (DPE), un elemento común en Drosophila los genes, pero raro en los genes humanos. Este elemento es aguas arriba (50 bp), el exón 1 de la secuencia estudiada en el informe actual.

Se ha informado de que 5 'sin traducir exones, intrones y, en ocasiones, pueden regular la expresión de los genes de dos formas diferentes. Una secuencia sin traducir puede actuar como un tejido-específico regulador de la traducción. Un ejemplo notable es la hormona liberadora de gonadotropina gen que se transcribe en múltiples tejidos, pero que no pueden ser traducidos debido a la falta de remoción intrón específicos [30]. Por otra parte, las regiones no traducidas (UTR) puede facilitar la transcripción de un gen. Ejemplos: una GATA-1 en el sitio 5'-UTR de los genes de globina-γ, una HNF-1 sitio en el gen del plasminógeno y un C / EBP en el sitio CCR2 genes [24, 31, 32]. Si bien el mecanismo de acción no está completamente claro, se piensa que los factores de transcripción vinculante a afectar a las regiones no traducidas de la transcripción de genes a través de interacciones con el complejo de la transcripción del RNA. El papel de los exones no traducidos en el CCR3 gen no se ha estudiado. En este informe, la ADNasa I hipersensibilidad hipersensible identificado un gran sitio ubicado en las cercanías de sin traducir el exón 1. Además, el factor de transcripción GATA-1 se muestra de obligar a que el exón 1 sin traducir, lo que sugiere un posible mecanismo para la regulación de la transcripción por CCR3 este exón. Finalmente, utilizando un enfoque de transgénicos, que demuestran que el 1,6 kb 5 'de acompañamiento de la región CCR3 (incluido el exón 1) ha promotor actividad in vivo in vivo.

El objetivo de definir las regiones reguladoras de genes en el CCR3 por un gen en toda búsqueda. Por lo tanto, hemos realizado DNasa I de hipersensibilidad CCR3 eosinófilos humanos en la enseñanza primaria. La totalidad de los 24 kb CCR3 genes fueron seleccionados para la ADNasa I hipersensibilidad utilizando sondas específicas para Eco RI y Hind III fragmentos (Figura 1A y datos no presentados). Sólo un hipersensible sitio se señaló, lo que fue en la zona del exón 1 (Figura 1B]. Se obtuvieron resultados similares, con núcleos de la línea celular AML14.3D10 eosinofílica (datos no presentados). Esta línea celular no expresa CCR3 menos inducida con ácido butírico y IL-5, lo que sugiere que la remodelación de la cromatina en el sitio HS1 precede CCR3 transcripción. Por lo tanto, nuestro análisis reveló zonas de la remodelación de la cromatina activa en la vecindad de exón 1 lo que sugiere que esta zona puede ser importante para CCR3 transcripción.

DNasa I hipersensibilidad indicó que una región en consonancia con el exón 1 se activa en CCR3 transcripción. Junto con nuestros datos anteriores que muestran que sin traducir el exón 1 tiene un papel importante en CCR3 transcripción [27], la hipótesis de que se unen a las proteínas nucleares exón 1, y, a su vez, regulan la transcripción de CCR3. Con el fin de probar esta hipótesis, un doble varados oligonucleótido sonda que corresponde a +10 a +60 pb del gen CCR3 se preparó, denominado E1-FL (exón 1 - longitud completa, la Figura 2A]. Esta es la secuencia exacta que se ha eliminado en la CCR3 (-exon1). Plásmido pGL3 que demostró disminución de la actividad en comparación con la longitud completa 1,6 kb construir [27]. Nuclear AML14.3D10 extractos de las células fueron incubadas con la sonda y se resolvieron en un gel de poliacrilamida. Dos bandas fueron visibles (Figura 2B]. La banda superior se eliminó cuando 150x molar exceso de la sonda se utilizó no etiquetados (CC: E1-FL en la Figura 2B], lo que indica que esta es la banda específica. Con el fin de localizar con precisión la región responsable de factor vinculante, la superposición de frío competidores se utilizaron: E1-A que abarcan desde +10 a +31, E1-B, que abarca desde +25 a +46 C-E1 y que abarcan desde +40 a +60 . La banda específica se eliminó con E1 y E1-B-C fría competidores que indica que el factor que se une en la región entre +25 y +60 (Figura 2B]. En resumen, estos datos indican la presencia de proteínas en el núcleo de las células AML14.3D10 que unen a CCR3 el exón 1 pb entre 25 y 60.

Con el fin de definir las proteínas capaces de unirse a CCR3 exón 1, la secuencia exón 1 se analizó utilizando la disposición del público TFSEARCH motor. Este análisis indicó la presencia de ADN de consenso sitios de unión en el exón 1 región durante varios factores de transcripción (es decir, GATA, AML1, SRY, S8, etc.) GATA proteínas de la familia se han detectado en los eosinófilos (específicamente GATA-1, GATA-2 y los bajos niveles de GATA-3) [33]. Además, GATA-1 transactivates la EOS47 promotor, un promotor de eosinófilos específicos, a través de un sitio en el 5'UTR [34]. Por lo tanto, la hipótesis de que las proteínas de la familia GATA obligar a los sitios en el exón 1. Para hacer frente a la unión de las proteínas a GATA CCR3 exón 1, hemos preparado oligonucleótidos correspondientes a la sonda E1-B-C y con la GATA sitio mutado. Como se ha demostrado en la Figura 3A, en su uso como fría competidor, el mutante GATA oligonucleótido no fue capaz de interferir con la unión de los factores nucleares, ya sea a CCR3 el exón 1-B sonda E1 o E1 sonda-C. Además, hemos utilizado un consenso GATA oligonucleótido con sitios de unión para las proteínas GATA. Este oligonucleótido completamente abolido vinculante de los factores nucleares a la vez CCR3 el exón 1 sondas E1 y E1-B-C (Figura 3A]. En conjunto, estos datos indican que GATA proteínas, presentes en extractos nucleares de células AML14.3D10, son capaces de unirse a la secuencia CCR3 el exón 1.

Con el fin de delinear GATA factores que son vinculantes para el exón 1, nuclear AML14.3D10 extractos de las células fueron incubadas con el radiomarcado de larga duración CCR3 el exón 1 sonda en la presencia o ausencia de anti-GATA-1 anticuerpo. Como se ve en la Figura 3B, el GATA-1 anticuerpo fue capaz de interferir con la unión de la proteína del factor nuclear extractos de la sonda radiomarcada. Con el fin de localizar con mayor precisión a qué parte del exón 1 GATA-1 es capaz de vinculante, la superposición de las sondas de oligonucleótidos fueron incubadas y radiomarcado con extractos de AML14.3D10 nuclear de las células en presencia y ausencia del anticuerpo GATA-1. Este tratamiento eficiente inhibe la unión de las sondas E1-B-C y al factor nuclear (Figura 3C]. Estos datos indican que GATA-1, presente en extractos nucleares de células AML14.3D10, es al menos uno de los factores capaces de obligar a la CCR3 el exón 1 pb entre 25 y 60.

Anteriormente hemos caracterizado el promotor CCR3 humanos in vitro [27]. Con el fin de determinar si esta región había promotor actividad in vivo y para evaluar la especificidad de la célula, generamos ratones transgénicos que expresan el gen reportero EGFP bajo el control del promotor CCR3 (Figura 4A]. 1,6 kb del promotor y 60 pares de bases del exón 1 fueron clonados aguas arriba del gen EGFP. Siete líneas transgénicas fundador fueron identificados. Dos de las líneas fundador no ha transferido a su descendencia y una línea no mostró expresión de los transgenes que determine secante del Norte y RT-PCR (datos no presentados). En cuatro de las líneas que el nivel y el patrón de expresión de los transgenes variada sugiriendo la integración efectos de sitio. Dos de las líneas (4,1 y 4,2) que se muestran mínima expresión mRNA y no se analizaron más. En cambio, las otras dos líneas (3,1 y 3,2) mostraron alta expresión del transgén en múltiples tejidos. Línea 3,1 muestran diversos niveles de mRNA de expresión a prueba en todos los órganos: pulmones, los riñones, el yeyuno, timo, la médula ósea, bazo y, con mayor expresión en el timo (por Northern blot, la figura 4B y RT-PCR, no se muestran los datos) . Aunque la transcripción de lo que esperábamos a ser alrededor de 1 kb de tamaño (Figura 4A], dos bandas de ~ 4 y 5 kb eran evidentes. Dado que este no es el caso con otras líneas, sospechamos que es la integración de sitio específico, y otro gen puede haber sido transcritas junto con las buenas prácticas agrarias. Sin embargo, el tamaño de la RT-PCR se amplificación de fragmentos de la espera y el tamaño de la proteína fue detectable por inmunohistoquímica (véase más adelante) lo que implica que esto no afectará a la traducción de la proteína y la integridad de la epítopo para el anticuerpo. Expresión en los pulmones, yeyuno, timo y riñón fue confirmado por inmunohistoquímica anti-GFP (Figura 4C y datos no presentados). En el yeyuno, tinción estuvo presente principalmente en las células del estroma (Figura 4C]. De la nota, eosinófilos normalmente residen en el tracto gastrointestinal y se encuentran en el estroma del yeyuno. Sin embargo, en los pulmones, que normalmente carece de eosinófilos en la línea de base, se GFP expresión que se limita a la alveolar revestimiento compatible con expresión predominante en el tipo I pneumocytes (Figura 4C]. En el timo, en comparación con la tinción de anticuerpos sin primaria (datos no presentados), todos los timocitos manchadas positivos para las buenas prácticas agrarias. Además, en el riñón todas las células fueron positivas, tanto en la médula y corteza (datos no presentados). Línea 3,2 muestran un patrón diferente de la expresión de los transgenes. Del Norte blot reveló expresión en múltiples órganos con los pulmones y los riñones que expresan los niveles más altos (Figura 4B]. En consonancia con esto, la proteína fue detectada por inmunohistoquímica en niveles altos en los pulmones y los riñones y sólo marginalmente en el yeyuno (Figura 4C y datos no presentados). Aunque manchas en los pulmones es comparable a la línea de 3,1, sólo una minoría de las células del estroma y las células epiteliales no se tiñeron en el yeyuno. En el riñón, casi todas las células expresó el transgén en la médula, mientras que en la corteza tinción fue prominente en la glomérulos. No hubo anti-GFP tinción observado en ratones de tipo salvaje (Figura 4C]. No hay cambios en la expresión se encontraron cuando el transgén se cruzó con CD2.IL-5 ratones transgénicos (datos no presentados). En resumen, el 1,6 kb de los 5 'de acompañamiento de la región ha CCR3 gen promotor fuerte actividad in vivo. Sin embargo, tanto el nivel y el patrón de expresión varían entre el fundador y la falta de líneas de células especificidad. Así, la región de los identificados CCR3 promotor contiene una amplia promotor activo con hematopoyéticas y no hematopoyéticas actividad.

En este informe, la ADNasa I hipersensibilidad implicados sin traducir el exón 1 en la regulación de la transcripción CCR3. Además, nuclear eosinofílica proteínas derivadas de las células, se mostró de obligar a CCR3 exón entre nucleótidos +25 a +60. Uso de los competidores no etiquetados y anticuerpos, proteínas de la familia GATA, específicamente GATA-1, se demostró que se unen a esta región. En conjunto, estos datos sugieren que el exón 1 sin traducir, a través de GATA-1, tiene un papel regulador de la transcripción CCR3. Por último, demostrar que el 1,6-kb CCR3 elemento promotor, que incluye el exón 1, en líneas generales es activo in vivo.

HS1 El sitio fue ubicado en las cercanías del exón 1. Combinado con nuestros resultados anteriores que demuestran disminución de la actividad promotora cuando el exón 1 se suprimirá el promotor de la construcción, la base de esos datos que 5 'sin traducir el exón 1 puede tener una función reguladora. Se ha informado de que el 5 'no traducidas exones pueden contener secuencias que facilitan la transcripción del gen. Ejemplos: una GATA-1 en el sitio 5'-UTR de los genes de globina-γ, una HNF-1 sitio en el gen del plasminógeno, un sitio PU.1 en el gen PU.1 y un C / EBP en el sitio CCR2 Genes [24, 31, 32, 35]. Por lo tanto, la hipótesis de que se unen a las proteínas nucleares exón 1. Nuestro análisis de la AESM, junto con frío competidores y anticuerpos específicos, indica que las proteínas de la familia GATA, específicamente GATA-1 se unen a la CCR3 el exón 1. Así, GATA-1 vinculante para el exón 1 podrá regular CCR3 transcripción. Alternativamente, GATA-1 vinculante para el exón 1 puede afectar a la función del sitio de inicio de transcripción, la estabilidad o la traducción del ARN. Estas posibilidades se abordarán en futuros estudios.

Es importante que estos datos se ve con lo que se conoce sobre otras mieloide específicos de los promotores, que a menudo han demostrado ser difíciles de funcionar de manera independiente en vivo. Por ejemplo, usando las construcciones de 5 'de acompañamiento de la región mieloide-genes específicos no han sido útiles para el trabajo transgénicos (como el CD14 promotor [36], el promotor de c-kit [37], o el 1,7 kb CD11b promotor [38] ). Mejor éxito se obtiene cuando la totalidad de genes, en particular el marco de lectura abierta, se utiliza (por ejemplo, los humanos catepsina G, pollo y lisozima c-fps/fes construcciones transgénicas [39 - 41]]. Estas construcciones fueron por lo menos 6 kb de tamaño y contiene todos los exones e intrones y varios kb de 5 'y 3' de acompañamiento secuencia. Presumiblemente, estas construcciones más grandes figura la región de locus de control (LCR) - secuencias que tienen la capacidad de controlar la expresión de genes predominantemente, en cualquier región cromosómica. Esto a su vez permite un alto grado de coherencia entre el ratón independiente con respecto a las líneas de células especificidad, el nivel de expresión y de la proporcionalidad de número de copias de genes. Estas regiones pueden estar ubicadas en varios sitios diferentes en el gen, incluyendo intrones y exones de codificación, por lo que el cribado con DNasa I hipersensibilidad suele ser el primer método empleado para identificar estas regiones. Ratones transgénicos que expresan el gen reportero EGFP bajo el control del promotor CCR3 demostrar que el promotor 1,6 kb y 60 pb del exón 1 del gen confiere CCR3 fuerte promotor actividad in vivo. Sin embargo, estas secuencias no contienen toda la LCR, ya que la expresión del gen reportero fue variable entre los múltiples líneas fundador. DNasa I hipersensibilidad hipersensible estudios descubrió un sitio en el CCR3 locus. El HS1 sitio fue al parecer no basta para que la integración independiente de los efectos de sitio, ya que figura en el promotor de la construcción utilizada. De este modo, los futuros estudios tendrán que ampliar la búsqueda de la CCR3 LCR. Es importante señalar que la verdadera especificidad de CCR3 celular no ha sido establecida. Si bien este producto génico es a menudo considerado como específicos de las células inflamatorias implicadas en la inflamación alérgica (eosinófilos, mastocitos, y posiblemente células Th2), varios informes han documentado expresión por otros tipos de células incluyendo otros leucocitos (células dendríticas), así como Las células del tejido (epitelio y células endoteliales) [11 - 16, 42]. Por lo tanto, queda por determinar si nuestra observación de que el promotor ha CCR3 amplia actividad in vivo representa la verdadera actividad endógena.

Desde CCR3 se expresa fuertemente en los eosinófilos, el análisis de las señales que inducen su expresión puede dar una idea de los mecanismos moleculares por el compromiso de progenitores mieloides al linaje de eosinófilos. En general, se considera que son los factores de transcripción vía final común de la conducción y que la diferenciación hematopoyética compromiso de los diferentes linajes está impulsada por la expresión alternativa de combinaciones específicas de factores de transcripción [43, 44]. Aunque no de eosinófilos específicos de factores de transcripción se ha informado, de eosinófilos compromiso parece ser regulada por GATA-1, PU-1 y C / EBP proteínas [34, 45 - 48]. En consonancia con esto, sitios de unión de ADN de estos factores de transcripción se encuentran en varios de eosinófilos selectivo promotores, como el principal promotor de la proteína básica (MBP), IL-5 del receptor alfa (IL-5R α) y la cadena de cristales de Charcot-Leyden (CLC ) De proteínas. Concretamente, la sobreexpresión ectópica de GATA-1 pollo en myeloblasts lleva a transdifferentiation en eosinófilos o thromboblasts dependiendo de la dosis utilizada [47]. GATA-1 transactivates selectiva de eosinófilos varios promotores [48], incluida la aviar EOS47 promotor en el que el sitio de GATA-1 está situado aguas abajo del sitio de inicio de transcripción [34].

En resumen, en este informe hemos demostrado que: 1) los estudios de hipersensibilidad DNasa I implicar sin traducir el exón 1 en CCR3 transcripción; 2) las proteínas de la familia GATA, específicamente GATA-1, se unen a sin traducir el exón 1 en el CCR3 genes, y 3 ) El 1,6 kb 5 'de acompañamiento de la región CCR3 gen es, en términos generales como un promotor activo in vivo.

El AML14.3D10 línea celular (amablemente proporcionados por CC Paul, Dayton VA Medical Center, Dayton, OH) [49, 50], fue aumentado en RPMI 1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS, Gibco BRL), 50 μ M 2-mercaptoetanol (Sigma, St Louis, MO), 0,1 mM no aminoácidos (Gibco BRL), 1 mM piruvato sódico (Sigma), y penicilina-estreptomicina (Gibco BRL). Eosinófilos fueron aislados por anti-CD16 negativo de la selección de granulocitos preparativos de voluntarios sanos o atópica, tal como se describe anteriormente [51].

Los núcleos se derivan de las líneas celulares y células primarias poliamina utilizando un buffer que contiene sacarosa 0,34 M, el 13,3 mM Tris (pH7.5), el 53,2 mM KCl, 13,3 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,133 mM espermina, 0,5 mM espermidina , El 0,1% TritonX-100, 2 mM de MgCl ₂ y recién preparada 2-mercaptoetanol y phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF). Los núcleos fueron luego se centrifuga a 2300 g durante 30 minutos sobre un cojín de 1,2 M de sacarosa y lavada dos veces antes de la resuspensión en la ADNasa I digestión buffer (60 mM KCl, 5 mM MgCl _2, 15 mM Tris (pH7.5), 0,1 mM EGTA , 0,5 mM TDT y el 5% de glicerol). Los núcleos se resuspendió en una concentración de 2-4 × 10 ⁶ núcleos / ml y suave DNasa I digestión se llevó a cabo en un volumen de 0,2 ml de 0 a 100 unidades de DNasa I (Roche) durante 5 minutos a 30 ° C. Tras la ADNasa I tratamiento, los núcleos fueron lisadas y ADN purificado por fenol / cloroformo extracción de etanol y la precipitación. ADN fue digerido con las enzimas de restricción (Eco RI y Hind III) y electrophoresed en un gel de agarosa 0,8%. Después de la transferencia a membranas de nylon, la hibridación se realizó utilizando los métodos convencionales. Probe fragmentos fueron realizadas por PCR de ADN genómico. La figura 1 representa la estructura de genes CCR3 y fragmentos de restricción y sus correspondientes sondas que se utilizan para abarcar todo el gen.

Cultivadas de las células se lavaron dos veces con el hielo frío fosfato salina tamponada (PBS, Gibco BRL). 2,5 × 10 ⁶ células fueron lisadas en buffer de lisis [100 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N '-2-ácido ethanesulfonic (HEPES), pH 7,9, 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1,5 mM de MgCl _2, 0,2% Nonidet P -40, 1 mM dithiothreitol (TDT), y 0,5 mM PMSF], vortex brevemente a una velocidad moderada, luego incubadas en hielo durante 5 minutos. Muestra se centrifugó y el pellet fue resuspendido en el próximo 20 μ l de buffer de extracción (20 mM HEPES, pH 7,9, 420 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1,5 mM de MgCl _2, el 25% de glicerol, 1 mM TDT, y 0,5 mM PMSF), Vortex ligeramente, y se incubaron en hielo durante 15 minutos. Las muestras fueron centrifugadas para el pellet de desechos nucleares. Sobrenadantes se colocaron en tubos de silicio recubierto microcentrífuga y almacenados a -80 ° C hasta nuevo uso.

Single-stranded oligonucleótidos basados en la secuencia de sin traducir el exón 1 de la CCR3 promotor fueron sintetizados por Integrado de ADN Technologies, Inc (Coralville, IA). Una completa base de la longitud 51 par (+10 a +60) oligonucleótido (GGTACCACTGGTCTTCTTGTGCTTATCCGGGCAAGAACTTATCGAAATACA GGTACCACTGGTCTTCTTGTGCTTATCCGGGCAAGAACTTATCGAAATACA GGTACCACTGGTCTTCTTGTGCTTATCCGGGCAAGAACTTATCGAAATACA GGTACCACTGGTCTTCTTGTGCTTATCCGGGCAAGAACTTATCGAAATACA GGTACCACTGGTCTTCTTGTGCTTATCCGGGCAAGAACTTATCGAAATACA) y tres de la superposición de oligonucleótidos (+10 a +31, +25 a +46, y +40 a +60) y su inversa se complementa Producido (Figura 2]. Dos de los fragmentos que figuran superpuestas putativo GATA sitios de unión (subrayado). Dos mutantes y sus complementos que también se ha cambiado la secuencia de GATA TATC a TTGA. Esta mutación no modifica la GC contenido de los oligonucleótidos, ni tampoco crear un nuevo factor de transcripción sitio para cualquiera de los factores de transcripción representados en la disposición del público TFSEARCH motor. Cada oligonucleótido se resuspendió a una concentración de 50 μ M en buffer TE (10 mM Tris-Cl, pH 7,4, y 0,1 mM EDTA, Sigma). Complimentary solo varados oligonucleótidos fueron recocidos a una concentración de 10 mM en la enzima de la restricción de amortiguación M (10 mM Tris-Cl, 10 mM MgCl _2, 50 mM de NaCl y 1 mM dithioerythritol, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Las muestras se colocaron en un 95 ° C bloque de calor seco durante 5 minutos y, a continuación, el bloque se retiró de la unidad y permitir que se enfríe lentamente a la temperatura ambiente. El doble varados oligómeros se diluye a 1 μ M en buffer TE y 30 ng de final fueron etiquetados con ^[γ-32 P] ATP (NEN Life Science, Boston, MA) y T4 polinucleótido quinasa (Gibco BRL). Probe fue purificado más rápida Spin G-25 Sephadex columnas (Roche) y recupera en un volumen de 50 μ l.

El contenido de proteína de los extractos nucleares se determinaron por Bradford (Coomassie) ensayo (Pierce, Rockford, IL). Proteínas totales (5 μ g) se incubó en hielo durante 10 minutos con buffer 2X EMSA (24% glicerol, 0,08 μ g / ml de poli-dC, 24 mM HEPES, pH 7,9, 8 mM Tris-Cl, pH 7,9, 2 mM EDTA , 2 mM DTT, 50 mM KCl, y 10 mM MgCl _2,), y cuando esté indicado, con 150 veces el exceso de frío competidor oligonucleótido. Radiomarcado oligo sonda se añadió a cada muestra y de incubación seguido por un período adicional de 10 minutos sobre el hielo. Para los ensayos de supershift de anticuerpos, anti-GATA-1 anticuerpo (clon C20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) fue agregado después de la adición de la sonda y las muestras se incubaron en hielo durante una hora. En los experimentos de control, control de isotipo de los anticuerpos no tienen un efecto significativo. El DNA-proteína fueron resueltas de manera no desnaturalización 5% gel acrilamida [29:1 acrilamida / bis-acrilamida, 0.5X TBE buffer (44,5 mM Tris, 44,5 mM borato, y 1 mM EDTA), y el 25% de glicerol ] A corriente constante de 30 mA durante aproximadamente 60 minutos. Geles fueron secados sobre papel secante y expuestos a rayos X película.

1,6 kb de la CCR3 promotor, incluidos 60 pb del exón 1 sin traducir, se subcloned en el vector pEGFP (Clontech, Palo Alto, CA). La construcción de transgénicos que contienen el promotor, reportero de genes verdes fluorescentes mayor sonda (EGFP) y el SV40 polyadenylation señal (Figura 4] fueron liberados por Afl II y Hind III digestión y se inyecta en la pronucleus de huevos fecundados de FVB / N por los ratones transgénicos Core instalación en el Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Ratones transgénicos fueron identificados por Southern blot después de la digestión con BamHI, utilizando el SV40 poli Un fragmento como una sonda. Se les realizó pruebas de las líneas de expresión del transgén en múltiples órganos del Norte por secante y RT-PCT. El SV40 poli Un fragmento fue utilizado como una sonda para secante del Norte. PCR primers para EGFP fueron los siguientes: 5'ATGGTGAGCCAAGGGCGAG3 'y 5'CTTGTACAGCTCGTCCATG3'. RNA de la integridad y la eficiencia RT fue verificado por la realización de PCR para β-actina en el mismo cDNA muestras. Primers utilizados fueron los siguientes: 5'GGAATCCTGTGGCATCCATGAAACT3 'y 5'TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG3'.

La inmunohistoquímica se realizó en secciones congeladas, tal como se describe en esencia [52]. En pocas palabras, después de peroxidasa endógena refrescante, diapositivas fueron bloqueadas y manchadas de un conejo-anticuerpos anti-GFP (AB3080 en dilución 1:400, Chemicon Internacional, Temecula, CA). Las diapositivas se lavaron y se incubaron con biotina de cabra anti-conejo de anticuerpos y avidina-peroxidasa (Peroxidase Elite Vectastain ABC kit, Vector Laboratories). Las diapositivas fueron desarrolladas por diaminobenzidine níquel, el aumento de cloruro de cobalto níquel para formar un precipitado negro y con counterstained nuclear rojo rápido.

JLC llevó a cabo el análisis de la AESM. LEK el DNAse realizado estudios de hipersensibilidad. Nueva Zelanda lleva a cabo la generación y análisis de ratones transgénicos, participó en el diseño y la coordinación del estudio general y redactó el manuscrito. MER participado en el diseño y la coordinación del estudio general y ayudó a redactar el manuscrito.