Journal of Experimental & Clinical Assisted Reproduction, 2005; 2: 6-6 (más artículos en esta revista)

Localización de la expresión génica y de sulfatasa de esteroides por RT-PCR en células del cumulus y relación con los niveles séricos de FSH observados durante la fertilización in vitro

BioMed Central
Yukiko Otsuka (yukiccccc@yahoo.co.jp) [1], Atsushi Yanaihara (atsushi-y@med.showa-u.ac.jp) [1], Shinji Iwasaki (shinji-i@gb3.so-net.ne . Jp) [1], Junichi Hasegawa (hasejun@oak.dti.ne.jp) [1], Takumi Yanaihara (takumi-y@bc4.so-net.ne.jp) [1], Takashi Okai (okai. T@med.showa-u.ac.jp) [1]
[1] Departamento de Obstetricia y Ginecología Showa University School of Medicine 1-5-8, Hatanodai, Shinagawa-ku, Tokio, Japón

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Resumen
Antecedentes

El propósito de este estudio fue localizar la expresión de esteroide sulfatasa (STB) en células del cumulus y para determinar la relación entre STS expresión mRNA y los niveles séricos de hormona folículo-estimulante (FSH), hormona luteinizante (LH), estradiol y progesterona .

Métodos

El tema grupo incluía 49 mujeres (29 a 44 años) para quienes el tratamiento de fertilización in vitro se indicó. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado. Ciento catorce muestras de complejos cumulus-ovocito (COC) se obtuvieron en virtud de la observación microscópica. Parte de la COC fue manchado por la STS de anticuerpos. ARN fue extraído por el método de fenol-cloroformo y PCR en tiempo real se realizó. Suero de cada paciente se recogieron y se midió por ELISA.

Resultados

Algunos de los cúmulos muestras fueron teñidas por la STS de anticuerpos. La expresión de mRNA STS en todas las muestras fue confirmada por RT-PCR cuantitativa. Aunque no existe una correlación significativa entre el nivel de STS mRNA y los niveles séricos de estradiol, progesterona y LH, existe una correlación negativa estadísticamente significativa entre el nivel de expresión del ARNm de STS y el nivel sérico de FSH (n = 105, p = 0,018, r = -0,22).

Conclusión

Estos resultados han demostrado, por primera vez, la expresión de STB en células del cumulus por inmunohistoquímico coloraciones y en tiempo real de RT-PCR. STS expresión en células del cumulus puede estar relacionado con el control del medio ambiente local de esteroides en el oocito. Las concentraciones séricas de FSH puede controlar STS mRNA expresión de los resultados de RT-PCR, aunque la correlación es baja.

Introducción

Ha quedado claro que la interacción entre el ovocito y las células de la granulosa es necesaria para el crecimiento de los ovocitos. Las células de la granulosa se ven influidas por la gonadotropina en la sangre y se dedican a la regulación de hormonas en el ovario. Como folículos crecer, y un antro se forma, las células de la granulosa separadas en dos anatómicamente y funcionalmente distintos sub-tipos: los cúmulos células de la granulosa, los rodean y metabólica en contacto íntimo con el ovocito, y el mural células de la granulosa (MGC), las células que recubren Folículo la pared formando un epitelio estratificado con la lámina basal. Ovocito-regulado vía de la diferenciación de células de la granulosa, a través de la secreción de factores de crecimiento paracrinos, es hacia el fenotipo de células del cumulus. Células del cumulus mostrar características funcionales que son marcadamente diferentes de CGM, tienen una alta tasa de proliferación, muy baja expresión del receptor de LH en comparación con el MGC, y poseen la capacidad de secretar ácido hialurónico y someterse mucification / MGC expansión que no [1 - 4 ].

Las células del cumulus altamente especializados han trans-zonales citoplásmica procesos, que penetran a través de la zona pelúcida y acerca de la membrana del óvulo [5], que forman el complejo cumulus-ovocito (COC). Brecha de los cruces en los extremos de estos procesos permitirá la transferencia de las pequeñas moléculas de peso molecular entre el ovocito y las células del cumulus, y también entre las células del cumulus, mientras que los grandes moléculas se transportan por endocitosis mediada por receptores. Este modo de comunicación es esencial para el desarrollo y la fecundidad [6 - 8], y se cree que juegan un papel clave en la difusión de las señales locales y endocrinos a los ovocitos a través de la células del cumulus.

Recientemente, el COC se sugirió que participar en la esteroidogénesis [9, 10]. Maduración folicular y el desarrollo son procesos complejos influidos por tanto intra como extra-ovárica eventos que conducen al éxito de la ovulación. Es posible que la esteroidogénesis en el COC contribuye a la calidad del embrión.

El propósito de este estudio es localizar la expresión de esteroide sulfatasa (STB) en el COC y para examinar las relaciones entre el nivel de expresión de STS y los niveles séricos de hormona folículo-estimulante (FSH), hormona luteinizante (LH), estradiol y Progesterona.

Materiales y métodos
Los pacientes

El tema, compuesto por 49 mujeres (29 a 44 años) para los que la fertilización in vitro (FIV) es el tratamiento indicado. Las mujeres fueron pacientes en el Hospital Universitario Showa. El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. 114 muestras de células del cumulus fueron obtenidos como parte de la observación microscópica. 9 muestras de células del cumulus de 3 mujeres fueron utilizados para la inmunohistoquímica, en tanto que independiente, 105 muestras de 49 mujeres fueron utilizados para RT-PCR.

Indicaciones para el procedimiento de la FIV en estas mujeres incluyen: factor de la infertilidad tubárica (11 casos, 32 muestras), la infertilidad masculina (10 casos, 30 de las muestras), y la infertilidad inexplicada (28 casos, 89 muestras).

Estimulación ovárica

Los pacientes recibieron terapia de estimulación ovárica con citrato de clomifeno (CC, Clomid; Merrell, Cincinnati, OH) +-hormona estimulante del folículo (FSH; Fertinorm-P; Serono, SA, Madrid, España) o gonadotrofina menopáusica humana (HMG; Humegon; Organon , Oss, Holanda). El aumento repentino de LH se indujo en 5000 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG; Gonatropin; Teikokuzouki KK, Tokio, Japón) cuando al menos dos folículos alcanzado un diámetro de 17 mm, según lo determinado por ecografía vaginal. Los ovocitos fueron recuperados en virtud de la orientación ultrasonográfico 34 a 35 h tras la administración de hCG.

Los ovocitos fueron separados de líquido folicular y enjuagar la solución. Luego, las células del cumulus fueron separados de los ovocitos, otros restos celulares y células de la sangre bajo la observación microscópica.

Se obtuvieron células del cumulus, y tinción inmunohistoquímica se realizó a través anti-humano STS de anticuerpos policlonales. El fenol-cloroformo método se utilizó para extraer el mRNA de células del cumulus. La expresión de mRNA STS fue examinado por RT-PCR cuantitativa utilizando primers específicos para el STB (como se describe más adelante).

Tinción inmunohistoquímica para el STB en células del cumulus

Muestras de tejido, de 9 de muestras de células del cumulus se fija en el 10% de búfer formalina neutra de 24 a 72 horas a temperatura ambiente, deshidratados alcohol a través de una serie clasificado, limpiado en xileno e incluidos en parafina. Serial secciones (3 - μ m de espesor) fueron cortadas y teñidas con anti-humano STS de anticuerpos policlonales utilizando el método ABC [11]. Este anticuerpo fue confirmada por la reactividad cruzada occidental blott método.

Controles negativos para la inmunomarcación se llevaron a cabo con el ratón en lugar de suero de anticuerpos primarios.

Extracción de ARN, la transcripción reversa y PCR en tiempo real

Cúmulos de células obtenidas en tiempo real RT-PCR se pusieron en cada microtubos, congelación y conservación a -80 grados se llevó a cabo antes de la extracción de RNA. ARN total fue extraído de las células usando el método de fenol-cloroformo. ARN total extraído se diluye con 20 μ l de agua DEPC en ausencia de Rnase. 5 μ l de las soluciones de ARN se utiliza para la transcripción reversa (RT), utilizando oligo (dT) y un primers TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver 2.1 (INC TAKARA BIO, Shiga, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

TaqMan PCR Universal MasterMix y Ensayos-on-Demand Expresión Génica sondas (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) fueron utilizados para la PCR paso. La amplificación y la detección se realizó a través de ABI PRISM 7700 Sequence sistema de detección (Applied Biosystems) con el siguiente perfil: 1 ciclo a 94 grados durante 10 minutos, y 40 de cada ciclo de 95 grados durante 15 segundos y 60 grados durante 1 min.

El RNA de la placenta con el que se diferencian de dilución aumentos (× 1, × 10, × 10 2, y × 10 3 × 10 4) se utilizaron y la cantidad de cada valor se establecieron como × 10 4, 10 3 ×, × 10 2, x 10 , × 1, a hacer una serie de normas de la curva. El ciclo umbral (Ct), que se define como el ciclo en un valor significativo, se dio como el valor medio. La expresión relativa de cada mRNA fue calculado por el método comparativo Ct, utilizando Δ Ct (el valor obtenido restando el valor de la placenta Ct STS y GAPDH mRNA de la Ct valor de cada mRNAof células del cumulus). En concreto, la cantidad de mRNA de la meta relativa a la placenta ARNm se expresa como 2 - (Δ Ct).

Luego, se calculó la proporción de la cantidad de mRNA de STS a la de GAPDH mRNA en cada muestras, y se utiliza para el análisis de la relación como la expresión de los valores de ARNm STS células del cumulus [12].

Análisis estadístico

Análisis de correlación de Pearson se hizo. Valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Suero análisis

Los niveles de gonadotropinas (FSH y LH) y esteroides (estradiol y progesterona) en el suero de los 49 las mujeres se determinará por un comercial ensayo inmunoenzimático kit (AFP-600II, TOSOH, Tokio, Japón). La sensibilidad, intra-ensayo coeficiente de variación (CV) (n = 1 0) e inter-ensayo de CV (n = 20) fueron los siguientes: FSH: 0,07 mUI / ml, 1.6-2.3%, 4.0-4.9%; LH : 0,08 mUI / ml, 1.8-2.3%, 1.9-2.3%; estradiol: 13 pg / ml, 2.4-5.1%, 3.3-7.7%; progesterona: 0,02 ng / ml, 4.4-9.0%, 5.8-10.1%.

Resultados

STS expresión está presente en todas las 9 muestras de células del cumulus humanos que se immunohistochemically manchadas. El citoplasma de las células del cumulus fue manchado por anti-humano STS de anticuerpos policlonales, como se muestra en la Fig 1A y 1B.

Hubo una correlación negativa estadísticamente significativa entre el nivel sérico de FSH y STS expresión mRNA (n = 112, p = 0,018, r = -0,22) (Figura 2A]. Por otra parte, no hubo correlaciones significativas entre STS mRNA y los niveles séricos de estradiol (Figura 2B], progesterona y LH.

Discusión

Maduración folicular y el desarrollo son procesos complejos influidos por tanto intra como extra-ovárica eventos que conducen al éxito de la ovulación. El líquido folicular concentración de progesterona en maduras COC fue significativamente más elevada que en la etapa inmadura [13]. Se ha sugerido que las concentraciones de esteroides en el líquido folicular están asociados a la maduración de ovocitos y embriones de calidad [14 - 16].

Vanderhyden et al. [10] planteó la posibilidad de que los ovocitos de ratón secretan un factor (s) que inhibe la progesterona y estradiol estimula la producción de células del cumulus por el cultivo de ratón COC y complejo que el ovocito se eliminó microquirúrgicamente. La participación de los ovocitos en la regulación de la producción de progesterona sugirió un papel potencialmente importante para el ovocito en la prevención de la luteinización prematura del folículo. Aunque el crecimiento factor de diferenciación-9 (GDF-9), GDF-9B y / o de la proteína morfogénica de hueso-6 (BMP-6) es probable candidato moléculas, la identidad de estos ovocitos secretan factores de crecimiento de la regulación de las funciones clave de ovario (prevención de parto prematuro Luteinización, lo que permite la expansión de células del cumulus, la estabilidad de la matriz extracelular, facilitando así la ovulación) siguen siendo desconocido [4].

Directa de la producción gonadal de esteroides sulfatados andrógenos puede ser una importante alternativa o complementaria vía de la esteroidogénesis ovárica. La conversión de los andrógenos suprarrenales sulfatados, presente en el suero en concentraciones micromolar en las mujeres adultas, en cribado andrógenos o estrógenos requiere STS actividad.

Aunque STS actividad se ha observado en las células de la granulosa de ratas y seres humanos [17, 18], la existencia de STB en el COC de cualquier especie no ha sido reportada. Este es el primer estudio a la utilización de inmunohistoquímica y RT-PCR cuantitativa para demostrar que el STB es localizado y se expresa en humanos COC.

Kosmath et al. Informó de que las pruebas de aril sulphatase actividad dio resultados positivos en todos los tipos de células del folículo atretic. Una reacción muy fuerte se observó en las células de la granulosa y de la migración de las células del folículo atretic. Se planteó la posibilidad de que pueda aumentar durante sulfatasa atresia [19]. En este estudio, se realizó la RT-PCR cuantitativa de STS mRNA en células del cumulus, sin embargo, no analizar entre la cantidad de mRNA STS expresión y la maduración de los ovocitos. Lo consideramos como el futuro objeto de examinar la relación entre ellos.

Schoenfelder et al. [9] informó de que los AOC bovina fueron capaces de secretar hormonas esteroides durante varios maduración in vitro (GIV) sin el apoyo de la granulosa folicular o de células de teca y los anticonceptivos orales combinados que poseen importantes androgénica, enzimas, como 3 β hidroxiesteroide deshidrogenasa (3 β HSD) y la aromatasa . Sus resultados indican que los AOC son capaces de modular su entorno androgénica, in vitro. Y es posible que la esteroidogénesis pueden incluir STS. Aunque rápidos cambios morfológicos y androgénica son descritas para las células de la granulosa [20], en la cultura de las células de la granulosa respondió así a la LH y FSH por el aumento de la producción de estradiol además casi sin cambios la secreción de testosterona y la progesterona. El apoyo a tales intactos los niveles de progesterona, 3 β HSD mRNA expresión no mostró cambios significativos durante el tratamiento gonadotropina. En cambio, el aumento inicial de la aromatasa mRNA que fue causada por cualquiera de FSH o LH llevado al retraso en la secreción de estradiol, mientras que el co-tratamiento indujo aumentado ligeramente los niveles de estradiol [9]. Estos resultados pueden indicar un ciclo de estro dependiente de la reactividad de las células de la granulosa a los diferentes ratios de gonadotropina, que existen en distintos pero cambiando ratios in vivo. Es probable que el control de las gonadotropinas esteroideos enzimas, y la FSH puede controlar STS expresión en células del cumulus.

Bonser J et al. [21, 22] informó que se STS actividad y la capacidad de utilizar sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEAS) como precursor para la producción de estradiol en humanos células de la granulosa, y que LH y estrona 3-O-sulfamate inhibió esta actividad. Sin embargo, no pudieron encontrar ninguna coherente efectos de la FSH sobre la conversión de DHEAS a otros esteroides [21, 22].

Se informó de que la interleuquina (IL) -1 β en humanos endometrio reprimidas STS STS mRNA y actividad en el cultivo de células del estroma [23]. Otro informe indica que la IL-1 β en las células de la granulosa de rata mediada por la inhibición de la gonadotropina estimulada por la modulación de la esteroidogénesis 20 α-hidroxiesteroide deshidrogenasa. El informe sugiere un papel de la IL-1 β en la mediación de la disminución observada de estas hormonas bioactivas [24]. En los seres humanos, la FSH estimula la IL-1 β secreción de las células mononucleares aisladas de la sangre periférica de las mujeres en la fase folicular [25]. Estudios anteriores podrá apoyar los resultados actuales, es decir, los niveles séricos de FSH puede controlar y reprimir la expresión de mRNA STS células del cumulus a través de citoquinas como la IL-1 β.

Puede haber mayor relación con intrafollicular en lugar de suero factores. Originalmente, deberíamos analizar con los niveles de la hormona en el líquido folicular, sin embargo, no haber realizado en este estudio. Además, dado que el número de folículos por COH crecido en cada uno de los pacientes eran diferentes y múltiples, el medio ambiente local hormonal en cada folículos no se refleja en los niveles hormonales en suero de estradiol y progesterona. Tome en cuenta estas especulaciones, puede haber algunas correlaciones con las otras hormonas de las que no se observó correlación entre la expresión de mRNA de STS en este estudio.

En conclusión, estos resultados han demostrado, por primera vez, la expresión de STB en células del cumulus por inmunohistoquímico coloraciones y en tiempo real de RT-PCR. STS expresión en células del cumulus puede estar relacionado con el control del medio ambiente local de esteroides en el oocito. Aunque el suero de FSH puede controlar STS mRNA expresión de los resultados de RT-PCR, creemos que es necesario seguir estudiando este tema, debido a que la correlación es baja. Después de eso, la investigación adicional será también necesaria para analizar con el líquido folicular, identificar a los responsables y el mecanismo para determinar la relación entre STS expresión en células del cumulus, la maduración de ovocitos y la calidad del embrión.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias pierda Momoko Negishi por su asistencia técnica. Agradecemos a TOSOH Corporation y EIKEN QUÍMICA CO, LTD. Para darnos AFP-600II y Kit inmunoensayo enzimático. Este estudio fue apoyado por la Salud y Ciencias del Trabajo de Subvenciones.