Virology Journal, 2005; 2: 26-26 (más artículos en esta revista)

Ultraestructurales estudios sobre el virus del dengue tipo 2, la infección de los monocitos humanos cultivadas

BioMed Central
A Jesús Mosquera (mosquera99ve@yahoo.com) [1], Juan Pablo Hernández (asisca_jph@cantv.net) [2], Nereida Valero (nere98@hotmail.com) [3], Luz Marina Espina (lmespina@hotmail.com ) [3], alemán J Añez (ganezg@yahoo.com) [3]
[1] Seccion de Inmunologia y Biologia Celular, Instituto de Investigaciones Clínicas "Dr Américo Negrette ". Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela
[2] Instituto de Investigaciones Biologicas. Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela
[3] Seccion de Virologia, Instituto de Investigaciones Clínicas "Dr Américo Negrette ". Facultad de Medicina, Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela

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Resumen
Antecedentes

Principios de la interacción de los virus del dengue y de los monocitos / macrófagos podría ser una característica importante para los virus de difusión después de su entrada inicial a través del mosquito vector. Desde análisis ultraestructural de esta interacción no se ha informado, el dengue tipo 2 (DEN2)-infectados por el virus de los monocitos humanos de las culturas estudiadas a 1, 2, 4 y 6 horas después de la infección.

Resultados

Típico de las partículas de dengue y difusos revestidos partículas virales fueron de 35 a 42 y de 74 nm a 85 nm, respectivamente. Los virus fueron sumergidos por la fagocitosis y macropicnocytosis conducen a enormes vacuolas y phagosomes dentro de los monocitos. Interacción de los monocitos con DEN2 la apoptosis inducida por el virus, que se caracteriza por la fragmentación y condensación nuclear, encogimiento celular, y en ciernes blebbing fenómenos y la fagocitosis de las células apoptóticas por los vecinos monocitos. Este hallazgo fue confirmado por TUNEL. Características ultraestructurales asociados a la replicación del virus de DEN2 no se observaron.

Conclusión

Estos datos sugieren que el aclaramiento del virus de monocitos y la muerte celular son las principales características iniciales durante la interacción de los virus de DEN2 y monocitos y esto podría ser importante en la rápida erradicación del virus tras la infección por el mosquito vector.

Antecedentes

Monocitos / macrófagos son uno de los principales objetivo del virus del dengue y el virus responsable de la difusión después de su entrada inicial a través del mosquito vector [1 - 3]. Un estudio detallado de este virus de principios de la interacción de los monocitos por microscopía electrónica no se ha realizado. Desde el estudio ultraestructural es uno de los importantes en el análisis de la interacción virus-célula, hemos realizado estudios de microscopía electrónica en DEN2 infectados por el virus de monocitos humanos en el 1, 2, 4 y 6 horas de la cultura, con el fin de obtener más información con respecto a los aspectos morfológicos De los virus, la replicación del virus, alteraciones celulares y la apoptosis.

Resultados y discusión
Partículas virales

Después de 1 hora de la cultura numerosas partículas virales se observaron adjunta a la membrana plasmática, libre en el espacio extracelular y en el interior de vacuolas citoplasmáticas monocitos. Las partículas virales predominantes en los monocitos infectados culturas típicas partículas virales fueron de 35 a 42 nm de diámetro (Figuras 1A, 1B, 1C]. Pequeño número de partículas virales fuzzy revestidos (74 a 85 nm) mostró un núcleo similar a la habitual de las partículas de dengue, pero que había un sobre con las proyecciones, buscando como una capa difusa (figuras 1D, 1E]. DEN2 partículas virales típicos observados en este estudio fueron similares a los reportados en cultivos de células de mosquitos [4]. Similar fuzzy recubiertos de partículas virales han sido descritas por Barth et al [4, 5] en DEN2 brasileño C6/36 infectados por el virus de los cultivos celulares. DEN2 virus utilizado para infectar monocitos fue Nueva Guinea y virus C de la cepa aislada de infectados por el virus C6/36 cultivos celulares, lo que sugiere que las partículas virales revestidos difusos son una característica común de DEN2 virus. Además, fuzzy recubiertos de partículas virales también han sido detectados en otras infecciones por virus, pero su significado sigue siendo oscura [6, 7]. DEN2 La presencia de antígenos del virus en el citoplasma de los monocitos infectados también fue investigado por inmunofluorescencia directa. El uso de un anticuerpo monoclonal contra el virus de DEN2 una difusa y desigual patrones de fluorescencia se observaron en el citoplasma (Figura 1F]. También se observó electrón densos estructuras pequeñas (75 a 105 nm) que hemos denominado en este informe "densa de partículas" (Figura 2]. En algunos casos, estas densas partículas mostraron un centro similar al dengue virus nucleocapsid cubiertos por capas de la membrana y un electrón densos dotación (Figuras 2B, 2C]. Densas partículas podría representar partículas virales cubiertos por un material homogéneo electrón densos. Puesto que, no se observan características ultraestructurales de la replicación viral en los monocitos infectados culturas, la contribución de los monocitos a la formación de esta envoltura viral no está claro. Sin embargo, electrón densos material observado en la densidad de partículas podría representar una matriz proteica obtenido después de la replicación del virus en células de mosquito. En este sentido, un rango de variación en el virus después de un aislamiento experimental ha sido reportada en otros virus [6, 7]. En general extracelular partículas virales se encontraron como único partículas y la formación de agregados de partículas virales fueron poco frecuentes. Los virus adjunto a la superficie de la célula y libres en el espacio extracelular se sumió por mecanismos de fagocitosis o macropicnocytosis típico citoplásmica a través de los procesos (Figura 3]. Durante la fagocitosis o macropicnocytosis partículas virales se sumió en solitario o junto con los desechos celulares, de modo que, intracitoplasmática de vacuolas y vesículas que contienen partículas virales o grandes phagosomes llena de un electrón densos matriz, restos celulares y partículas virales posible que pronto se encuentre dentro de las células (Figura 4 ). Estos datos sugieren una fase pasiva conduce a la inactivación del virus. En este sentido, los informes anteriores han demostrado que los virus de la inmunodeficiencia humana entrando en la fagocitosis por los macrófagos humanos no es [8]. La infección de células de Kupffer por virus del dengue, no se progenie viral [9], y sólo una pequeña proporción de la población apoya los monocitos replicación de DEN2-virus [10]. Smooth membrana de revestimiento vacuolas que contienen partículas virales, fragmentos de membrana y moderado electrón densos materiales también fueron observados (Figura 1B]. En algunos casos, frente al citoplasma de vesículas que contienen una o más partículas virales mostraron alteración de la membrana conduce a la comunicación directa de partículas virales con el citoplasma (Figura 1C], sin embargo, no morfológicos en las estructuras relacionadas con el virus puede ser detectado libre en el citoplasma. Características relacionadas con la replicación viral, como el virus de la absorción por penetrar la membrana celular o por endocitosis por clathrin-coat vesículas, virión precursores de retículo endoplasmático rugoso o sus cisternas, en el interior de complejo de Golgi, citoplasma libre viral viral en ciernes o núcleos de las células de la membrana no se observaron En monocitos. Informe anterior ha demostrado que la persistencia de DEN2 virus puede infectar las células transformadas lymphoblastoid mantenimiento de la morfología intacta, sin ninguna indicación de replicación viral activa [11]. Nuestros datos no muestran indicios de la replicación viral y la inducción de la apoptosis (véase más adelante) monocitos hace poco probable fuente de la persistencia de la infección por el virus del dengue.

Monocitos culturas

Según la evaluación de la microscopia electrónica, los monocitos mostraron alto grado de activación después de 1 hora de la infección. Una de las características más destacadas en DEN2 monocitos infectados por el virus fue la intensa expresión de corto y largo procesos de membrana plasmática (lamellipods), en la mayoría de los casos que envuelve a las partículas de virus, restos celulares y en apoptosis (Figura 3]. Sumida extracelular de elementos por pseudopods También se observó (Figura 3C]. Como consecuencia de esta actividad, los pequeños y grandes vacuolas intracitoplasmáticas y phagosomes celulares que contienen los desechos, y las partículas del virus de la mielina como estructuras en diversas etapas de la digestión se observaron (Figuras 3 y 4]. En algunos casos, phagosomes o vacuolas se vieron rodeados por lisosomas. (Figura 5A]. Nuestros datos muestran ultraestructurales conclusiones similares a las obtenidas de DEN1 virus de las células de Kupffer infectados por 1 hora de la cultura [9], lo que sugiere una similar respuesta celular contra el virus DEN de los monocitos y macrófagos. En DEN2 monocitos infectados por el virus de la mitocondria aumentaron en número y tamaño (Figura 5B] y frente al citoplasma de las estructuras se asemejan a diversos grados de alteraciones mitocondrial (Figuras 5C, 5D] se encontraron. Mitocondrias se observaron en asociación con gránulos lisosomales y vacuolas que contienen los desechos membranosa, en consonancia con mitocondrial digestión por lisosomas. Monocitos infectados mostraron una amplia proliferación de retículo endoplasmático y gránulos lisosomales (Figura 5E]. Citoplásmica proyecciones relacionados con el movimiento celular (uropods) también fueron observados (Figura 5F]. No se observó syncytia, sin embargo, como se muestra en la figura 6 una curiosa distribución de los monocitos en DEN2 infectados por el virus se encontró culturas. Los espacios vacíos estaban rodeados de monocitos buscando como "acinares" estructuras. En algunos casos, un material denso lineal de electrones se produjeron entre el espacio vacío y los monocitos, lo que sugiere una anterior presencia de material biológico en el lumen. Estos resultados podrían representar una respuesta reactiva de monocitos alrededor de las partículas de virus, restos celulares o células infectadas por virus.

Muerte Celular

Después de 1 hora de la infección, la microscopía electrónica reveló las células con características morfológicas de la apoptosis, sin embargo, el informe anterior ha demostrado apoptosis en células de Kupffer [9] después de 24 horas de DEN-1 del virus de la infección, lo que sugiere diferentes susceptibilidad de los monocitos y macrófagos a los inducidos por el virus de Apoptosis o apoptosis efecto viral diferentes dependiendo de la cepa del virus DEN. En este sentido, la susceptibilidad a la infección por el virus DEN dependiendo de la diferenciación de las células estado de monocitos ha informado [12]. Apoptosis mostró marginación en núcleos de cromatina, la fragmentación nuclear, la condensación y la retracción del citoplasma y blebbing y fenómenos en ciernes (Figuras 7 y 8]. Numerosas vesículas, algunos de los cuales parecían estar en libertad al espacio extracelular se observaron (Cifras 7D y 8E]. El incipiente fenómeno observado en células apoptóticas condujo a la formación de cuerpos apoptóticos que contienen varios tipos de orgánulos, incluyendo fragmentos nucleares y alto número de vesículas. Esto podría representar un aspecto común en la apoptosis inducida por el virus, ya que la formación de los órganos vesicular apoptosis se ha observado también en monocitos / macrófagos infectados con el linaje del virus de la leucemia bovina [13]. Blebbing de la membrana plasmática también se observó en apoptosis. La superficie blebbing también ha sido descrito en otras infecciones virales y relacionados con un papel directo en la célula a célula propagación del virus [14] o asociados con el aumento de la permeabilidad celular [15]. Algunos mostraron en apoptosis largo cisternas junto con las estructuras de la membrana plasmática, sugiriendo citoplásmica de reparto (Figura 8G]. No tenemos explicación para este hallazgo, pero puede ser debido a la fusión de vesículas citoplasmáticas vecinos. Apoptosis también mostró haces de microfilamentos intracelular (Cifras 7G y 7H], que se asemeja a la observada en las estructuras contráctiles fibroblastos y algunas células glomerular [16]. Estas estructuras podrían estar relacionados con el proceso de apoptosis, ya que, filamentosos material, aglutinación de tonofilamentos y MyD88 proteína fibrilar asociación con los agregados que contienen beta-actina se han asociado con la apoptosis y la formación de los órganos de apoptosis [17 - 19]. Enorme phagosomes se observaron en el citoplasma de las células apoptóticas (Figura 7E], y, en algunos casos, las vacuolas que contienen pocas partículas virales asociados a un electrón densos material se observaron (Figuras 8E y 8F]. La presencia de phagosomes en el citoplasma de las células apoptóticas sugiere anterior activa la fagocitosis. Contrariamente a la apoptosis de células no sólo escaso número de vacuolas que contienen virus y degradados material se observó en apoptosis, lo que sugiere que la absorción de los productos de degradación viral podría desencadenar la muerte celular. Varios apoptosis monocitos y apoptosis cuerpos fueron ingeridas por vecinos sanos monocitos dan lugar a la formación de enormes vacuolar compartimentos que contienen diferentes grados de digestión celular (Figuras 8D y 9]. La apoptosis podría evitar la liberación de las partículas virales [20] y junto con la fagocitosis y la digestión de las células apoptóticas representan los mecanismos para prevenir la progenie viral [9, 21, 22]. Ultraestructurales de la apoptosis hallazgo fue confirmado por la detección de intracromosomal filamento de la DNA se rompe utilizando el tunel de ensayo. Si no se trata culturas mostraron bajos niveles de células TUNEL positivas en comparación a los niveles más altos observados en los monocitos infectados culturas (Control: 0,9 ± 0,15. Infectados en 1 h: 6,2 ± 1,5; 2 h: 6,4 ± 1,8; 4 h: 7,4 ± 2,3; 6 h : 16,8 ± 3,3; media ± SE) (Figura 8H]. Además de la apoptosis, una alteración celular acompañada de hinchazón celular, la membrana plasmática y desorganización karyolysis se observó (Figura 10]. Membrana plasmática trastorno ocasionado el aumento de la cantidad aumentó orgánulos celulares y desechos en el espacio extracelular y la formación de "células fantasma" (Figuras 10C y 10D], que azota con más de monocitos (Figura 10E]. Estas células lisadas podría representar nonphagocytized en apoptosis que han perdido la integridad de la membrana [23]. Dado que, noninfected controles o inactivadas por calor DEN2 monocitos infectados por el virus mostró escaso número de células apoptóticas, la apoptosis parece estar vinculada a la infección por el virus. No podemos descartar el papel de inductor de apoptosis en las proteínas de apoptosis observada en este estudio. En este sentido, el aumento de la producción del Factor de Necrosis Tumoral ha reportado en DEN2 macrófagos infectados por el virus que podría dar lugar a la apoptosis. [24].

Conclusión

Este estudio in vitro indica que la interacción de los virus con DEN2 monocitos resultados en engulfment virus y apoptosis, lo que sugiere que los monocitos pueden proteger contra la infección por el virus de DEN2 eliminar el virus y partículas infectadas por el virus de las células apoptóticas y esto podría ser importante en el rápido despacho de La aportación inicial del virus.

Métodos
Preparación de las existencias de virus y el virus de la titulación

DEN-2 del virus de la cepa Nueva Guinea C se propaga en las células C6/36HT mosquito que se cultivaron en medio de Eagle MEM con 10% de SFB antes de la infección viral de los monocitos. El virus se cosechó medio de cultivo después de 5 días de incubación y después de la eliminación de los desechos de células por centrifugación, el virus sobrenadante fue alicuotar y almacenados a -70 ° C hasta su utilización. Virus fue titulada por la formación de placa en los ensayos de células VERO. Las células fueron colocadas en el 1 × 10 6 células / así en el 24 y, posteriormente, así placas, la dilución de virus fueron añadidos y las mezclas fueron incubadas a 37 ° C durante 7 días. Luego, las placas se visualizaron por tinción con un tinte solución compuesta de 1% de cristal violeta. Virus concentraciones se ofrecen como unidades formadoras de placa (PFU) / ml. Virus de valores es libre de endotoxina que determine limulus lisado de amebocitos de ensayo.

Monocitos culturas

Monocitos se aislaron de sangre periférica heparinized obtenidos de humanos voluntarios sanos (N = 5) de la densidad de centrifugación más de 1,077 Histopaque (Sigma Chemical Co, St Louis, MO). Individuos sanos fueron informados sobre el estudio y sus procedimientos de consentimiento se obtuvieron antes de la inscripción en la investigación a raíz de las directrices del comité de ética, de la comisión de bioética de la Escuela de Medicina (Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela). Total de leucocitos mononucleares recuperado de la interfaz se lavaron y resuspendido en RPMI 1640, el 10% de suero fetal bovino y de la penicilina y la estreptomicina. Después, 300 μ l / así de una suspensión celular (4 × 10 6 células / ml) fueron el 8 de capas de plástico y cámara de diapositivas (Nunc, Roskilde, Dinamarca) o 10 ml de 75 cm 3 frascos de cultivo de tejidos y se incubaron durante 3 horas A 37 ° Cy 5% de CO 2. No adeptos células fueron lavadas con cálido y medio se adhirieron células fueron utilizados para experimentos.

La infección de los monocitos culturas

Monocitos fueron infectados con un virus de concentración de 4 × 10 4 PFU / ml (MOI: 0.08) y se incubaron durante 1, 2, 4 y 6 horas a 37 ° Cy 5% de CO 2. Controles representan monocitos cultivados con complementada medio sin virus. Además, los monocitos culturas fueron incubadas con dengue virus inactivado por calor (56 ° C, 30 min.) En un 4 × 10 4 PFU / ml durante 6 horas.

Estudios de microscopía electrónica

Monocitos plantados en 75 cm 3 frascos de cultivo de tejidos se incubaron durante 1, 2, 4 y 6 horas con DEN-2 virus (4 × 10 4 PFU / ml). Posteriormente, las células fueron separadas por incubación con una solución de EDTA 0,01% y utilizando una celda rascador. Después de la centrifugación, monocitos infectados y controles fueron fijadas con glutaraldehido al 2% en cacodylate buffer 0,1 M, pH 7,3. Las células se postfixed con tetraoxide osmio 1%, deshidratados en una serie de etanol y embebido en Epon 812. Las muestras fueron cortadas en secciones ultrathin, teñidas con acetato de uranilo seguido de citrato de plomo y examinadas en un microscopio electrónico JEM 1010 (JEOL, Japón).

Inmunofluorescencia directa para DEN-2 antígenos

Los experimentos se realizaron en 8-cámara de plástico y diapositivas. Monocitos fueron infectadas por incubación con virus DEN-2, tal como se describe más arriba. Monocitos fueron lavados en PBS y fijadas con acetona fría durante 5 minutos. Intracelular de los antígenos virales fueron detectados por un ensayo de inmunofluorescencia directa utilizando un conjugado de fluoresceína-DEN-2 virus-anticuerpo monoclonal específico (CDC, Fort Collins, CO EE.UU.).

TUNNEL ensayo

El método para nick de fin de etiquetado de las células apoptóticas se adaptó a la de Gavrieli et al. [25] con un kit comercial (Pharmigen, San Diego, CA). Adheridos monocitos fueron tratados según el protocolo siempre con este kit. El ensayo se basa en la unión de las preferenciales FITC-dUTP por terminal deoxynucleotidyl transferasa a 3 'OH extremos del ADN. Positivo núcleos apoptóticos fueron evaluadas por microscopía de fluorescencia (Axioskop, Zeiss, Alemania).

Conflicto de intereses

Los autores certifican que no han entrado en ningún acuerdo que pueda interferir con su acceso a los datos de la investigación, o en su capacidad para analizar los datos de forma independiente, para preparar manuscritos, y de publicarlas. Los autores no han cualquier conflicto de interés.

Contribuciones de los autores

JM diseñado, coordinado y el proyecto de manuscrito. JPH ultraestructurales realizados los procedimientos. NV, LME, GA realizado TUNEL ensayo, el aislamiento del virus, monocitos culturas. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias al Dr Dwane Gubler (Fort Collins, el Centro para el Control de Enfermedades, de Colorado) para el anticuerpo monoclonal contra el virus del dengue tipo 2, el hecho de que los estudios de inmunofluorescencia viral informó aquí.