Journal of Translational Medicine, 2005; 3: 14-14 (más artículos en esta revista)

El melanoma es una célula madre tumoral? Identificación de proteínas en neurogénica transeuropeas de células diferenciadas

BioMed Central
Suraiya Rasheed (srasheed@usc.edu) [1], Zisu Mao (zmao@usc.edu), Jane MC Chan (jmc@usc.edu), Linda S Chan (lschan@usc.edu) [2]
[1] Laboratorio de Oncología Viral y Proteómica de Investigación, Departamento de Patología, Universidad del Sur de California, 1840 N. Soto St Los Angeles, CA 90032-3626USA
[2] Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina Keck de la Universidad del Sur de California, 1840 N. Soto St Los Angeles, CA 90032-3626, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Aunque varios genes y proteínas han sido implicadas en el desarrollo de los melanomas, los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de estos tumores no se conocen bien. Para obtener una mejor comprensión de la relación entre el crecimiento celular, la diferenciación y la tumorigénesis, hemos estudiado un melanoma maligno gato línea celular que transeuropeas de diferencia en las células neuronales después de la exposición a un felino retrovirus endógeno RD114.

Métodos

Para definir el repertorio de las proteínas responsables de las diferencias fenotípicas entre el melanoma y su homólogo transeuropeas de células diferenciadas neuronal que hemos aplicado la tecnología de la proteómica y de los perfiles de proteínas en comparación de los dos tipos de células y proteínas expresadas diferencialmente identificados por electroforesis en gel de 2D, imagen y análisis de la masa Espectrometría.

Resultados

El melanoma y trans-diferenciado células neuronales podían distinguirse por la presencia de distintos tipos de proteínas en cada una de ellas. Aunque aproximadamente el 60-70% de las proteínas expresadas son compartidas entre los dos tipos de células, doce fueron inducidos por las proteínas de novo después de la infección de las células del melanoma con el virus de RD114 in vitro. La expresión de estas proteínas en las células diferenciadas transeuropeas se asoció significativamente con el concomitante crecimiento de la promoción de la regulación de proteínas y la regulación de las proteínas neurogénica (p = <0,001). Sobre la base de sus propiedades fisiológicas,> 95% de proteínas expresadas en transeuropeas de células diferenciadas podrían estar asociados con el desarrollo, la diferenciación y regulación de las células del sistema nervioso.

Conclusión

Nuestros resultados indican que el gato células de melanoma tienen la capacidad de diferenciarse en distintos tipos de células neuronales y expresan las proteínas que son esenciales para la auto-renovación. Desde melanocitos deriva de la cresta neural del embrión, llegamos a la conclusión de que este melanoma surge de las células madre embrionarias precursores. Este modelo de sistema proporciona una oportunidad única para identificar dominios de las interacciones entre las proteínas expresadas tumorigénicos que detener el potencial de las células de melanoma y empujarnos hacia neurogenerative principios de los involucrados en la neurogénesis. Una mejor comprensión de estas proteínas en una buena coordinación de la red de señalización también ayudaría en el desarrollo de nuevos enfoques para la represión de los tumores altamente malignos que surgen de tallo similar a células embrionarias.

Antecedentes

Melanomas son un grupo heterogéneo de tumores que surgen en la piel, ojos, meninges y otras partes del cuerpo. Si bien las primeras etapas de los melanomas cutáneos son reconocidos por los cambios en el tamaño, forma o color de los nevus negro, la mayoría de las células del cáncer crecen hacia abajo de la piel y de invadir los tejidos vecinos antes de que sean detectados como altamente tumores metastásicos en los ganglios linfáticos u otros órganos [1] . Los pacientes con melanomas malignos no responden bien a las terapias actualmente disponibles y la mayoría de los tratamientos ineficaces.

Para obtener una mejor comprensión de los mecanismos implicados en el crecimiento, la diferenciación y la transformación de las células, hemos estudiado completamente diferenciadas (pigmentadas) altamente maligno melanoma gato línea celular CT1413, que transeuropeas de diferencia en las células neuronales, 48-72 horas después de la infección con El gato retrovirus endógeno RD114 in vitro [2, 3]. Transeuropeo de células diferenciadas exposición a largo multipolar frente al citoplasma de las extensiones que forman una red de conexiones neuronales con células gigantes multinucleadas y pequeños-como las células gliales (Fig. 1A, B & 1C]. Esta transformación es un caso muy específico de las células CT1413 y su interacción con el virus, ya que no RD114 morfológicos cambio se produce cuando estas células se tratan con diversas sustancias que se sabe que inducen la diferenciación celular (dexametasona, insulina, isobutyl-metil-xathine) o que están infectadas por separado Con retrovirus de primates que utilizar el mismo aminoácido neutro (NAA) como transportador de proteínas de los receptores al igual que RD114 virus [4, 3]. Además, en humanos, de ratón y de hámster melanoma líneas de células infectadas con el virus de RD114, o CT1413 células infectadas con los felinos o los virus de la leucemia murina tampoco presentan ningún cambio en la morfología celular.

Desde RD114 virus no se reproducen en el terminal transeuropeas diferenciadas las células neuronales, la hipótesis de que la unión de virus a su receptor en la membrana de células de melanoma podría inducir cambios conformacionales que generan una cascada de interacciones moleculares a través de distintas señales de que el arresto y el crecimiento de células tumorales Neurogenética, empujarnos hacia las vías. Para probar esta hipótesis, hemos analizado los perfiles de proteína completa del melanoma maligno, y su homólogo transeuropeas de células neuronales diferenciadas por 2 dimensiones electroforesis en gel (2DGE) e identificado proteínas expresadas diferencialmente en los dos tipos de células por Matrix-Assisted-Laser-Desorption - Ionization-Time-Of-Flight espectrometría de masa (MALDI-TOF-MS). Aquí se muestra que la trans-diferenciación de las células neuronales en el melanoma está directamente asociado con novo expresión de citoquinas pro-inflamatorias, la neurología regulador enzimas / quinasas, factores neurotróficos y concomitante supresión de la promoción del crecimiento de las proteínas. Este repertorio de proteínas no sólo es responsable de la generación de células neuronales, pero también participa en la reversión de un tumor maligno no cancerosos en las células neuronales.

Resultados y Discusión

Hemos comparado 3129 manchas de proteínas en geles derivados de la 15-RD114 infectadas y no infectadas de las células del melanoma dos experiencias independientes, y se analizaron las huellas dactilares de 467 péptido expresadas diferencialmente (hasta reguladas y downregulated) manchas de proteínas por MALDI-TOF-MS. Un total de 46 proteínas se confirmaron inequívocamente de 302 puntos extirpados de múltiples geles de ambos experimentos (Figura 2]. Los restantes 165 puntos no identificó la proteína a partir de la base de datos SWISS-PROT o de las proteínas identificadas no se reproducen en los lugares correspondientes de los distintos geles. Desde especie isómeros y las interacciones proteína-proteína en las células cat puede ser funcionalmente distintas de las de los humanos u otras especies, los 46 proteínas que aquí se han confirmado a partir de la base de datos de proteínas felino.

Por espectrometría de masa de gel de cada lugar, ya sea contenida por una sola proteína en un lugar no forma complejos o como un complejo de proteínas de 2-8 en un solo lugar. La frecuencia de distribución de las 46 proteínas entre los 302 incluía 82 puntos sola proteína puntos (32 en el melanoma y 50 en las células neuronales) y 220 puntos complejos que contienen proteínas (103 en melanoma y 117 en las células neuronales.

Entre las proteínas diferencialmente identificados, 12 se expresaron de nuevo exclusivamente en las células neuronales, dos fueron detectados sólo en las células del melanoma y 32 de 46 (> 69%) las proteínas son compartidas entre los dos tipos de células (Tabla 1, 2, 3 y Fig 2]. Tres de los 12 novo proteínas expresadas en las células neuronales se detectaron en el único, no forma complejos (designado por * en la tabla 1 y fig. 2A] y el 9 de proteínas se detectaron en complejos con otras proteínas (Figura 2A]. Todos nueva síntesis de proteínas o upregulated pertenecía a la familia de las citoquinas, enzimas de regulación neuro-/ quinasas, sensorial, y otras proteínas de señalización (Tablas 1, 2, 3]. Las dos proteínas, que se expresaron sólo en el melanoma, pero no en cualquiera de los geles derivados de las células neuronales son dependientes de ciclina kinasa inhibidor 1 (P21-CDNA **) expresado en un complejo / formulario único y matrilysin o matriz metaloproteinasa-7 (MMO7 ) (Fig. 2B; Cuadro 1B]. Estas proteínas han demostrado ser esenciales para mantener el crecimiento celular y la metástasis respectivamente [5, 6]. La probabilidad binomial para la distribución de las 12 nuevas proteínas expresadas en el transeuropeas de células diferenciadas en comparación con melanoma fue estadísticamente significativa (prueba exacta de Fisher p = 0,007).

Los cuadros 2 y 3 muestran las proteínas que se expresan tanto en las células de melanoma y neuronal. De las 32 proteínas en el melanoma compartida y diferenciada transeuropeas de células neuronales, 10 se detectaron en solo, así como en formas complejas, el 21 de las proteínas presentes en las formas y un complejo de proteínas, las células T CD8 glicoproteína de superficie cadena beta (CD8B) Detectado en un formulario único, en los dos tipos de células, sino de la compleja forma de esta proteína estaba presente sólo en las células neuronales (Cuadros 2 y 3; Fig. 2C]. Cada una de las 32 proteínas derivadas de las células de melanoma y neuronales han sido comparados y agrupados de acuerdo a sus medias /-normalizado cantidades (es decir, regulado upregulated o hacia abajo) o en función de su mayor o menor frecuencia de detección (es decir, el número de veces que cada proteína es Detectado en varios puntos de gel). Sin embargo, no ha sido funcional significado implícito en agrupar estas proteínas (Tablas 1, 2, 3].

Los análisis de las funciones fisiológicas conocidas para cada una de las 46 proteínas se indica que 44 de 46 proteínas (> 95%) se expresa en las células neuronales se ha demostrado previamente para ser asociado con las primeras etapas del desarrollo cerebral, y la regulación de la diferenciación del sistema nervioso. Sobre la base de estas funciones biológicas, que hemos propuesto las posibles funciones de estas 46 proteínas de señalización en las respuestas antivirales, la detención en el crecimiento de las células tumorales, la modulación de las membranas celulares y en la alteración de las vías de transducción de la señal de malignidad a principios de la neurogénesis y la diferenciación celular (Figura 3].

Antiviral respuestas y detención en el crecimiento del tumor

La primera línea de defensa contra la infección por el virus de la RD114 comienza con cambios conformacionales en el melanoma membrana celular debido a la unión de glicoproteínas de la cubierta del virus a su receptor, la NAA transportador de proteína [4]. La presencia de metalloprotease / aminopeptidasa (AMPN) en la superficie de células de melanoma puede aumentar la formación de heterodimer autoridades aeronáuticas nacionales ya que es transportada desde el N-terminal de proteínas [7]. El número de víctimas-como el receptor-4 (Tl-4) reconoce los cambios en el patrón de proteínas de membrana y desencadena la inmunidad innata mientras que el antiviral se activan a través de las respuestas de novo expresión de interferón gamma (ING), en presencia de factor de necrosis tumoral (TNF5) y Interleuquina-1 beta de la enzima de conversión (ICE1) que ya estaban presentes en las células del melanoma (Fig. 2A y 2C]. Esto activa la síntesis de novo de los receptores de IL-1 beta (IL-1B), IL-2 receptor de la cadena alfa (IL2A) e IL-6, todos los cuales producen anti-tumorigénicos y respuestas inflamatorias. Co-expresión de ING, IL-6 y otros de nueva síntesis de citoquinas induce proteasas (AMPN, ICE1 y VI dipeptidyl peptidase (DPP IV/CD26) para activar estas proteínas funcionalmente por división [7]. Una serie de interacciones son iniciadas por el Activado IL-1B e IL-6, hacia la supresión de la actividad de metástasis de melanoma y detener el crecimiento de células [8, 9]. En este momento, las otras dos proteínas CDNA / p21 y MM07 que son esenciales para el crecimiento tumoral y las metástasis son, respectivamente, y downregulated No se detectan en transeuropeas de células diferenciadas neuronal es decir, después de la exposición de gato a las células del melanoma RD114 virus (Figura 2B]. Represión de estas proteínas se asoció a la expresión concurrente de tumor supresor de la proteína P53 como una sola proteína en las células neuronales indica su Efecto inhibidor sobre el crecimiento tumoral (Figura 2C *). Por lo tanto, el antiviral respuestas de los recién inducida por citoquinas y las proteínas reguladoras del crecimiento afecta a la detención del crecimiento de las células tumorales que, a continuación, activar la producción de factores neurotróficos que alteran las vías responsables de la modulación de la neurogénesis .

La activación de cinasas, enzimas de regulación neuro-y factores neurotróficos

Tanto la IL-1B e IL-6 son capaces de múltiples citocinas necesarias para la activación de cinasas fosforilación de factores que intervienen en la transcripción de nuevos genes, la síntesis de nuevas proteínas, o la regulación a la baja regulación de las proteínas que muchos existentes para mejorar las señales de supresión tumoral Y la neurogénesis. La quinasa citoplásmica de la IL-6 actúa sinérgicamente para estimular la producción de otras cinasas y los receptores en un ligando de forma independiente [10]. Además, el Pim1 serina / threonine quinasa se expresa como un solo complejo por no exclusivamente de proteínas en las células neuronales (Fig. 2A *; Cuadro 1 grupo A). Esta quinasa fosforila proteínas nucleares y dendríticas en compartimentos de las neuronas estimuladas y cuanto sea necesario para la potenciación a largo plazo de estas células [11]. El rojo-sensibles opsin receptor (OPSR) que normalmente se encuentra en la retina varillas se expresa de novo en las células neuronales transdifferentiated después de la exposición de las células del melanoma con el virus RD114 (Figura 2A]. Esta es la proteína de membrana integral fosforilados en la mayoría de sus residuos de serina y threonine presente en su C-terminal [12]. Es posible que las proteínas que son fosforilados en la serina o threonine residuos también pueden ser fosforilados en residuos de tirosina en el pH ácido y estos pueden generar diferentes vías neurogenerative [8].

Mientras tanto neuronales y células de melanoma expresó el mástil / células madre receptor del factor de crecimiento tirosina cinasa Kit (C-Kit), la frecuencia de detección de esta quinasa fue significativamente mayor en comparación con las células neuronales melanoma (Fig. 2C]. Co-expresión de c-Kit con IL-6, IL-2A y la IL-B en transeuropeas de células diferenciadas puede retardar más el crecimiento del tumor mientras que la promoción de la señalización celular, la diferenciación y la potenciación de sinapsis en conjunción con otras proteínas. La tirosina quinasa del receptor de membrana (KFMS) para el factor estimulante de colonias de macrófagos-1 (CSF-1) se expresó exclusivamente en las células neuronales y esta proteína se ha demostrado que la protección de la degeneración de las células neuronales [13, 14]. La FES proteína tirosina quinasa ya estaba presente en las células del melanoma en el momento de la trans-diferenciación y este proto-oncogen ha sido implicado en la diferenciación morfológica de las células neuronales [15]. Las señales producidas por IL6 y otras citoquinas activar cerebro-factor neurotrófico derivado (BDNF *), una proteína intracelular crítico para las interacciones proteína-proteína que se traducen en el desarrollo, la diferenciación, la plasticidad, y la regeneración de la red neuronal en el cerebro [15]. BDNF Recientemente se ha demostrado que son críticos para la auto-reparación neuronal tras la isquemia debido a un derrame y contribuye a la recuperación funcional de las neuronas [16 - 18].

BDNF se une a la tirosina quinasa del receptor con una afinidad elevada [19]. También puede auto-phosphorylate y activar otras moléculas de señalización. En nuestro modelo de sistema de BDNF se sobre-expresan en transeuropeas de células diferenciadas y que se detectó en ambos lugares gel como una sola proteína y, en forma de complejos (Tabla 2: Figura 2C]. Concurrencia de expresión de varias quinasas, citoquinas y factores de crecimiento en las células neuronales parece haber fortalecido una red de interacciones proteína-proteína entre las diferentes proteínas presentes en la célula. Esto es evidente por la detección de un gran número de detergente soluble en complejos de las proteínas en estas células (Fig. 2A, B & 2C].

Los análisis de todos los complejos de proteínas que contienen BDNF (Fig. 4A y 4B] indicó que 4 de 5 complejos (80%) en las células neuronales y sólo 1 de 7 complejos (14%) en el melanoma interactuó con tirosina cinasa Kit (p = 0,072 basada en 2 caras prueba exacta de Fisher). Es interesante señalar que el 1 de los 5 complejos de BDNF en las células neuronales que no contenía Kit (no se muestra en la Fig. 4], se encontró que se asocia con ZP3, y PDGB TL-4 que actúa como un adaptador similar a la proteína Para BDNF indicando que se trataba de autophosphorylated en el complejo sin el Kit. Esta interacción no sólo BDNF estimula la actividad de estas proteínas, pero en conjunto aumentar la duración de la neurites [20, 21]. Aunque el significado biológico de todas las recuperadas de los complejos neuronales y células de melanoma no está claro aún, nuestros datos sugieren que la mayoría de los complejos solubles detergente que hemos aislado representan funcionalmente activo al azar en lugar de agregados de proteínas.

La producción de BDNF estimula la expresión de la acetilcolinesterasa (ACES), una enzima de vital importancia para neurite formación y la transmisión de las señales tanto en el simpático y parasimpático armas del sistema nervioso [22]. Expresión de ACES en células gliales se ha asociado con la inducción de prión (PRIO), proteína presente en la mayoría de las células nerviosas [23]. Sin embargo, desde PRIO ya estaba presente en las células de melanoma y ACES se expresó sólo después de la infección por el virus de RD114, indica que ACES no induce PRIO en estas células neuronales (Fig. 2A y 2C]. BDNF también activa los beta-2 receptores adrenérgicos (B2AR) en células neuronales y promueve las interacciones proteína-proteína por una mayor unión de diferentes quinasas, que desencadenan astrogliosis y supervivencia de células neuronales [24].

Ambos beta-hexoaminidasa (HEXB) y la lipoproteína lipasa (LIPL) se expresaron de nuevo en transeuropeas de células diferenciadas (Figura 2A]. Estas enzimas no sólo retardar el crecimiento de células de cáncer pero también son fundamentales para la remodelación sináptica en el cerebro y afectar a la diferenciación de las células neuronales, respectivamente, [25 - 27]. El tejido inespecífico de isoenzimas de la fosfatasa alcalina (PPBT) se expresó con alta frecuencia. Este marcador de células neuronales se une a la proteína prión, y aumenta la plasticidad de la neurotransmisión y de desarrollo [28]. Aunque PPBT se expresó tanto en melanoma y células neuronales su frecuencia de detección fue significativamente mayor en las células neuronales en comparación con las células del tumor (Fig. 2 C]. Otra importante enzima arilsulfatasa (ARSB) que desulfates post-translationally las proteínas y las hace más funcionales con frecuencia se expresa en las células neuronales en comparación con melanoma. Esta enzima es importante para el nuevo desarrollo de células gliales y las neuronas en el cerebro y no en células maduras [29].

El piruvato kinasa isoenzima M1 (KPYM) fue downregulated en transeuropeas de células diferenciadas, pero su presencia se considera importante para las terminaciones nerviosas [30]. Igualmente establecen la regulación de factor neurotrófico-3 (NT-3) en las células neuronales es notable ya que este factor es necesario para el desarrollo de las neuronas maduras y entéricas sistema nervioso, pero no es esencial para la generación de nuevas células diferenciadas neural [31] . Sin embargo, la presencia de la NT-3 se ha informado de que es fundamental para mejorar el potencial invasivo de las células tumorales de estos [17]. El glutamato decarboxilasa 67 (DCE1) es una enzima clave reguladora de la actividad neurogénica inducida por factores neurotróficos [32] y la polycomb complejo BMI1 proteína es necesaria para la renovación de células madre [33], junto con Kit, PDGB, NT-3, BDNF y otros .

Uno de los más frecuentemente detectado proteínas de la membrana celular, en tanto las células del melanoma y neuronal fue la integrina VLA-4 I subunidad beta (ITB / CD29). Esta proteína está presente en las dos únicas y complejas formas, en ambos tipos de células (Fig. 2C]. Integrinas son receptores de la superficie celular con múltiples dominios que se unen a numerosos ligandos y de la transducción de señales a través de una cascada de eventos intracelulares que ayudan en la elaboración de láminas en el sistema nervioso central [34]. En particular, Kit y beta-1 integrinas colaboran en la modulación de las funciones celulares [35]. Durante la neurogénesis, la síntesis y la movilidad de la integrina se incrementa por la presencia de ambos BDNF y PDGB [36, 37]. Estas proteínas también redistribuir la transferrina (TFR1) a las membranas de las neuronas inmaduras, un proceso esencial para la formación de neurite, axonal crecimiento de las células y para la regulación de la producción de IL-1B [38, 39].

El sarcoplásmico / retículo endoplasmático calcio ATPasa 2 (ATA2) se detectó la enzima con una alta frecuencia en ambas neuronales y células de melanoma y de sodio / calcio intercambiador 1 (NAC1) una bomba de la membrana plasmática se expresó en una frecuencia ligeramente mayor en las células neuronales que en el melanoma (Fig. 2C]. Ambas proteínas son esenciales para el desarrollo neurológico, la regulación de la concentración intracelular de calcio y el mantenimiento de la plasticidad y la sinapsis, [40].

Expresión de los diferentes isómeros de la zona pelúcida (ZP2, ZP3 y ZP4), en tanto neuronales y células de melanoma es totalmente imprevista. Aunque la función exacta de estos espermatozoides vinculante de los receptores de proteínas en las células de melanoma o neuronal se desconoce, los informes recientes sugieren que ZP dominios en particular los de ZP2 que es upregulated células neuronales en la transducción de señales intracelulares necesarios para la polimerización de las proteínas neuronales en filamentos necesarios para mecano - Sensorial dendritas [41, 42]. También es posible que ZP proteínas pueden participar en la formación de extensiones multipolar en transeuropeas de células diferenciadas en los primeros meses de neurogénesis. Phosducin (PHOS) es una proteína abundante sensorial y opsin, es una proteína de color rojo-sensible expresado en la retina barras, sinapsis y células visuales [43]. Expresión de estos dos neuro-sensorial proteínas pueden participar en la transducción de la señal en neurogénica transeuropeas de células diferenciadas.

Conclusión

Hemos demostrado que la infección por el virus de RD114 gato de las células del melanoma induce un repertorio de nuevas proteínas que suprimen su tumorigénicos potencial neuronal y promover la diferenciación celular in vitro. A nuestro entender, esta es la primera demostración de que la epigenética estímulos de la superficie celular de una forma natural neurogenética melanoma puede generar señales que pueden alterar el genoma a nivel transcripcional y traduccional programas tales que sus vías son oncogénicos detenido y pro-neuronales auto-regulador Se impulsó hacia mecanismos de diferenciación celular neuronal.

Por inmunohistoquímica numerosos marcadores de los tumores de células neuronales (proteína S-100, neurofilamentos, antígeno epitelial de membrana, Leu-7 (CD57), enolasa neuronal específica, neuro-péptido sustancia P, la baja afinidad del receptor del factor de crecimiento nervioso (p75NGFR), neural Molécula de adhesión celular (CD56/N-CAM) y el crecimiento de asociados phosphoprotein-43) han demostrado mejorar el potencial de los melanomas malignos y neuronal de células derivadas de tumores [44 - 46]. Además, peripherin, una intermedia de filamentos de la proteína se expresa en la transición de una célula neuronal a un fenotipo de células Schwann y durante la maduración normal de melanocitos epitelioide o nevus melanocíticos [47]. Sobre la base de la tinción inmunohistoquímica, muchos diferentes tipos de tumores, como melanomas neurotrópica o desmoplásico, neuroepitelial y tumores malignos de células granulares también se han agrupado como maligno de vaina nerviosa periférica tumores [48]. Ninguna de estas proteínas se detectó en el melanoma o trans-diferenciadas las células neuronales que hemos estudiado. Esto puede deberse a que nos hemos centrado principalmente su atención en las proteínas y los perfiles (upregulated, abajo regulados o novo expresado) que distinguir muy melanoma maligno de células de su homólogo transeuropeas diferenciadas las células neuronales. Nuestros estudios de la proteómica también destacar que si bien un número importante de las proteínas expresadas son compartidos entre los dos tipos de células, distintas interacciones proteína-proteína son operativos en la alteración de señales que conducen hacia las células tumorigénicos o neurogénica vías.

Expresión de> 69% de la línea germinal o sensoriales asociados neurogénica señalización de las proteínas neuronales específicos de las enzimas, citoquinas, neurotrófico / factores de crecimiento, serina, tirosina quinasas y threonine gato en las células del melanoma, así como en transeuropeas de células diferenciadas homólogo, apoya Las células madre de origen de este tumor y sugiere que el precursor de este melanoma es un tallo similar a la célula en lugar de la primitiva melanoblast comprometido con la diferenciación sólo melanocíticos. Estas células son únicas en el sentido de que son plenamente diferenciadas (pigmentada) y que tienen la capacidad de dar lugar a nuevos tipos de células que expresan proteínas específicas de la diferenciación. Además, estas células expresan muchas proteínas implicadas en la auto-renovación de las células. Estas células madre son el receptor del factor de crecimiento de proteína (C-Kit), PDGB, BDNF, NT-3, polycomb proteína 1 y otros. Recientemente, BMI1 ha demostrado ser indispensable para la ejecución eficiente auto-renovación de células troncales neurales [34, 49]. Como puede observarse en la Fig 2C, IMC 1 y otras proteínas que participan en auto-renovación se expresan tanto en melanoma y trans-diferenciadas las células neuronales, pero son de upregulated en células neuronales. Desde ambos melanocitos y células neuronales deriva de la cresta neural del embrión nuestros estudios indican que CT1413 melanoma es un tumor de células madre.

En base a nuestros resultados también se puede especular con que una alta incidencia de los melanomas cutáneos y nevus melanocíticos atípicos en pacientes con hereditarios neurofibroma, astrocitoma, glioma, meningioma, y otros tumores neuronales [50], también pueden surgir debido a la expresión o represión de los De células madre embrionarias específicas de las proteínas en estas células. Correlación fenotipos celulares de la firma con los patrones de proteínas en respuesta a los cambios ambientales o epigenética sería ahora crítico en el establecimiento de definiciones para la clasificación molecular clínicamente relacionados con los tumores.

Para obtener una mejor comprensión de los complejos procesos de oncogénesis o neurogénesis, también sería importante para identificar las proteínas en diversos entornos biológicos naturales ya que la mayoría de las proteínas sustrato son cleaved por proteasas antes de las interacciones enzima. La definición de la especificidad de los objetivos naturales puedan arrojar luz sobre cómo se logran las peculiaridades biológicas en la naturaleza. Este modelo de sistema ofrece una oportunidad única para estudiar los perfiles de proteínas específicas en relación con las interacciones ligando vinculante que son capaces de inducir cambios genéticos o fenotípica en estas células. Caracterización de la interacción proteína-proteína dominios mediante el uso de constitutivamente activa y predominantemente negativos construye y selección de los pequeños péptidos o interferencia ARN's proporcionará nuevos conocimientos en importancia funcional de cada una de las proteínas que las células directo hacia distintas vías (es decir, frente a oncogénicos neurogénica). Estos estudios también tienen importantes implicaciones clínicas para la comprensión neurogenerative neuroprotectores y mecanismos de las enfermedades neurológicas ya que activan las proteínas pueden inducir cambios en subunidades de proteínas en una célula de tipo específico. Esta información podría ayudar en la identificación de inhibidores selectivos de los tumores y activadores o co-activadores neurogénica de las proteínas implicadas en el desarrollo de las células neuronales.

Materiales y Métodos
Cell Cultures

Un gato línea de células de melanoma (CT1413) fue creado in vitro de un tumor metastásico y melánica de pulmón [2]. Las células fueron cultivadas en medio mínimo esencial (MEM) con 10% de suero fetal bovino y 2 mM de glutamina (crecimiento medio) y se chapada en 36 frascos (75 cm 2), a una densidad de 2 × 10 6 células / frasco en medio que contiene 2-ug/ml polybrene [2]. Después de las 24 horas, se eliminó el medio de cultivo fresco y RD114 medio de cultivo que contenga virus se añadió. RD114 es un retrovirus endógeno originalmente derivados del cerebro de un joven gato y crecido en células de rabdomiosarcoma humanos [51]. Este virus se replican en una amplia gama de células de mamíferos y no provoquen ninguna patología en gatos sanos o en culturas derivadas de células embrionarias cat in vitro [52]. El RD114 virus se añadió al 12 frascos con una multiplicidad de infección (MOI), de 1 y otro conjunto de 12 culturas expuestos a MDI fue de 0,25. Un conjunto adicional de 12 frascos de células de melanoma cultivadas fue sin el virus como los controles no infectados. Después de 48 horas después de la infección por el virus, las culturas expuestos a MDI, de 1 mostró la morfología celular neuronal y este experimento fue altamente reproducible [3].

Para validar la proteína dos perfiles independientes de cultivo de células de experimentos se llevaron a cabo casi 12 meses y proteomes aparte de los dos tipos de células se analizaron por separado para los perfiles de expresión diferencial.

Estudios Proteómica

Las proteínas se extrajeron de 12 frascos cada una de las trans-diferenciada y de las células de melanoma de cada uno de los dos experimentos. Las células fueron lavadas 3 × con buffer fosfato salino (PBS) para eliminar el suero y otras proteínas, y 2 × 10 7 células de cada grupo experimental y el control de las células del melanoma fueron retirados por el uso de un celular o un rascador "policía de goma" ; (Es decir, no tratadas con tripsina para separar las células). Cada celda de pellets se lavan de nuevo con 2 × PBS y de las proteínas se extrajeron secuencialmente por un modificado en dos etapas solubilización procedimiento utilizando dos reactivos que contienen diferentes concentraciones de 5-8 M Urea, 2% -4% CHAPS, 2 M thiourea y otros no Iónico y / zwitterionic detergentes (BioRad kit de extracción secuencial CA, EE.UU.). La mayoría de las proteínas solubles en la membrana se eliminaron en la primera extracción y menos proteínas solubles, se dividieron en la segunda fracción. Con el fin de aislar las proteínas tan cerca de sus estados naturales en las células de lo posible, cada paso solubilización fue modificada por la técnica de lisis rápida (sólo 10-15 segundos de lisis celular con 2 segundos de sonicación), seguido de centrifugación de 90 minutos a 100000 × G antes de que el análisis de proteínas solubles presentes en el sobrenadante por centrándose isoeléctrico (IEF).

Todas las fracciones proteínicas de melanoma controles y trans-neuronal células diferenciadas fueron analizados por separado por 2 dimensiones electroforesis en gel (2DGE). En la primera dimensión proteínas fueron separadas por la FEI en un gradiente de pH 3-10 y luego el tamaño fraccionado en la segunda dimensión de 6-18% gradiente de geles de poliacrilamida-SDS. Las proteínas fueron teñidas con azul de Coomassie y por la utilización de un CCD de la cámara y una imagen de procesamiento analítico programa (PDQuest de BioRad) todas las proteínas se evaluaron los puntos de cada uno de los 15 geles (9 geles desde el primer experimento y 6 geles de la segunda Experimentos). Este programa compara la calidad y cantidad de cada normalizado in situ a través de 15 geles y crea un modelo de imagen de gel bien calibrado y cuantificables los puntos internos de referencia utilizando las proteínas. Un maestro de gel que contiene 3129 lugares se utiliza para comparar cada uno de los puntos correspondientes en todos los geles derivados de los controles de melanoma y trans-neuronal de células diferenciadas. Todos expresaron diferencialmente (es decir upregulated y abajo regulados) se identificaron las proteínas en el gel y 467 cada uno de los puntos incluidos algunos puntos comunes a los dos tipos de células fueron extirpados de múltiples geles. Las proteínas son digeridas usando ultra-pura y tripsina péptido huellas digitales de cada uno en asimilar-gel se analizaron por MALDI-TOF-MS. Completo escaneo espectros de masa fueron adquiridas y de gran precisión la masa criterios se utilizan a lo largo del estudio con una alta resolución y la estricta especificidad de tripsina. Spectra se presentaron a la base de datos de proteínas (SWISS-PROT) para buscar la identificación de proteínas. Además de utilizar estos criterios estrictos, hemos utilizado manual de adquisiciones de espectros, que arrojaron más confiable y reproducible automatizado de los resultados en comparación con las adquisiciones de software utilizando PS1. El nivel de confianza en nuestra determinación de proteína fue alto debido a que casi todas las proteínas se han confirmado en los puntos correspondientes en varios geles y por la duplicación de todo el experimento de validación. En este estudio se incluyeron únicamente las proteínas que son más reproducibles de alta en la base de datos de proteínas rigor felina y los resultados se han confirmado en otras especies de mamíferos (SWISS-PROT). Hasta el momento hemos identificado 46 proteínas entre los 302 puntos de múltiples geles probado. Todos los lugares en los que no se identificaron las proteínas por espectrometría de masas y reproducen de la misma o de diferentes geles NO fueron incluidos en cualquier análisis.

Los análisis estadísticos

La distribución de frecuencias entre el melanoma y las células neuronales se compararon mediante la prueba de Chi-cuadrado o 2 caras prueba exacta de Fisher. La cantidad media de cada proteína se comparó entre el melanoma y el uso de células neuronales de Mann-Whitney la suma de rangos de los ensayos y la probabilidad de ocurrencia de una proteína en la diferenciación neuronal trans-versus las células del melanoma se examinó sobre la base de la probabilidad de distribución binomial con una proporción esperada Menos de 0,05.

Conflicto de Intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

Agradecemos a los Dres. S. Martin y JP. Faulon de los Sandia National Laboratories, Albuquerque, NM, de la lectura del manuscrito y su entusiasmo acerca de esta investigación, los estudiantes de verano 2003-2204 (Steve Doo, Chrissy Hsiao, Arti Ayer, Arvan y Alex Chan Lau, por su asistencia técnica y emoción mientras La realización de experimentos in vitro; David Wei y Arpan Patel para búsquedas en la literatura para el análisis de proteínas y funciones de los complejos de proteínas; Vicky Moreno de asistencia en la preparación de la Figura 1A y 1B Elizabeth Parra y de la preparación de los cuadros. Rasheed La Dotación de los Fondos de Investigaciones y el apoyo a esta investigación USC .