Cancer Cell International, 2005; 5: 8-8 (más artículos en esta revista)

Receptor de andrógenos es necesaria para la señalización de andrógenos humanos sensibles a la proliferación de células de cáncer de próstata y la supervivencia

BioMed Central
Yang Qing (qing-yang@ouhsc.edu) [1], Kar-Ming Fung (karming-fung@ouhsc.edu) [2], Wanda V Día (wanda-day@ouhsc.edu) [2], Bradley P Kropp (brad-kropp@ouhsc.edu) [1], Lin Hsueh-Kung (hk-lin@ouhsc.edu) [1]
[1] Departamento de Urología de la Universidad de Oklahoma Centro de Ciencias de la Salud, Oklahoma City, OK, EE.UU.
[2] Departamento de Patología de la Universidad de Oklahoma Centro de Ciencias de la Salud, Oklahoma City, OK, EE.UU.
[3] Departamento de Asuntos de Veteranos Medical Center, de Oklahoma City, OK, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Los andrógenos y los receptores de andrógenos (AR) regular el normal desarrollo y crecimiento de la próstata. También están involucrados en el desarrollo patológico de las enfermedades de la próstata, incluyendo la hiperplasia prostática benigna (HPB) y cáncer de próstata (CaP). Antiandrogen terapia de CaP, junto con la castración química o quirúrgica, ofrece respuestas positivas inicial y conduce a la muerte celular masiva de próstata. Sin embargo, las células cancerosas más tarde aparecer como independiente de andrógeno-CaP. Para investigar el papel de la AR en la proliferación de las células de próstata y la supervivencia, que presentó un vector basado en pequeños RNA de interferencia (ARNsi). Este ARNsi orientados 5'-sin traducir región de AR mRNA durante largos supresión de la expresión en AR andrógenos sensibles a las células humanas de próstata LNCaP.

Resultados

El diseño ARNsi reprimidas con éxito endógeno AR expresión, como lo revela el Western Blot y la tinción de inmunofluorescencia en células LNCaP. LNCaP células no proliferan en ausencia de AR, y se les realizó la apoptosis, elevada sobre la base de fosfato Histone H2B expresión y de mayor número de apoptosis en comparación con el órgano de control de las células.

Conclusión

Hemos demostrado que la AR es de vital importancia para la proliferación de las células de próstata y la supervivencia en este andrógeno-sensibles línea celular de próstata. Estos resultados fortalecer aún más la hipótesis de que la AR puede ser una diana terapéutica para el tratamiento de andrógenos sensibles a las fases de CaP. A diferencia de antiandorgens, sin embargo, la orientación ARNsi AR proporciona una inactivación directa de AR función a través de la supresión de la expresión de la proteína AR.

Antecedentes

Los andrógenos son fundamentales para el desarrollo y crecimiento normal de la próstata. Ellos también son responsables del desarrollo de enfermedades de la próstata, incluyendo la hiperplasia prostática benigna (HPB) y cáncer de próstata (CaP). Los receptores de andrógenos (AR), la transducción de señales de andrógenos en células de la próstata para regular el desarrollo fisiológico y patológico de la glándula [1]. Es clásico que caracteriza después ligando vinculante [5 principalmente α-dihidrotestosterona (5 α-DHT)]-AR el ligando del receptor de proteínas asociadas con el complejo translocates en el núcleo, se une a la secuencia consenso de los elementos de reacción de andrógenos (AREs) [2], y Regula los genes de respuesta de andrógenos (ARGs) las expresiones [3]. Condiciones anormales que activar AR transeuropeas de activación a través de mutaciones AR [4, 5], la amplificación de AR [6], o andrógeno-independiente vías de señalización [7, 8] o puede llevar a ser un resultado del desarrollo de las enfermedades de la próstata o de andrógenos Refractarios CaP.

Clínicamente, la terapia de ablación de andrógenos se utiliza para reducir AR ligando a la producción o el bloque de señalización mediada por AR. Finasteride, el 5 α-inhibidor de la reductasa de tipo 2, se ha utilizado para el tratamiento de pacientes con HBP. Finasterida retrasa la progresión de la HBP reprimiendo 5 α-DHT síntesis [9]. La terapia de ablación androgénica CaP ha logrado gracias a los compuestos llamados antiandrógenos. Los antiandrógenos competir con 5 α-DHT vinculante para la AR y la intención de obstaculizar el AR-señalización mediada. Los antiandrógenos se clasifican, en función de su estructura química, como cualquiera de los antiandrógenos esteroideos (es decir, el acetato de ciproterona o acetato de medroxiprogesterona) o antiinflamatorios no esteroides andrógenos [es decir, nilutamide (Anandron ™), flutamida (Eulexin ™), y bicalutamide (Casodex ™ )] [10]. Por desgracia, prácticamente todos los de los pacientes que inicialmente muestran favorables respuestas al bloqueo hormonal llegar a ser refractarios a este tratamiento [11].

AR ruptura de la señalización ha sido examinado en modelos experimentales para investigar AR-mediada por células de próstata fisiología y fisiopatología. Un oligonucleótido antisentido [12], un martillo robozyme [13], y la microinyección de un AR anticuerpos neutralizantes [14] han sido diseñadas para suprimir o bloquear la expresión AR AR señalización mediada en modelos in vitro. El avance de la interferencia de ARN (RNAi), la tecnología proporciona una herramienta para reprimir la expresión de los genes después de la traducción a través de silenciamiento de genes (PTGS) [15]. Esta tecnología utiliza el dúplex ARN interferentes pequeños (siRNAs), de unos 19-23 nucleótidos para reprimir la expresión de los genes homólogos [16, 17]. Wright et al. Informó de una utilización con éxito de una doble varados sintéticas (ds) ARNsi endógenos para suprimir AR expresión en las células LNCaP [18]. En este estudio, hemos establecido un vector plásmido ARNsi basada en la construcción de la orientación 5'-región sin traducir (5'-UTR) de la AR en la misma línea celular de próstata. Hemos logrado con éxito en silenciar AR LNCaP células, y además demostró que estas células pueden proliferar ni tampoco sobrevivir en ausencia de la AR. Llegamos a la conclusión de que AR señalización es necesaria para la proliferación de las células de próstata y la supervivencia, al menos en los estados de andrógeno-sensibles. Específicas de bloqueo de la AR AR expresión y de señalización mediada es necesaria para el éxito del bloqueo hormonal en pacientes con enfermedades de la próstata. Además, el vector basado AR silenciar diseño proporciona una herramienta para el estudio AR-genómicos asociados y no genómica y efectos de encontrar posibles vías transversales que hablar con AR.

Resultados y discusión

Para determinar la función de AR y AR-positivo, de andrógeno-sensibles células LNCaP, hemos diseñado un vector basado en el plásmido ARNsi construir para lograr "a largo plazo" AR silenciar. Esta figura la construcción de la U6 promotor impulsado por sentido y antisentido capítulos de AR ARNsi que tienen una señal consistente en la terminación de 6 thymidines. Esta construcción también incluyó una constitutivamente expresado CMV promotor impulsado por la proteína de fluorescencia verde (GFP), designado pSiAR-EGFP (Fig. 1]. Porque hay un efecto adverso en andrógenos sensibles a la proliferación de las células de próstata en ausencia de la AR [12, 14, 18], la inclusión de la CMV promotor impulsado por las buenas prácticas agrarias expresión pueden ser utilizados para seleccionar y enriquecer AR-negativos después de las células LNCaP Transfección. A construir, de nombre pSiCon-EGFP, se estableció con una secuencia codificada de AR meta y sirvió como control. A las 16 horas tras la transfección, GFP se expresó detectable y en virtud de un microscopio de fluorescencia (datos no presentados).

Plásmido ARNsi construir orientación 5'-UTR de AR AR reprimida expresión mRNA en células LNCaP

Para determinar si el pSiAR-EGFP construir fue capaz de expresar ARNsi, suprimiendo así la AR LNCaP expresión en las células, las células fueron transfectadas con pSiAR-EGFP o con pSiCon-EGFP construir. AR expresión está controlada por estas células con tinción de ratón anti-humano AR anticuerpo monoclonal. Inmunocitoquímico tinción de las células LNCaP mostraban que partes de las células transfectadas con pSiAR-EGFP plásmido no detectables AR expresión, mientras que las células transfectadas con pSiCon-EGFP siguieron mostrando AR expresión en todas las células (Figura 2A]. Sin embargo, a las 2 semanas siguientes transfección, no era detectable GFP-AR-positivo o negativo en las células LNCaP la pSiAR-EGFP transfectadas grupo (datos no presentados). Esto sugiere que o bien la pérdida de sus células transfectadas pSilencer plásmidos, o que las células que reciben la pSiAR-EGFP podría, de hecho, no sobrevivir en ausencia de la AR.

Para demostrar que las buenas prácticas agrarias puede ser utilizado como un marcador para la selección de AR-negativos células LNCaP, pSiAR-EGFP o pSiCon-EGFP células fueron transfectadas trypsinized 24 horas tras la transfección. GFP-positivas células se obtuvieron a través de una celda AR clasificador para determinar la expresión de la proteína. Western blot no mostró AR detectable en la expresión de la proteína GFP-positivos con células transfectadas pSiAR-EGFP. Sin embargo, las células GFP-positivas que reciben el control pSiCon-EGFP construir siguieron expresando AR proteína (Figura 2B]. Este resultado demuestra que las células son positivas GFP AR negativo células.

El uso de 5'-UTR como un blanco para el diseño ARNsi se ha visto, porque UTR vinculante proteínas y / o traducción de iniciación complejos pueden interferir con ARNsi endonucleasa complejo vinculante [19]. Existen múltiples mutaciones en los casos de CaP ser identificados en todo el AR codificación de las regiones [20 - 22]. Esto hace que la selección de la región de codificación de AR para el diseño ARNsi posiblemente inadecuado e insuficiente para bloquear la expresión de la mutación de CaP en pacientes con AR. Hemos seleccionado tres regiones 5'-UTR de la AR de nuestro diseño ARNsi, y sólo la región entre -25 a -7 pb podría suprimir con éxito AR expresión en las células LNCaP (datos no presentados). Nuestros resultados demostraron que más del ARNsi eficacia de la represión de la expresión de genes varía de una región a otra, debido a la secuencia meta estructuras [23].

AR células LNCaP necesarios para apoyar la proliferación de las células

Para determinar la capacidad de proliferación de células LNCaP en ausencia de AR, la proliferación de las células con y sin clasificación de células se realizó a raíz de la construcción de transfección silenciador. Cuando la proliferación celular se realizó sin la clasificación de células, durante un período de 9 días el pSiAR-EGFP transfectadas las células LNCaP constantemente proliferado más lento que el de sus padres y la pSiCon células-células transfectadas EGFP (Figura 3A]. Después de 9 días en la cultura, de los padres y el control de las células alcanzado confluencia. La reducción de la proliferación celular en pSiAR-EGFP células transfectadas podría reflejar que las células que reciben la AR ARNsi construir no proliferan en ausencia de AR.

Para confirmar AR señalización que se requiere para la proliferación de células LNCaP, GFP enriquecido LNCaP células se obtuvieron a través de la clasificación de células en 24 horas tras la transfección. LNCaP células transfectadas con el pSiCon-EGFP construcción siguió creciendo durante todo el período experimental (Figura 3B]. Esto indica que el silenciador de control de la construcción no afecta a la proliferación celular. Sin embargo, pSiAR-EGFP transfectadas las células LNCaP (GFP-positivo, negativo-AR) no proliferan (Figura 3B], lo que indica que los andrógenos sensibles requieren AR células de la próstata para la proliferación.

AR represión de expresión y de la inactivación de AR en función de las células de próstata se ha logrado mediante el uso de un oligonucleótido antisentido [12, 24], un martillo robozyme [13], y una síntesis de ds ARNsi dúplex [18] a la meta AR ARNm. Microinyección de un AR anticuerpos neutralizantes ha informado también de bloquear AR señalización mediada por células LNCaP en [14]. Recientemente, el uso de vectores basados en la orientación ARNsi AR ha informado de estudiar la participación de AR señalización de la vitamina D en suprimidas crecimiento de las células de próstata [25]. Estos criterios fueron publicados destinados a un silenciamiento de genes en las células diana, y siempre a corto plazo AR eliminación de la expresión. Todos los resultados publicados actualmente están en consonancia con nuestras observaciones de que la interrupción de la señalización AR afecta negativamente a andrógenos sensibles a la proliferación de células LNCaP.

LNCaP células necesarias para mantener la supervivencia AR

Para determinar si las células LNCaP podría sobrevivir sin AR, a fin de determinar los niveles de fosfato histona H2B expresión y el número de apoptosis órgano siguientes AR silenciar. Histon H2B fosforilación se ha demostrado de forma inequívoca asociados a la apoptosis, específicamente en la apoptosis inducida por condensación de la cromatina en células de mamífero [26]. Su expresión aumenta significativamente en las células sometidas a la apoptosis [27]. Uso de Western blot, fosfato histona H2B expresión es su cuantificación en LNCaP células transfectadas con cualquiera de las dos pSiAR-EGFP o pSiCon-EGFP. No había detectable fosfato histona H2B señal en pSiAR-EGFP o control de las células transfectadas a los 4 días después de transfección (datos no presentados). Seis días después de pSiAR-EGFP transfección, sin embargo, niveles elevados de fosfato histona H2B expresión se detectaron en las células LNCaP AR negativo. En ese momento, no había detectable fosfato histona H2B en la pSiCon-EGFP transfectadas las células LNCaP (Figura 4].

Para demostrar que la señalización AR LNCaP es necesaria para la supervivencia celular, el número de células sometidas a la apoptosis (demostrado por la presencia de cuerpos apoptóticos) se determinó en células transfectadas con pSiAR-EGFP y control de las construcciones (Figura 5]. El número medio de apoptosis en los órganos pSiAR-EGFP células transfectadas fue 52,89 por 1000 celdas, frente a 6,53 en 1000 pSiCon-EGFP transfectadas las células (Tabla 1]. La transfección de eficiencia para cada vector no fueron estadísticamente significativos - pSiAR-EGFP fue 17,0% y pSiCon-EGFP fue del 22,9% (Cuadro 1]. Cuando el número de órganos de apoptosis se corrigió para transfección eficiencia, ABI fue 296,2 por pSiAR-EGFP y 29,2 para pSiCon-EGFP transfectadas las células (Tabla 1]. El ABI fue estadísticamente superior en pSiAR-EGFP células transfectadas versus pSiCon-EGFP células transfectadas. Estos resultados demostraron que las células que carecen de AR LNCaP que pasar por el proceso de apoptosis.

Para demostrar que las células LNCaP podría sobrevivir con supresión de transientes de la AR, también realizó AR expresión de la proteína sintetizada mediante un desmontables, agrupados ds ARNsi, ARNsi SMARTpool AR ® (Upstate). Este ARNsi piscina reprimida una mayoría (más del 95%), de AR en la expresión de la proteína en las células LNCaP 16 horas después de transfección, en comparación con las células transfectadas con un no específicos de control de la piscina. Las células se mantienen los niveles de la AR suprimido la expresión de la proteína durante al menos 72 horas tras la transfección. Se reanuda AR expresión, a 20-30% de los niveles normales, después de 72-96 horas después de la transfección (datos no presentados). LNCaP células pueden sobrevivir en ausencia de AR de por lo menos 3-4 días, según lo indicado por la falta de fosfato detectables histona H2B señales en 96 horas después de la transfección pSiAR-EGFP (datos no presentados). Debido a la naturaleza transitoria de la utilización de oligonucleótidos antisentido, martillo robozymes, ds ARNsi duplex, y microinjected anticuerpos neutralizantes contra la AR, la supervivencia celular en la ausencia de AR extendido no puede ser evaluada. Utilizando la combinación de los vectores basados en la entrega ARNsi y el enriquecimiento de AR-negativos células a través de la selección de células GFP-positivo nos permitió estudiar el comportamiento de las células en ausencia de AR durante un largo período de tiempo.

Los antiandrógenos se utilizan para impedir la adquisición de un activo transcriptionally conformación de la AR. La inducción de la apoptosis en células de la próstata tratados con bicalutamide se ha observado [28]. Sin embargo, varios informes indican también que en presencia de bicalutamide, células de la próstata sobreviven en la cultura [29], recuperar el crecimiento de las células después de un largo período de exposición a la antiandrogen [30, 31], y convertirse en un fenotipo más invasivo [32]. Bicalutamide también puede actuar como un agonista de AR, lo que resulta en la estimulación de AR transeuropeas de activación [33]. Además, se ha indicado que bicalutamide próstata puede apoyar la supervivencia celular y la progresión a través de la selección de las células con mutaciones AR [34] o células con una elevada expresión de los factores de crecimiento [35]. Estas mutaciones generan los receptores que responden a los esteroides y otras por el aumento de los antiandrógenos trans trans-activación [4]. Estos resultados sugieren que los antiandrógenos pueden ser insuficientes para bloquear AR señalización de las vías a través de múltiples candidatos.

El potencial uso de la tecnología RNAi ha sido investigado en el campo de la terapia genética [36, 37]. AR orientación de la represión utilizando RNAi podría ser más eficaz y específico que utilizar los antiandrógenos para inactivar AR transeuropeas de activación y apagar ARGs expresión. LNCaP células potencialmente consisten en múltiples linajes de células, debido al desarrollo de múltiples sublines del original células LNCaP [38 - 40]. Aunque todas las células LNCaP transfectadas por la AR ARNsi construir podría sobrevivir ni tampoco proliferan en ausencia de la AR en este estudio, no disponemos de información sobre grupos de población específicos que pueden ser más susceptibles a la transfección y sensible a la ausencia de la AR . El desarrollo de un sistema de prestación de servicios más eficientes, como el lentiviral basado en el sistema de entrega de genes [41], pueden dar cabida a un mayor estudio de AR de señalización en varias líneas celulares de próstata.

Conclusión

Llegamos a la conclusión de que todas las células de CaP, por lo menos en la sensibilidad de andrógenos y AR-positivo etapas, para exigir AR continua proliferación y la supervivencia. La identificación de la vía y AR ARG (s) que la transducción de señalización de andrógenos podría proporcionar un objetivo específico para bloquear andrógenos-activado, AR-mediada crecimiento de las células de próstata. AR dirigido específicamente a los de señalización o de sus moléculas potencialmente se harán efectivos en el logro de bloqueo hormonal total. Con el desarrollo de "largo plazo" ARNsi y eficiente de los sistemas de suministro in vivo, es posible lograr un bloqueo total de AR en la próstata, lo que mejora el tratamiento para los pacientes con enfermedades de la próstata.

Métodos
Establecimiento de AR silenciador plásmido construye

Para establecer un plásmido ARNsi construir fluoresce con marcador de selección, un sitio de clonación múltiple (MCS) fue extirpada de la pSE380 (Invitrogen) utilizando Bcl Iy Hind Hind III. La supervisión, control y vigilancia que contiene este fragmento subcloned en Bam HI y Hind Hind III linealizadas pSilencer 2.1-U6 hygro vector (Ambion) para obtener pSilencer 2.1-U6 MCS hygro. El IRES2-EGFP fragmento de codificación de las buenas prácticas agrarias fue extirpada de pIRES2-EGFP (BD Biosciences Clontech) utilizando Bgl II y Afl II. Este fragmento fue extirpada subcloned en la pSilencer 2.1U6 MCS hygro linealizadas con Bcl Iy Sal I, en presencia de un pequeño adaptador que contiene Afl I en su sitio 5'ends y Sal I en su sitio 3'ends. Este plásmido fue nombrado establecido pSilencer 2.1-U6-IRES2-EGFP. Para crear la construcción de la orientación AR silenciador, dos líneas complementarias de oligonucleótidos dirigidos -25 a -7 pb río arriba del codón ATG transcripción inicio de la AR (GenBank número M20132; Figura 1A] con Bgl II y Sfi I en sus sitios 5 ' Y 3 'termina, respectivamente, fue sintetizada y recocidos. El ds oligonucleótido fue clonado en Bam HI y Hind Hind III linealizadas pSilencer 2.1-U6-IRES2-EGFP. El 19-AR objetivo de la secuencia de nucleótidos se indica en el sentido de la línea de síntesis de DNA ds. El promotor U6 impulsada ARNsi expresa el sentido y antisentido capítulos de AR ARNsi [42] que tengan una señal consistente en la terminación de 6 thymidines [43].

Dado que el promotor SV40 no pueden proporcionar suficientes niveles de expresión en las buenas prácticas agrarias para la vigilancia de las células LNCaP éxito transfección (datos no presentados), el promotor SV40 fue sustituido por cymagalovirus promotor (CMV). El promotor CMV fue extirpada de pIRES2-EGFP con Nsi Iy Xho I, y ligated en Aat II y Xho I linealizadas pSilencer 2.1-U6-IRES2-EGFP. La construcción final fue designado pSiAR-EGFP (Figura 1B]. Control de la construcción también fue creado por clonación una recocidos ds con un fragmento de ADN codificado 19-AR objetivo de la secuencia de nucleótidos, de nombre pSiCon-EGFP. La secuencia codificada de Blast fue objeto de búsqueda para asegurarse de que no coincide con ningún conocido transcripción.

LNCaP cultivo celular, transfección, y la selección de las células transfectadas con la construcción de expresión silenciador AR

LNCaP células fueron adquiridos de ATCC (CRL-1740). Fueron cultivados y mantenidos en medio de cultivo completo que consta de RPMI1640 (Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), 100 unidades / ml penicilina, y 100 μ g / ml estreptomicina (Invitrogen), en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2 A 37 ° C. Transfección de las células con el plásmido silenciador construcciones se realizó ya sea en 60 o 100 mm utilizando placas de cultivo de tejidos Lipofecamine 2000 (Invitrogen) cuando las células alcanzado el 80-90% confluencia. En pocas palabras, para transfección en placas de 100 mm, 24 μ g de ADN plásmido y 60 μ l de reactivo de transfección Lipofecamine 2000 fueron diluidos por separado en 1,5 ml de OPTI-MEM (Invitrogen). Posteriormente fueron combinados, y incubados a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla se agregó a las células LNCaP, en presencia de 10 ml OPTI-MEM (Invitrogen). El medio libre de suero fue sustituido por el completo crecimiento de mediano 4-6 horas después de transfección. El día de transfección se definió como el día 0. Para seleccionar las células que recibieron el silenciador construye, LNCaP células fueron trypsinized a las 24 horas después de transfección (día 1). GFP-positivas LNCaP células fueron obtenidos mediante MoStar de células del sistema de clasificación. Para determinar el índice apoptótico, transfección eficiencia se calculó a las 24 horas después de transfección. Un total de 1000 células fueron seleccionados al azar con un microscopio de fluorescencia equipado con filtros de 2-3 campos. Los porcentajes de células que expresan GFP se denomina "transfección eficiencia". La transfección eficiencia promedio se calculó a partir de tres experimentos independientes para cada plásmido transfección.

Inmunocitoquímico AR en la tinción de las células LNCaP

Para demostrar que la AR puede construir silenciador plásmido reprimir AR expresión en las células LNCaP, a las 24 horas después de la transfección las células se re-sembrado en la cubierta se desliza en 24 placas de cultivo de tejidos y en la densidad de 2000 células /. Las células se incubaron durante la noche para la adhesión. Fueron secuencial fijo en metanol durante 10 minutos y acetona durante 1 minuto. Las células fueron entonces permeabilized con 0,2% tritón-X-100 (Simga) en 1x buffer fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente durante 20 minutos. Tras la incubación con 10% de suero de cabra en PBS 1x para bloquear no específicas, las células fueron incubadas durante 1 hora con otro ratón anti-humano AR anticuerpo monoclonal (1:100; NOVOCastra) en 1x PBS con 10% de suero de cabra. Después de tres lavados con PBS suplementado con 0,5 mM CaCl 2 y MgCl 2, las células fueron incubadas con Alexa Fluor ® 594-conjugado de cabra anti-ratón IgG (1:200; Molecular Probes) secundaria de anticuerpos. Para la tinción de los núcleos, las células fueron incubadas con 0,1 μ g / ml 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole clorhidrato (DAPI) a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las imágenes fueron capturadas por microscopía fluorescente (BX51, Olympus) equipado con el software SPOT (Instrumento de diagnóstico).

La extracción de proteínas y Western blot

Western blot se realizó un análisis para determinar los niveles de AR y fosfato histona H2B expresión en las células LNCaP transfectadas con el silenciador construye. Para determinar los niveles de expresión de la AR, pSiAR-EGFP y control transfectadas GFP-positivas LNCaP células se obtuvieron a través de células de clasificación. Ellos fueron lisadas con buffer de lisis celular que consta de 5 mM EDTA, 0,5% Tritón-X-100, y 0,1 mM phenylmethylsulphonylfluoride (PMSF) en 1x PBS a 1 μ l/10 4 células. Total de extractos celulares fueron recolectados después de la centrifugación. Se determinaron las concentraciones de proteína por bicinchoninic ácido (BCA) kit de ensayo de proteínas (Pierce). Alícuotas de 20 μ g de la proteína extractos fueron separados el 10% Tris-HCl gel (Bio-Rad). Las proteínas fueron transferidas a membranas PVDF (Bio-Rad). AR proteína se detectó al incubar las membranas con el ratón anti-humano AR anticuerpo monoclonal (1: 500) a temperatura ambiente durante 2 horas. Esto fue seguido de la peroxidasa de rábano (HRP)-conjugado IgG anti-ratón (1:125000; KPL) secundaria de anticuerpos de incubación a temperatura ambiente por una hora. Inmunorreactivas proteína fue con la mayor quimioluminiscente (ECL) reactivo (Pierce), según el protocolo del fabricante.

Para determinar los niveles de fosforilación de la histona H2B en LNCaP células en ausencia de la proteína AR, las células fueron transfectadas con cualquiera de las dos pSiAR-EGFP o control de la construcción, tal como se describe. Celular proteínas se extrajeron con ácido extracción de amortiguación compuesto por 10 mM Hepes (pH 7,9), 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM KCl, 0,5 mM de TDT, y 1,5 mM PMSF en presencia de 0,2 M de ácido clorhídrico. Este fue completado de acuerdo a los procedimientos establecidos por el proveedor de anticuerpos (Upstate). Proteínas solubles se obtuvieron de sobrenadantes después de la centrifugación a 11000 × g durante 10 minutos. Proteínas de la noche a la mañana fueron dializados contra agua destilada. Alícuotas de 30 μ g de proteínas fueron preparados de cada muestra, separados en 4-20% gradiente de geles de Tris-HCl (Bio-Rad), y transferidos a membranas PVDF. Después del bloqueo no específicas, las membranas se incubaron durante la noche con conejo anti-fosfato histona H2B S (14) anticuerpo (1:500; Upstate) a 4 ° C. Esto fue seguido de un HRP-conjugado IgG anti-conejo (1:10000; Señalización Celular) secundaria de anticuerpos de incubación seguido de la detección ECL.

La proliferación de las células de ensayo

La proliferación de las células de ensayo se determinó en pSiAR-EGFP y pSiCon-EGFP transfectadas las células LNCaP. A las 24 horas tras la transfección, se sembró ya sea directamente en placas de cultivo de tejidos o células sometidos a la clasificación de las buenas prácticas agrarias para recolectar las células positivas antes de la siembra de células. Las células fueron sembradas en placas de 96 pozos a 1000 células /. La proliferación de las células se determinó a través de la proliferación de las células de ensayo XTT kit (Roche), a raíz del protocolo del fabricante. Proliferación fue evaluada por un período de 14 días. El análisis de los datos de tres de las células independientes transfections ordenados GFP-positivos para las células se realizó como en el informe anterior [44]. Los resultados se presentaron como media ± error estándar de los medios de barrido (MEB).

Determinación del índice de apoptosis en células bloques

Para caracterizar las células LNCaP si se someten a la apoptosis en ausencia de AR, el número de cadáveres fueron cuantificación de apoptosis en las células LNCaP transfectadas con pSiAR-EGFP y control de las construcciones de silenciador. Células fueron transfectadas tripsinized y se centrifuga a 400 × g durante 5 minutos para recoger las células. Los gránulos de las células fueron fijadas en formalina al 10% durante al menos 24 horas. Luego se mezcla con gotas de tibia de agarosa al 2% con el fin de formar células de agarosa bloques. La celda de bloques de parafina fueron incorporados, cortado al 4-6 μ m, montado en el microscopio, y al horno a 55 ° C durante la noche. Las diapositivas se deparaffinized, rehidratada con agua, y teñidas por hematoxilina. Apoptóticas se cuantificaron los órganos bajo un microscopio de campo claro a 400 × magnificación. Apoptosis se define como órganos de las pequeñas, aproximadamente esférica o ovoides citoplásmica fragmentos, algunos de los cuales figuran fragmentos nucleares [45]. La densidad de las células apoptóticas fue determinado por el recuento de células de cada 1000 transfección. Análisis cuantitativos de los cambios apoptóticos se registraron como órgano índices de apoptosis (ABI, el número de células apoptóticas / eficiencia de transfección).

Análisis Estadístico

Para el análisis estadístico, los datos se presentan como promedio y SEM de al menos 3 experimentos independientes. Significación estadística fue determinada cuando P <0,05. "T" de Student se utilizó para comparar los dos grupos de tratamiento.

Abreviaturas

5α-DHT: 5 α-dihidrotestosterona; AR: receptor de andrógenos; SON: elemento de respuesta de andrógenos; ARG: andrógenos respuesta de genes; RNAi: la interferencia por ARN; ARNsi: ARN interferentes pequeños.

Agradecimientos

Este trabajo recibió el apoyo de los NIH subvención DK54925 a HKL.