Genetic Vaccines and Therapy, 2005; 3: 2-2 (más artículos en esta revista)

Electroporación por nucleofector es la mejor técnica de transfección nonviral endoteliales humanas y en células musculares lisas

BioMed Central
Nina Iversen (nina.iversen @ medisin.uio.no) [1], Baard Birkenes (Baard.birkenes @ medisin.uio.no) [1], Kari Torsdalen (kari.torsdalen @ medisin.uio.no) [1] , Srdjan Djurovic (Srdjan.Djurovic @ medisin.uio.no) [1]
[1] Departamento de Genética Médica, Ullevål University Hospital, de Oslo, Noruega

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Resumen
Antecedentes

El objetivo de este estudio fue determinar la óptima no transfección viral método para el uso en humanos de células musculares lisas (SMC) y las células endoteliales (CE).

Métodos

Arteria coronaria (CoA) y la aorta (Ao) y SMC CE fueron transfectadas con un plásmido reportero, la codificación de cloranfenicol acetiltransferasa tipo 1 (CAT), con siete diferentes reactivos de transfección, electroporación dos métodos fotoquímicos y una internalización (PCI) método. CAT determinación facilitado información acerca de la eficiencia y la transfección de proteínas totales de medición se utilizó para reflejar la toxicidad de cada método.

Resultados

Electroporación nucleofector través de la máquina fue el más eficaz método de la prueba. Se exhiben de 10 a 20 veces (por SMC y CE, respectivamente) transfección aumento de la eficiencia en comparación con el método lipofection combinado con toxicidad aceptable. FuGene 6 y Lipofectamine PLUS se prefiere la transfección reactivos probado y como resultado 2 a 60 veces más altos que transfección eficiencia en comparación con el PCI que es el método menos eficaz.

Conclusión

Este estudio indica que la electroporación nucleofector través de la máquina es la preferida no viral método de transfección in vitro de los humanos y de la aorta y la arteria coronaria SMC CE. Puede ser muy útil en los estudios de expresión génica en el campo de la biología vascular. A través de la mejora de la transferencia de genes, la no transferencia de técnicas virales también pueden desempeñar un papel cada vez más importante en la entrega de los genes de SMC y de la CE en los Estados enfermedad.

Antecedentes

Varios métodos han sido descritos para introducir vectores de expresión de ADN en células de mamíferos in vitro e in vivo: la precipitación de fosfato cálcico, la microinyección, electroporación, mediada por los receptores de la transferencia de genes, partículas de las armas, vectores virales, y lipofection [1 - 3]. Cada sistema tiene ventajas y limitaciones, y hasta la fecha no existe un método ideal para la transferencia de genes.

Sistemas de vectores virales, modificados derivados de los virus animales o humanos, lo que resulta en la reproducción de vectores deficiente [4], representan una poderosa herramienta de transfección. Sin embargo, su inmunogenicidad, propiedades oncogénicas, la inactivación de los vectores, el desarrollo de la replicación de viriones competentes y la necesidad de un relativamente gran escala de la infraestructura para su producción son graves inconvenientes [5].

El uso de liposomas catiónico / ADN complejos (lipofection) para la transferencia de genes en las células somáticas se ha convertido en un popular método de la entrega de los genes. La interacción entre el ADN y los lípidos catiónicos iónicos a través de la interacción conduce a la formación de catiónico lipoplexes [1, 4]. Los complejos resultantes se funden con la aniónico superficies de las células, el suministro de ADN a las células a través de endocitosis. Sin embargo, el último transporte de ADN en el núcleo todavía no comprenden totalmente. Aunque inferior, mediante transfección lipofection ofrece algunas ventajas sobre los vectores virales, como la sencillez de la producción, de baja toxicidad y de bajo inmunogenicidad.

Otro método de transfección, electroporación [6], también denominado electrotransfer [7] o electropermeabilization [8], es una técnica experimental de la aplicación de breves impulsos eléctricos a las células o tejidos con el fin de aumentar la permeabilidad a las macromoléculas celulares. Este método se ha notificado aumento de la expresión de ADN desnudo por 100 veces o más [6 - 8]. Encontrar un equilibrio entre la mejor transfección eficiencia y la tasa de supervivencia es muy importante, por lo tanto, se determinó la optimización de esta técnica a través de dos diferentes instrumentos de la electroporación.

Fotoquímica de la internalización (PCI) se informó como un procedimiento específico para el sitio de entrega de varios tipos de macromoléculas de la membrana impermeable endocytotic vesículas al citosol [9]. Esta tecnología se basa en la liberación de citosólicas endocytosed macromoléculas de endosomes lisosomas y que se hagan a estas vesículas localizadas a la exposición de las células a photosensitizing compuestos y de la luz. PCI tiene varias ventajas sobre otras aplicaciones convencionales para la entrega de citosólica de la membrana impermeable moléculas [10]. Una de las ventajas es que no hay restricciones sobre el tipo y el tamaño de la molécula a ser internalizado, mientras que la molécula de interés puede ser endocytosed. Hemos examinado la aplicabilidad de la tecnología PCI a nuestras células de interés.

En este estudio se presentan amplias investigaciones realizadas con la mediación transfections reactivo de transfección, electroporación y PCI. Los objetivos del estudio fueron evaluar la eficacia y seguridad de los optimizada novela no viral de las técnicas de transfección de los cuatro tipos de células de interés: la arteria coronaria (CoA) SMC, la aorta (Ao) SMC, CoAEC y AoEC. Nuestros resultados mostraron que la electroporación nucleofector través de la máquina resultó ser el más eficaz método no viral in vitro de transfección de SMC humanos y de la CE, mientras que FuGene6 y Lipofectamine PLUS apareció como mejores resultados lipofection reactivos. Estos resultados también proporcionó información útil acerca de la optimización y selección de transfección condiciones de la prueba tipos de células.

Métodos
Los cultivos de células

Humanos de la Arteria Coronaria (# CC-2583) y la aorta (# CC-2571) se obtuvieron a partir de SMC Clonetics Corporation (Walkersville, MD), junto con la arteria coronaria humana (# CC-2585) y de aorta [# CC-2535] CE. Las células habían sido aisladas de tejido humano normal y criopreservados en los medios de comunicación de células musculares lisas, SmGM-2 (# CC-3182) y de células endoteliales medios de comunicación, EGM-2-VM (# CC-3202), respectivamente, complementado con un 10% de FCS ( Gibco BRL, Gathersburg, MD) y el 10% dimetil sulfóxido con el fin de mejorar la viabilidad celular y la eficiencia de siembra a la descongelación. Las células fueron cultivadas en el medio basal modificado Sm (SmBM; # CC-3181) complementado con SmGM-2 Single Quots y factores de crecimiento (# CC-4149), o, para la CE en EBM-2 basal medio (# CC-3156) complementado con EGM-2-VM único Quots y factores de crecimiento (# CC-4147) (Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y el 5% FCS. Las células fueron incubadas a 37 ° C en un ambiente humidificado con un 95% de aire y 5% de CO 2. Medio fue cambiado cada dos días y los protocolos de productor se cumple cabalmente. Para los experimentos de transfección, las células de bajo paso (pasos 4 a 8) en el 80% confluency se utilizaron.

Vectores del plásmido

La enzima bacteriana, CAT, codificada por Tn9, no tiene equivalente en eucariotas y se ha convertido en uno de los marcadores utilizados en experimentos de transfección.

El plásmido pRc/CMV2/CAT suministrados por Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.) se utilizó en este estudio. Hemos ampliado el plásmido competentes utilizando células de E. coli One Shot de transformación química kits suministrados por Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Las bacterias se cultivaron y el plásmido se aisló utilizando GigaPrep Kit, QIAGEN (Valencia, CA, EE.UU.).

Transfección reactivos

Siete comercialmente disponibles se utilizaron reactivos de transfección:

• FuGENE 6 (Roche, Mannheim, Alemania), una organización no liposomal transfección de reactivos, mezcla exclusiva de los lípidos y otros compuestos,

• Lipofectamine PLUS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), una formulación liposomal 3:1 de la polycationic lípidos 2,3-dioleyloxy-N (2 (sperminecarboxamido) etil)-N, N-dimetil-1-propanaminium trifluoroacetate (DOSPA ) Y el neutro de lípidos dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) en la membrana de agua filtrada. PLUS reactivo se utiliza para la validez de complejos de ADN antes de la preparación de los complejos de transfección,

• Metafectene (Biontex, Munich, Alemania), un reactivo de transfección polycationic que abarca "repulsivo acidolysis membrana", que garantiza la desestabilización de la DNA-lípidos de membrana de revestimiento por las fuerzas de repulsión electrostática endosomal débilmente en el ambiente ácido y la liberación de ADN en la célula Protoplasma,

• Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), un lípido catiónico que permite alta eficiencia de transfección y la expresión de la proteína,

• GenePORTER (Gene Therapy Systems Inc, San Diego, CA, EE.UU.), una formulación neutral de los lípidos DOPE y un propietario de lípidos catiónicos derivados de la tecnología de conjugación hidrofílicos,

• LipoGen (InvivoGen, San Diego, CA, EE.UU.), una formulación de un único lípidos, que combina en su estructura las características de un lípido catiónico y un fusogenic lípidos, como DOPE, que trabaja a través de las cadenas de hidrocarburos insaturados que DOPE Bilayers desestabilización de la membrana, lo que facilita la entrega de los lípidos y los complejos de ADN en las células, y

• Lipofectin (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 1:1 liposome1 formulación liposomal de lípidos catiónicos N-(1 - (2,3-dioleyloxy) propilo)-n, n, n-trimethylammonium cloruro (DOTMA) y en DOPE Membrana de agua filtrada.

Transfección de los reactivos

Baja-paso células fueron cultivadas y utilizadas en bien de 6 placas de 18 h antes de transfección. Aproximadamente 3 × 10 5 células por igual (80% de confluencia) se utilizaron en transfections.

El transfections, reportero usando vectores complejos con cada uno de los reactivos de la prueba, se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante.

ADN plásmido (0.8-6 μ g CAT) en diferentes ADN: liposomas ratios (1:3 - 1:5) fue diluido en tubos separados que contengan 100 μ l - 1000 μ l de suero libre de los medios de comunicación, mixto y se incubaron a 15-45 min habitación Temperatura. Los medios de comunicación se ha retirado y transfección soluciones se añadieron a cada pocillo (100 μ l - 1000 μ l). Después de 3 - 6 horas de incubación a 37 ° Cy 5% de CO 2, 1 ml fresca medios de comunicación (con FCS y suplementos) se añadió a cada pocillo y transfección continua durante 24 horas.

Transfección por electroporación

Dos diferentes métodos de electroporación fueron probados, cada uno de ellos utilizando un instrumento diferente. En primer lugar, se llevó a cabo con la electroporación ECM 630 electroporator (BTX, San Diego, CA, EE.UU.) y en segundo lugar, el instrumento nucleofector, (Amaxa Biosystems, de Colonia, Alemania) se puso a prueba.

Las células se cultivan en frascos T175, trypsinized, recogida por centrifugación (200 × g, 10 min) y resuspendido en el medio que contiene 10% de FCS CE Hanks y solución de SMC. 0,4 ml contiene aproximadamente 2 × 10 6 celdas y 20 μ g CAT plásmido (1 μ g / μ l) se colocó en una cubeta de electroporación estéril (BTX 0,2 cm de diferencia). Las células fueron sometidas a alta tensión en un entorno que ha sido optimizado para cada tipo de células. Después de la electroporación, las células fueron inmediatamente chapada a cabo utilizando previamente calentada medios de cultivo complementados con el 10% de FCS en 6 y placas.

Por Nuclefector transfección con el instrumento, un método de electroporación optimizado y una solución específica nucleofector se utilizaron para cada tipo de células. Para el SMC humanos AoSMC Nucleofector ™ kit se utilizó (VPC-1001). Las células se cultivan en frascos T175, trypsinized, recogida por centrifugación (200 × g, 10 minutos) y resuspendido en el HCAEC nucleofector solución a dos células en suspensión de 5 × 10 5 y 1 × 10 6 células por cada 100 μ l y 1-10 μ g ADN (1 μ g / μ l CAT). Programa U-25 se aplicó. Para la CoAEC humanos HCAEC Nucleofector ™ kit (VPB-1001) fue utilizado. CoAEC fueron tratados como SMC, salvo que se probaron en una sola concentración de 5 × 10 5 células por 100 μ l. 100 μ l de la suspensión celular y 1-10 μ g de ADN (1 μ g / μ l CAT) fueron mixtos y los transfiere a una cubeta. Programa S-05 se utilizó. Después del tratamiento, las células fueron inmediatamente chapada en el pre-calentado medio, suplementado con 10% FCS, en 6 y placas.

Transfección por fotoquímica internalización (PCI)

Fotoquímica de la internalización se realizó con un LumiSource ™ (PCI Biotech AS, de Oslo, Noruega). Reactivos (LumiTrans y p (Lys)) Asimismo, se aportaron desde PCI Biotech.

Por este método 7 × 10 4 chapada en células fueron de 12 y placas de cultivo. Al día siguiente los medios de comunicación fue removido y las células fueron tratadas con 0,4 ml de la fotosensibilizador LumiTrans en medio que contiene 10% de FCS (2 μ g / ml) por 16-18 horas a 37 ° C. Las células fueron lavadas tres veces con el medio. Por optimización de la luz dosis, de 0,8 ml de medio fresco se agregó a las células antes de la exposición a la LumiSource de 20 a 200 segundos. Lisados de células fueron cosechadas después de 24 horas y el total de proteínas de medición se llevó a cabo. La dosis que dio a luz el 50% de supervivencia se estableció como la dosis más alta y un rango de dosis más bajas de luz se utiliza para la optimización del método de PCI.

Post-tratamiento transfección de células

24 horas después de transfección, los medios de comunicación fue removido y las células fueron lavadas 3 veces con 1 × PBS y lisadas en 1 o 2 ml de buffer de lisis CAT (CAT ofrecidos en kit ELISA, Roche, Mannheim). Cell lisados CAT se utilizaron para la determinación y medición de la proteína total de ensayo.

CAT ELISA mediciones

Las concentraciones de CAT en la celda lisado se mide por CAT-ELISA (Roche, Mannheim, Alemania) según lo recomendado por el productor. Todas las mediciones se realizaron en duplicado y de las concentraciones de incógnitas se determinaron las normas de correr con cada plato.

La supervivencia de células cálculos

Celular total de proteínas se midió por un mejor ensayo Lowry (Bio-Rad Protein C D ensayo, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Al comparar los resultados de los ensayos y de control de los pozos, se suponía que las células en el control y no se vio afectada por el experimento. Los resultados de las pruebas se compararon con el control de los resultados y un porcentaje de supervivencia fue calculado.

Estas medidas fueron confirmadas mediante una detección citotoxidad Kit (Roche, Mannheim), que las medidas de lactato deshidrogenasa (LDH) en libertad la actividad de las células dañadas (resultados no presentados).

Presentación de informes de resultados

Con el fin de comparar eficazmente los resultados de cada uno de los tres métodos, normalización de los resultados en función del número de células utilizadas: transfección reactivos que requieren sólo el 3 × 10 5 células mientras que la electroporación y uso PCI 1-2 × 10 6 células por así. Para normalizar, se utilizó una proporción de CAT producido (ng) dividido por el total de proteínas de las células supervivientes (ng), posteriormente llamado transfección eficiencia (la cantidad de CAT producidos por célula viva). Este valor se multiplica por 1 × 10 6 para hacer que los números más manejables. Este cálculo no tiene en cuenta las diferencias en la supervivencia celular, y es por eso que este debe ser considerado también. Comparaciones de la eficacia de transfección

Resultados
Transfección de los reactivos

Con el fin de determinar la mejor transfección de reactivos para cada tipo de células, que comparativamente considerarse los siguientes: la cantidad de CAT producido, la relación entre el CAT / proteínas totales y de la supervivencia celular. Al considerar los resultados obtenidos en los cuatro tipos de células utilizadas, los resultados muestran que los tres mejores fueron reactivos FuGENE 6, Lipofectamine PLUS y GenePORTER (Tabla 1 y Figura 1]. Como se presentan en la Tabla 1, los valores muestran una gama entre los cuatro tipos de células utilizadas. Tanto los resultados son presentados en el texto a continuación y en la Figura 1, donde los resultados encontrados mediante la concentración óptima del plásmido para cada reactivo se muestran.

En CoASMC, el uso de FuGENE 6 logrado los mejores resultados. Se producen casi el doble de CAT por ml medios de comunicación que utilizan las células transfectadas la segunda con mejor comportamiento reactivo, Lipofectamine PLUS (Figura 1]. Cuando 1 μ g y 2 μ g plásmido se utilizaron, los coeficientes de 3-5 y se obtuvo la célula de la tasa de supervivencia fue de entre 69 y 74%, respectivamente (Figura 1]. En AoSMC, Lipofectamine PLUS dio los mejores resultados. Se produjeron más por ml CAT medios de comunicación que las células transfectadas con la siguiente mejor comportamiento reactivo, FuGENE 6 (Figura 1]. Cuando 0,8 μ g y 1,6 μ g plásmido se utilizó, ratios de 10-18 se obtuvieron las células y la tasa de supervivencia fue de entre 53 y 58%, respectivamente (Figura 1].

En CoAEC, mejor eficiencia de transfección se logró por FuGENE 6: produjo más del doble de la cantidad de CAT por ml de células transfectadas utilizando reactivos de los otros (Figura 1]. Cuando 1 μ g y 2 μ g de plásmido se utilizaron, los coeficientes de 8-11 y se obtuvo la célula de la tasa de supervivencia fue de entre 64 y 73%, respectivamente (Figura 1].

FuGENE 6 dio los mejores resultados en AoEC, así como: CAT produjo más por ml medios de comunicación que las células transfectadas con el segundo mejor en liposomas, Lipofectamine PLUS (Figura 1]. Cuando 1 μ g y 2 μ g de plásmido se utilizó, ratios de 7-16 y se obtuvo la célula de la tasa de supervivencia fue de entre 79 y 88%, respectivamente (Figura 1].

Transfección por electroporación
Transfección por PCI

Los primeros experimentos con PCI estaban destinadas a encontrar la luz de dosis en la que hemos obtenido al menos el 50% de supervivencia. Por este AoSMC se observó a ser de 100 segundos. En los experimentos más luz dosis que varían de 25 a 100 segundos fueron utilizados. Un bajo transfección efecto, la ratio de 0,3, se logró cuando las células fueron expuestas a la luz antes de la transfección de 5 μ g plásmido (Tabla 2].

La dosis que dio a luz el 50% de supervivencia en CoAEC fue entre 40 y 50 segundos, y para AoEC que fue de 32 segundos. El mejor efecto transfección ha obtenido un ratio de 4,7 y 55% de supervivencia, cuando las células se les dio 5 μ g plásmido antes de la exposición a la luz durante 25 segundos (Tabla 2]. Ninguno efecto se observó cuando las células fueron expuestas a la luz después de la adición de plásmido.

Discusión

Mejora de la eficiencia de entrega de los genes en SMC y de la CE y en el desarrollo y optimización de métodos de transfección ha convertido cada vez más en un importante objetivo de investigación. En este estudio encontramos que transfección por electroporación, utilizando el instrumento nucleofector, es comparativamente el más eficaz método de transfección combina la eficiencia y la alta tasa de supervivencia aceptables para ambas células musculares lisas y las células endoteliales (Tabla 2]. Aumento de la eficiencia de transfección transfección reactivos y el ECM 630 instrumento también funcionó bien, pero no en la misma medida que nucleofection (Tabla 2].

Transfección utilizando el nucleofector es un comercial de la técnica patentada que requieren especial amortiguadores y programas, de los componentes de los que son un secreto. No obstante, hemos desarrollado "en casa" los métodos de ECM 630 electroporator máquina. Optimización de estos métodos es posible, pero tiene muchas variables que deben tenerse en cuenta. En este estudio se utilizó constante de amortiguamiento, y el número de células plásmido cantidades con el fin de probar y optimizar las variables disponibles en el instrumento (voltaje, capacitancia y resistencia). A partir de nuestros resultados podemos concluir que la transferencia de la eficiencia podría ser mejorado en gran medida. Creemos que la electroporación por nucleofection es un método fácil y eficaz para los humanos transfecting CE y SMC, aunque el elevado número de células y de alta plásmido cantidades necesarias puede ser considerado como una debilidad.

Por otra parte, el uso de reactivos de transfección in vitro de células transfección es fácil, de bajo costo y de bajo número de células requiere. Aumento de la eficiencia se logró la transferencia de reactivos en todos los tipos de células probado. Sin embargo, el mejor desempeño de transfección reactivos encontrados en ciertos tipos de células no son necesariamente los óptimos reactivos para otros tipos de células. No obstante, FuGENE 6 reactivo similar transfección ha demostrado eficiencia en los cuatro tipos de células. De más importancia es el darse cuenta de que los resultados en este estudio reflejan esas configuraciones recomendadas por cada fabricante de reactivos. Como era de esperar, la optimización de transfección condición de estos reactivos puede también conducir a una mejora de la eficiencia transfección. Para la óptima transferencia de la eficiencia, el aumento de las concentraciones de ADN requieren mayores cantidades de liposomas, que aumentará inevitablemente la muerte de la célula. FuGENE 6 logrado relativamente buena transferencia de la eficiencia combinada con baja toxicidad.

Otro reactivo de transfección, GenePORTER, demostró la transferencia de alta eficiencia, aunque acompañado con relativamente alta toxicidad. Esto puede atribuirse a GenePORTER necesidades de grandes cantidades de ADN y liposomas para tener éxito.

En general, las diferencias observadas en la eficiencia y la transferencia óptima de ADN / liposomas ratios puede depender de la disposición de ocuparse de las células de ADN / liposomas complejos [11 - 14]. Nuestros resultados sugieren que la ratio no puede ser generalizado, y tienen que ser especificados para cada tipo de células utilizadas y liposomas. La polaridad negativa de la superficie de la célula que parece desempeñar un papel clave en el proceso. Por lo tanto, utilizando reactivos de transfección / liposomas tiene que ser optimizado para cada tipo de células y orientados reactivo utilizado [15].

PCI es un método probado, pero estudiar comparativamente más bajos de transferencia de la eficiencia, el tiempo y exigente procedimiento, este método no puede ser evaluada como la más adecuada. Cabe señalar sin embargo, que ha demostrado PCI aplicaciones prometedoras en el tratamiento del cáncer [9].

Varios estudios han informado de la no optimización de la transferencia de genes virales técnicas a células individuales [16 - 18]. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que, en comparación lipofection, electroporación y PCI en el mismo parámetros experimentales en humanos y Ao CoA SMC y de la CE.

Electroporación y PCI pueden resultar difíciles de utilizar en un entorno clínico. En cuanto a la electroporación, tejidos tendría que ser electroporated utilizando métodos que no están aún bien establecidos. Se ha informado de [19, 20] que in vivo la electroporación que ha sido implicada como la principal causa de daño muscular en la realización de estudios eléctricos trauma. Además, el uso clínico de este método dio lugar a transitorios a permanentes alteraciones en la permeabilidad de la membrana [19, 20]. Además, el grado de daño muscular puede depender de la pulsación de parámetros y diseño de electrodos [8, 21 - 23]. Hartikka et al. [24] informó que contengan extensas lesiones necróticas myofibers densamente pobladas y con la infiltración de células inflamatorias.

A través de la mejora de la transferencia de genes, no viral técnicas terapéuticas pueden desempeñar un papel cada vez más importante en la entrega de los genes a las células de la enfermedad en los estados. Un ejemplo es el campo cardiovascular [25 - 27], y esta es la razón por la cual hemos probado y optimizado utilizando estas técnicas de la aorta y la arteria coronaria SMC y de la CE. Un fuerte ventaja teórica de cardiovasculares de la terapia génica es la facilidad de acceso y, en algunas condiciones de carácter temporal sólo una expresión de la transfección de genes que se necesita para lograr un beneficioso efecto biológico [28]. Por lo tanto, no las técnicas de transfección viral puede ofrecer una opción terapéutica y resultar adecuados para el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares, y las informaciones relativas a la optimización de las condiciones de transfección con el fin de mejorar la eficiencia y reducir los transfección citotoxicidad, por ejemplo, de nuestro estudio, puede ser valioso para su uso en Estudios de la terapia génica.

Conclusión

A partir de los resultados obtenidos en este estudio, es evidente que la electroporación por el nucleofector instrumento preferido es el método de transfección de los cuatro tipos de células cardiovasculares. Nucleofection exhibió una técnica de alta eficiencia y la transfección de células aceptable tasa de supervivencia y deberían ser de gran utilidad en la expresión de genes en estudios de biología cardiovascular. Como un paso hacia un mayor desarrollo de la terapia génica estrategia, amplia los estudios in vitro con nuevas técnicas presentadas en este trabajo son esenciales en la definición de los más adecuados métodos de transferencia.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

NI participado en el diseño y la coordinación del estudio, estableció los métodos de transfección electroporación, nucleofection y PCI, y supervisó las siguientes optimalization de estos métodos. Ella se encarga de escribir el manuscrito. BB y KT son responsables de la realización de experimentos de forma independiente, y la interpretación de los resultados, mientras que SD concieved el estudio, y participó en el diseño y la coordinación de la misma, y bajo la supervisión liposomal experimentos de transfección.

Todos los autores crítico leído y aprobado la versión final del manuscrito.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado por la subvención de la Junta Noruega de la Salud (st.prp. Nr. 61). Damos las gracias a Jamie Cameron y Therese Lundin hábil para la asistencia de laboratorio.