Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 11-11 (más artículos en esta revista)

Mitocondrial 3 beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD) es esencial para la síntesis de progesterona por el cuerpo lúteo: Una hipótesis

BioMed Central
C John Chapman (johnchapman1@juno.com) [1], Jose R Polanco (jpolancomd@cox.net) [1], Soohong Min (soohongmin@juno.com) [1], Sandra D Michael (smichael@binghamton.edu ) [1]
[1] Department of Biological Sciences, Binghamton University, Binghamton, NY 13902-6000, USA
[2] Notre Dame Centro de Atención Ambulatoria, Director Médico, 1000 Broad Street, Central Falls, RI 02863, EE.UU.

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Resumen

En ratón ovarios, la enzima 3 beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD) se distribuye entre los microsomas y mitocondrias. A lo largo de la fase folicular del ciclo estral, el HSD actividad en microsomas es predominante y que, después de la estimulación de LH, HSD actividad durante la fase lútea es más alta en la mitocondria. El actual estudio examinó si la estimulación de LH o no siempre se traduce en un aumento de la actividad mitocondrial HSD. Esto se logró mediante la medición de la actividad en HSD microsomales fracciones mitocondrial y de los ovarios de ratones embarazadas. Estos animales tienen dos picos de LH durante la gestación, y un pico de LH después del parto. Se encontró que la actividad mitocondrial HSD es más alto después de cada pico de LH. Se propone que mitocondrial HSD es esencial para la síntesis de altos niveles de progesterona. El aumento de la actividad en las mitocondrias HSD LH después de la estimulación se debe a que: 1) La LH inicia la síntesis simultánea de HSD y el colesterol en la cadena lateral división enzima (P450scc), y, 2) HSD y P450scc unen para formar un complejo, que se convierte en Inserta en la membrana interna de la mitocondria. Los altos niveles de progesterona son sintetizados por mitocondrial HSD porque: 1) el NAD + cofactor necesario para la síntesis de progesterona es proporcionada directamente por las mitocondrias, y no indirectamente a través de la limitación de velocidad de lanzadera malato-aspartato, y, 2) el producto final inhibición de la P450scc Por pregnenolone se elimina porque pregnenolone se convierte a la progesterona.

Antecedentes

Con la excepción de 3 de β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD), las enzimas que participan en la conversión de colesterol a hormonas esteroides se encuentran ya sea en la mitocondria o en el retículo endoplasmático. DSH es única, ya que se encuentra en ambos orgánulos subcelulares. En cualquier lugar, HSD convierte pregnenolone y dehydroepiandosterone (DHEA) a la progesterona y androstenediona, respectivamente, utilizando como cofactor NAD +. La razón de dos sitios de esta enzima no se conoce.

Se establece la existencia de dos lugares separados para HSD ha sido un proceso largo. En 1956, Beyer y Samuels informó de que la microsomales (retículo endoplasmático) y mitocondrial fracciones de homogenado de la corteza suprarrenal bovina figura HSD actividad [1]. Sin embargo, el DSH se encuentran en la actividad mitocondrial fracción microsomales se atribuyó a la contaminación y el resultado de la homogenizion proceso. Si bien este estudio estableció la legitimidad de microsomales HSD, que tendía a la futura investigación sobre mitocondrial HSD. Por mitocondrial HSD a ser considerado como una entidad distinta y separada, la investigación adicional durante un número de años que serían necesarios. A partir de 1965, los investigadores comenzaron a reportar un doble ubicación de los ovarios en HSD [2 - 4], testículos [5, 6], la placenta humana a término [7 - 10], y la corteza suprarrenal de rata [11 - 14]. En su totalidad, estos estudios sugirieron que HSD mitocondrial es efectivamente una entidad separada. Otros investigadores, sin embargo, sigue considerando a la actividad mitocondrial HSD deberse a la contaminación microsomales [15, 16], y el resultado de un artefacto redistribución [17].

En 1979, nos informó de los resultados de un estudio de la distribución intracelular de la enzima HSD, el citocromo c oxidasa (marcador mitocondrial), de esteroides y 21 hidroxilasa (microsomales marcador) en la corteza suprarrenal de rata [18]. Encontramos que lavarse exhaustivamente las mitocondrias retenido el 26% de la actividad total de DSH. En retrospectiva, este porcentaje parece estar en la parte baja. Por ejemplo, cuando la actividad específica de microsomales HSD se determina, y su contribución a la HSD actividad en el resto de las fracciones de células (nuclear / ininterrumpida de células, el de la mitocondria, y lavarse las fracciones mitocondrial) determinó, luego de un máximo del 60% del total de homogenado HSD Actividad puede atribuirse a microsomales HSD. Esto indica que mitocondrial HSD constituye el 40% del total de homogenado HSD actividad, en lugar de 26% como se informó inicialmente. En el mono rhesus placenta, HSD actividad se distribuyen por igual entre las mitocondrias y microsomas [19], y, en la corteza suprarrenal bovina, el de la mitocondria DSH se compone de un 30% del total de la actividad HSD [20, 21].

Nuestro estudio también encontró que utiliza la matriz mitocondrial HSD espacio NAD + como cofactor, lo que indica que la enzima se encuentra en el interior de la membrana mitocondrial [18]. Esta ubicación para mitocondrial HSD se ha establecido en la corteza suprarrenal bovina [20, 21], y, en testículos de ratas [5]. La combinación de técnicas de inmuno-cytochemistry y la microscopía electrónica han identificado HSD reacción inmune en la mitocondria de ovario humano [22], y, en la mitocondria de rata, ovario, testículo, y la corteza suprarrenal [23]. Mitocondrial HSD ahora se ha aislado de la corteza suprarrenal bovina [21, 24], y de la placenta humana a término [25, 26], y, purificado a homogeneidad. Es bien conocido que microsomales DSH y DSH mitocondrial son idénticas proteínas [25 - 28]. La razón de dos localidades para la misma enzima todavía no se ha determinado.

En un estudio de la distribución intracelular de mitocondrial DSH y DSH en microsomales ratón ovarios en el curso del ciclo estral [29], nos informó de que durante el diestro (fase lútea), la actividad específica de mitocondrial HSD fue 80% más alta que la de Microsomales HSD. Esto está en marcado contraste con las otras tres etapas de estro cuando microsomales HSD tuvieron la mayor actividad específica. En un estudio en el que el cDNA de la placenta humana HSD se Sf9 transfectadas en células, la enzima HSD resultante se distribuyó entre las mitocondrias y microsomas [27]. En el lútea células de ovario de ratón, la distribución de la enzima está sesgada a favor de la mitocondria. Durante el proceso de la luteinización, lútea células expresan altos niveles de mRNA para el colesterol en la cadena lateral división enzima (P450 scc), y para HSD [30, 31]. La síntesis simultánea de estas dos enzimas es muy probable que la razón del aumento en la actividad mitocondrial HSD, como se expondrá más adelante.

Los resultados de nuestro estudio anterior [29], provisionalmente, sugirió que el aumento de la actividad mitocondrial HSD ratón en el ovario durante el diestro se debe a LH. El ratón embarazadas tiene dos picos de LH durante la gestación, y un pico de LH después del parto [32]. Después de cada pico de LH, los niveles de progesterona circulante aumento [33]. El presente estudio examinó la actividad de distribución de los DSH en ovarios de ratón embarazadas para determinar si procede o no la actividad mitocondrial HSD también aumentó después de cada pico de LH. Encontramos que lo hizo, lo que llevó a nuestra propuesta de explicación de la razón por dos lugares separados para HSD en el cuerpo lúteo.

Métodos
Animales

Mujeres de los ratones (C3H/HeJ × 129 / J), F 1 (C31) híbridos fueron utilizados en el estudio. Los padres se compraron las existencias de los Laboratorios Jackson, Bar Harbor, ME. Los ratones fueron alojados en una sala de los animales mantenerse a 24 ° C, con control de la iluminación de 14L: 10D (luces encendidas en 0600 hr y bajar en 2000 hr). Purina laboratorio chow (-Ralston Purina, St Louis, MO) y el agua se proporcionaron ad libitum. El C31 crías se destetan a 23-28 días de edad. Mujeres hermanos fueron alojados dos por jaula. Para los experimentos de embarazo, las mujeres fueron C31 con acoplado C31 hombres. Sólo los que tienen ciclos regulares estral (4-5 días) se utilizaron para el estudio.

La determinación de la etapa del ciclo de la Celo y apareamiento

Con el fin de promover un ciclo de estro en las hembras C31, virutas de la jaula se tomaron de las jaulas que contienen C31 hombres, y se colocan en las jaulas que contienen las hembras. Asimismo, masculino femenino rodeado jaulas jaulas. Frotis vaginal se toman diariamente, por lo general por la tarde. El frotis fueron repartidas en un portaobjetos de vidrio, en una gota de solución salina fisiológica, teñidas utilizando hematoxilina y eosina Y, y la fase de estro determinado por el método de Rugh [34].

En todos los experimentos, cada uno de ellos analiza un grupo de seis mujeres que tenían entre 80 y 190 días de edad. Dos de los grupos de estudio se compone de animales que se encontraban en diestro y proestro. El resto de grupos de todos los animales consistía en embarazadas. Estos grupos se formaron de la siguiente manera: las mujeres que se encontraban en cualquiera de proestro se estro o acoplada a finales de la tarde o alrededor de 2 horas antes de luces apagadas. A las luces del día siguiente por la mañana, y para los días siguientes si fuera necesario, todas las mujeres han sido objeto de inspección por la presencia de tapones vaginales. El día de tapón vaginal fue considerado como el día 0 del embarazo. Durante el período de gestación, las hembras preñadas se sacrificaron en los días 5, 10, 15, y 20. Otro grupo de mujeres fue sacrificado en el día 5 post-parto.

La recopilación y el procesamiento de tejidos

Los animales se etherized la ligera, pesada, y luego decapitado. Los ovarios fueron retirados, acabado de la grasa, pesaron en parejas, y se coloca sobre el hielo para llenar el plato petri en unas gotas de homogeneización de amortiguación (0,3% BSA, 1 mM EDTA, 0,25 M de sucrosa, y 30 mM Tris-HCL [pH 7,4], 4 ° C), como por Chapman y Sauer [18]. Las doce ovarios fueron finamente picada, y luego transferido a un helado de 5 ml Potter-Elvehjem vidrio homogeneizadora. El volumen de la muestra se elevará a 4 ml con más homogeneización del medio, y los ovarios homogeneizada en la habitación fría (4 ° C) con 8 golpes de un completo motor de teflón pestle. El homogenado fue luego transferido a un tubo de centrifugación de 10 ml, y el vidrio homogeneizadora enjuagarse con 1 ml de homogeneizar medio. El enjuague se combinó con el homogenado, 1 ml y una muestra de la total homogenado removidos y guardados para su posterior ensayo.

El útero se eliminaron a partir del 10 día, 15 días, y 20 días ratones embarazadas. Trofoblastos fueron extirpados de la sección central de cada cuerno uterino. Después del pesaje, el trofoblasto se picada, y se procesa como se describe para los ovarios, a menos que la carne molida fue homogeneizada en un vaso de vidrio Thomas homogeneizadora.

Centrifugación diferencial

El homogenado de ovario, que figura en un tubo de centrifugación de 10 ml, se centrifuga a 700 × g en un Sorvall RC-5 centrífuga refrigerada durante 10 min. El sobrenadante fue removido y en hilar 10000 × g durante 20 minutos en la misma centrífuga. La baja velocidad de pellets, que contiene núcleos y células ininterrumpida, se resuspendió en 1,5 ml de buffer de homogeneización. Después de que 10000 × g centrifugación, el pellet mitocondrial resultante se resuspendió en 1,5 ml de buffer de homogeneización. El postmitochondrial sobrenadante se centrifuga en un L65 Ultracentrifuge Beckman (Beckman Co, Fullerton, CA) durante 1 h en 105000 × g. De este modo se obtuvieron citosol y un pellet de microsomas. Microsomas se resuspendió en 1,5 ml de buffer utilizando un homogenizador 2 ml Potter-Elvehjem homogeneizadora de vidrio con teflón pestle. Todas las fracciones, incluido el homogenado total, se divide en partes alícuotas de 12 × 75 mm tubos de vidrio borosilicato, cubiertos con Parafilm (American Can Co, Greenwich, CT), y congelado a -10 ° C. Análisis enzimáticos se han programado de manera que el congelado sub-fracciones celulares fueron descongelados una sola vez antes de ensayo.

Los análisis enzimáticos y otros ensayos

El homogenado total, la baja velocidad de pellets (núcleos / ininterrumpida células), el de la mitocondria, y se analizaron las fracciones microsomales HSD para la medición de la actividad por la conversión de pregnenolone a la progesterona. Copia de muestras de tejido de 50 μ l y 100 μ l se añadieron a 15 ml de vidrio de tubos de ensayo con 1 ml de medio de incubación (50 mM sacarosa, 20 mM KC1, 1 mM EDTA, 30 mM Tris-HCl [pH 7,4], el 0,3% de BSA ), Y 0,5 mM NAD +, como por Chapman et al. [29]. El incubates posteriormente se colocaron en un 37 ° C baño de agua y se permite que se equilibre durante 5 min. La reacción se inició con la adición de 100 nmol de pregnenolone en 10 μ l de etanol. Después de 15 min de incubación, la progesterona se extrajo producto en 1 ml de heptano grado espectral. La absorción de la progesterona se midió en un espectrofotómetro de Respuesta de Gilford (Gilford Systems, Oberlin, OH). La progesterona tiene un pico de absorción a 233 nm en heptano y un coeficiente de extinción molar de 17000 [18]. Con el fin de acceder a la eficiencia de la extracción de 1 ml de heptano, conocido concentraciones de progesterona normas se celebrará conjuntamente con las muestras de tejidos. Después de la extracción en heptano, la absorbancy de las normas se comparó con su absorbancia medirse directamente en heptano.

Citocromo c oxidasa, un marcador de la membrana interna mitocondrial, fue ensayada en el marco del procedimiento de Wharton y Tzalgaloff [35]. Actividad enzimática fue determinada por la tasa de disminución de la absorbancy a 550 nm. El contenido de proteína se midió utilizando el método de Bradford [36]. Todos los ensayos fueron en doble ejemplar. Replique los datos fueron analizados por ANOVA utilizando diferencias significativas (Dunnett, y Scheffe 'F-test).

Resultados

La distribución de la actividad HSD entre mitocondrias y microsomas sufre un único cambio en la transición de proestro a diestro. En proestro, por ejemplo, la actividad es más alta HSD en la microsomas. Al diestro, en cambio, la actividad mitocondrial HSD es casi el doble que la de microsomales HSD [29]. En el presente estudio se volvió a examinar este fenómeno, y, como muestra la Figura 1, la actividad de la mitocondria HSD aumenta significativamente en el diestro. La actividad de la enzima de la membrana interna mitocondrial, citocromo c oxidasa, que también aumenta en diestro. Total de ovario proteínas, en cambio, disminuye.

Figura 2 contiene los resultados de dos experimentos en los que se midió la actividad HSD en la mitocondria y fracciones microsomales durante el embarazo, y 5 días después del parto. Como se ha indicado, las actividades del HSD mitocondrial y microsomales HSD ambos aumentado en el curso del período de gestación. Sin embargo, el aumento de la actividad HSD en los dos orgánulos era incompatible. Por ejemplo, a los 15 días y 20 días de gestación, la mayor actividad se HSD en la fracción microsomales. En cambio, a los 5 días y 10 días de gestación, y a los 5 días post, el de la mitocondria HSD actividad fue mayor que la de microsomales HSD. Estos tres puntos temporales directamente seguir los picos de LH [32]. Citocromo c oxidasa actividad también aumentó durante el embarazo. Al día 20, el citocromo c oxidasa actividad fue más del doble de la actividad medido a los 5 días. Total de ovario proteína fue inversamente correlacionada con los picos de LH. Por ejemplo, a los 15 días y 20 días de gestación, cada ovario contenidas 1190 μ g de proteína y 1025 μ g de proteína, respectivamente. En cambio, a los 5 días y 10 días de gestación, y a los 5 días post, cada ovario figuran 890 μ g de proteína, 825 μ g de proteína, y 810 μ g de proteína, respectivamente. Esta relación entre la LH y la proteína total de ovario también se produce durante el ciclo estral [29]. Por ejemplo, como se muestra en la figura 1, cada ovario en proestro contenidas 1030 μ g de proteína, mientras que en el diestro, cada ovario figuran 838 μ g de proteína.

Figura 3 contiene los resultados de la medición de la actividad en HSD mitocondrial y fracciones microsomales de trofoblasto del 10 días, 15 días, y 20 días ratones embarazadas. Como se indica, HSD actividad no fue detectado (ND) en el trofoblasto de 10 días ratones embarazadas. Sin embargo, el trofoblasto a partir del 15 de día y 20 días se encontraron ratones embarazadas para producir progesterona 0,4 nmol / min / trofoblasto progesterona y 0,6 nmol / min / trofoblasto, respectivamente. Tenga en cuenta que la mayor actividad en HSD trofoblasto es en la fracción microsomales.

Discusión

Los resultados de este estudio y el anterior [29] dejan poco lugar a dudas de que la actividad mitocondrial HSD aumenta después de la estimulación de LH. ¿El aumento de la actividad mitocondrial HSD se logra y con qué fin, son los temas de este debate.

Cuando mitocondrial HSD fue inicialmente bovino purificado de la corteza suprarrenal, la enzima se encontró que tienen una estrecha asociación con P450 scc [24]. Esta asociación fue de tan alto grado que mitocondrial HSD realmente copurified con P450 scc. Los anticuerpos contra mitocondrial HSD precipitó tanto HSD y P450 scc, y, por el contrario, los anticuerpos contra P450 scc precipitó tanto P450 scc mitocondrial y HSD. El grado de asociación entre las dos enzimas se midió, y una constante vinculante (K D) de 0,12 μ M fue determinado. Como era de esperar, P450 scc también vinculada a purificada microsomales HSD [24]. DSH es insoluble e inactivas en un medio acuoso, debido a una serie de sesiones de la proteína, denominada "membrana-que abarca dominio" [27]. Eliminar este segmento se vuelve soluble y HSD. Con la serie de sesiones en el lugar, DSH se inserta en las membranas de las mitocondrias y microsomas [27]. La observación de que la actividad mitocondrial HSD LH aumenta después de la estimulación sugiere que HSD es preferentemente inserta en la membrana mitocondrial. El hecho de que se une a HSD P450 scc es muy probable su mecanismo de inserción. Esto sugiere que HSD y P450 scc unen, ya sea durante o inmediatamente después de su síntesis, ya que es poco probable que podría obligar a HSD P450 scc, ya están en funcionamiento. MRNAs de la HSD y P450 scc se expresan simultáneamente en lútea células de la rata [37 - 40], la vaca [41, 42], ovejas [42 - 44], [45] de caballos, monos macacos [46], y humanos [ 38, 47 - 49].

Figura 4 es un diagrama representante de la propuesta de efecto concurrente de la síntesis de la HSD y P450 scc sobre la distribución intracelular de las células HSD en lútea. Iniciado por LH; HSD la expresión de ARNm y P450 scc mRNA resultados en la síntesis simultánea de HSD y P450 scc. Las dos enzimas se unen entre sí para formar un complejo, que se inserta en la membrana interna mitocondrial. HSD de las moléculas que no vinculan a P450 scc se insertan en la membrana del retículo endoplasmático.

En el ratón hay picos de estradiol-17 β en proestro (100 pg / ml) y metestrus (200 pg / ml) [29]. Sin embargo, estos niveles son significativamente inferiores a los niveles de progesterona producida en toda la fase lútea. Durante el embarazo los niveles de progesterona circulante son aún mayores. Se podría argumentar que el aumento de los niveles de progesterona circulantes en ratones embarazadas se deben a la actividad en HSD trofoblasto. Esta posibilidad se abordó en el estudio actual. Como se muestra en la figura 3, homogeneizado de cada trofoblasto a partir del 15 de día y 20 días embarazadas ratones son capaces de producir progesterona 0,4 nmol / min / trofoblasto progesterona y 0,6 nmol / min / trofoblasto, respectivamente. Este nivel de actividad HSD en un solo trofoblasto es sólo el 3% de la actividad producida por HSD par de ovarios. Sin embargo, las grandes camadas aumentaría el porcentaje. Al día 10 no hay duda de que los ovarios son la fuente principal de la progesterona circulante, lo que representa una media 55 ng / ml [33]. Este nivel de progesterona es de 275 veces y 550 veces el pico de los niveles de estradiol-17 β producidos durante la fase folicular.

A fin de que lútea células para sintetizar altos niveles de progesterona, una serie de acontecimientos que se produzcan. En primer lugar, los mayores niveles de dos enzimas, P-450 scc y HSD, que se han producido. Este evento se inicia cuando sus respectivos mRNAs se expresan, como se indica más arriba. En segundo lugar, el aumento de la síntesis de esteroides requiere un aumento de la oferta de colesterol. Esto se logra mediante la eliminación de colesterol del colesterol éster tiendas [50, 51], y por la iniciación de la síntesis de novo de colesterol [52 - 54]. Este último caso es muy probable a la espera de la fertilización de los óvulos y de la necesidad de un suministro de colesterol más allá de diestro. En la embarazada ratón, células lútea sintetizar altos niveles de progesterona durante tres semanas [33]. La síntesis de novo de colesterol requiere una fuente de carbono, así como de ATP y NADPH. En lútea células de la fuente de carbono es el acetato; ATP se genera a través de glicolisis, y NADPH se produce durante la oxidación decarboxylation de isocitrate y malato [54]. Las enzimas que catalizar la reacción de estos últimos están vinculados NADP +-isocitrate deshidrogenasa y NADP +-vinculada malato deshidrogenasa. Ambas enzimas se encuentran en abundancia en el citoplasma de las células lútea [55].

La enzima, P450 scc es capaz de producir 53 nmol pregnenolone / min / mg de proteína [56]. Esto requiere una oferta sin menoscabo de NADPH, así como la mencionada colesterol. NADPH que se produce en el citoplasma es de ninguna utilidad directa para el P450 scc enzima. Sin embargo, la reducción de los equivalentes de NADPH puede ser transferido de la mitocondria al citoplasma a través de la lanzadera malato-aspartato [57, 58]. Lamentablemente, en la mitocondria lútea carecen de un tejido NADP +-vinculada malato deshidrogenasa [59, 60]. Como resultado de ello, no se puede NADPH generados en la mitocondria por la oxidación de malato decarboxylation. Esto está en marcado contraste con tejido de la corteza suprarrenal, que tiene un mitocondrial NADP +-vinculada malato deshidrogenasa [61, 62]. En las mitocondrias de tejidos lútea y ambas contienen un citoplasma NAD +-vinculada malato deshidrogenasa, cada uno con una enzima de alta actividad específica [55, 59]. Esto indica que hay suficiente capacidad de transferencia de la reducción de los equivalentes de NADH en la mitocondria. Si esta transferencia se produce en los tejidos como el hígado y el corazón, el NADH se utilizan para producir ATP. En androgénica, tejidos, la NADH también puede utilizarse para producir NADPH. Por ejemplo, en las mitocondrias de tejidos lútea, la reducción de los equivalentes que se transfieran de NADH a NADP + por ahorro de energía, independiente de nucleótidos piridina-transhydrogenase [56]. Sonicates lútea de la mitocondria se informó de catalizar la producción de NADPH 60 nmol / min / mg de proteína de la NADH [56]. Mitocondria en la corteza suprarrenal han tejido un proceso similar, excepto que la transferencia es dependiente de la energía [63]. La principal fuente de NADPH en la mitocondria de los tejidos lútea es proporcionada por NADP +-vinculada isocitrate deshidrogenasa [56]. Esta enzima es capaz de reducir el NADP + 253 nmol / min / mg de proteína [56].

En la síntesis de la progesterona, NAD + se reduce a NADH. Con el fin de mantener una alta tasa de síntesis de progesterona, NADH tiene que ser continuamente oxidado a NAD +. Con microsomales HSD, la oxidación de NADH tendría que ocurrir ya sea a través de la α-glicerol fosfato o la lanzadera malato-aspartato lanzadera. Las dos lanzaderas de transferencia de la reducción de los equivalentes de NADH en la mitocondria. Sin embargo, la α-glicerol fosfato de lanzadera no opera en el ovario [64], lo que deja a la transferencia de los equivalentes a la reducción de la lanzadera malato-aspartato. El ovario ya se utiliza en gran medida este lanzadera. Como se indica anteriormente, la lanzadera malato-aspartato reducción de las transferencias equivalentes de NADH en la mitocondria por la enzima P450 scc. Además, la lanzadera está involucrado en la oxidación de la NADH producido durante glicolisis. Una alta tasa de glicolisis durante la síntesis de novo de colesterol, por ejemplo, genera altos niveles de NADH. Si los niveles de NADH exceder la capacidad de carga del sistema de lanzadera, la reducción de los equivalentes se transfieren a través de la enzima piruvato, lactato deshidrogenasa. Un alto nivel de lactato es una señal de que el sistema de lanzadera es de la limitación de velocidad.

El ovario produce cantidades apreciables de lactato, incluso durante la fase folicular temprana [65]. Como folicular tamaño aumenta, también aumentan los niveles de lactato [66], coincidiendo con el inicio de la formación de antro y detectables estradiol-17 β secreción [66, 67]. Después de la oleada de LH, los niveles de lactato aumento de 2,5 veces más [66, 68]. En lútea tejido, un alto porcentaje de la glucosa es metabolizada abordarse sólo en la medida de lo piruvato y lactato [69]. Iodoacetate, un inhibidor de la glicolisis, suprime el efecto de la acumulación de lactato en la LH y reduce significativamente LH estimulada la síntesis de progesterona [68, 70].

El hecho de que la lanzadera malato-aspartato es limitante de la tasa podría ser la razón de una ubicación para HSD mitocondrial. Sin embargo, pregnenolone es un producto final inhibidor de la reacción P450 scc [71, 72], y un lugar para mitocondrial HSD eliminaría los esteroides, desde su sitio de la inhibición. La progesterona no inhibe la reacción P450 scc [71]. Mitocondrial HSD pruebas de que está involucrado en la producción de altos niveles de progesterona es proporcionado por la observación de que las mitocondrias de tejidos tecales convertir sólo el 6,4% del total de 14 C-colesterol a los 14 C-progesterona (1,2%) y 14 C-pregnenolone (5,2 %), Mientras que, por el contrario, las mitocondrias de tejidos lútea convertir el 16,1% del total de 14 C-colesterol a los 14 C-progesterona (13,5%) y 14 C-pregnenolone (2,6%) [73].

En humanos adrenales y gónadas, DSH se deriva del mismo gen y ha sido clasificado como de tipo II, relativo a la enzima placentaria, que se clasifica como de tipo I [27, 28, 74, 75]. En las glándulas suprarrenales y gónadas de la rata [74 - 76] y el ratón [77, 78], la enzima también está derivado del mismo gen, que en estos roedores se clasifica como tipo I. El hecho de que los ovarios y la corteza suprarrenal contener HSD misma enzima indica que su respuesta a la hormona de estimulación trófica sería también la misma. Uno esperaría, por lo tanto, que la estimulación ACTH podría causar un aumento de la actividad mitocondrial HSD corteza suprarrenal en el tejido. ACTH estimulación de las ratas machos y hembras causa un aumento de la HSD mRNA y HSD actividad [79]. Sin embargo, no se sabe si provoca una estimulación de ACTH preferencial HSD aumento de la actividad mitocondrial.

Aparte de la función que Steroidogenic proteína de regulación aguda (StAR) desempeña en el control del colesterol acceso a la mitocondria, la tasa etapa limitante en la esteroidogénesis se considera P450 scc [80]. Sin embargo, el hecho de que el P450 scc y HSD están unidos como un complejo [24] sugiere que la tasa de limitación de paso, o de pasos, implica la conversión de colesterol a la progesterona. Hay una ventaja decidido en estas dos enzimas que funciona como una unidad. En lugar de shuttling esteroides intermedias de orgánulos a orgánulos, el colesterol se puede convertir a la progesterona en lo que podría describirse como un solo paso. Los niveles de progesterona puede aumentar aún más si las reacciones de ambas enzimas se acoplan juntos, que parece ser el caso. El descubrimiento de la energía independiente NADH / NADP + transhydrogenase inicialmente dieron lugar a la suposición de que existen para el suministro P450 scc con NADPH [56]. Sin embargo, la transhydrogenase es capaz de producir menos de un / NADPH mitad de la necesaria para sintetizar altos niveles de pregnenolone. Si su función es la de actuar como principal proveedor de NADPH, es insuficiente. Sin embargo, si su función principal es garantizar que los DSH tiene una oferta sin menoscabo de NAD +, y está en funcionamiento con V max, es más que suficiente. Es un medio ideal para el acoplamiento a HSD P450 scc. Lamentablemente, el intercambio de una molécula de NADH para producir una molécula de NADPH es insuficiente para la conversión de colesterol a la progesterona. Esto se debe a que la reacción P450 scc utiliza 3 moléculas de NADPH para la síntesis de una molécula de pregnenolone. El resto de la NADPH para esta reacción tendría que ser proporcionada por mitocondrial NADP +-vinculada isocitrate deshidrogenasa [56].

El P450 scc / HSD complejo enzima está bien reglamentado. Además de la inhibición del producto final ejercida por pregnenolone sobre el P450 scc reacción [71, 72], el HSD reacción se ve afectada por el estado redox de citoplásmica nucleótidos piridina [81]. Por ejemplo, extramitochondrial NAD + HSD actividad mitocondrial aumenta hasta en un 40% y que, extramitochondrial HSD NADH inhibe la actividad de hasta el 70%. Figura 5 es un diagrama representante de la propuesta de reglamento de la conversión de colesterol a la progesterona. Como se indica, pregnenolone actúa como inhibidor de un producto final de la reacción P450 scc, [(-)], y, en la reacción mitocondrial HSD, extramitochondrial NAD + funciona como un activador allosteric [----- -- (+)] Y extramitochondrial NADH funciona como un inhibidor allosteric [(-)]. Con este nivel de control es difícil imaginar cómo podría pregnenolone nunca abandonar el lútea células sin ser convertido a la progesterona.

Por último, se señaló en la sección de resultados que el total de proteínas de ovario fue inversamente correlacionada con el pico de LH. Una disminución en el total de proteínas de ovario durante el diestro podría ser debido a la ovulación. Sin embargo, esto no explica la reducción de los niveles de proteína siguientes LH estimulación que se produce durante el embarazo y después del parto. Un curso rápido y síntesis de las dos enzimas, P450 scc y HSD es fundamental para la producción de altos niveles de progesterona. Ello requiere un suministro de los aminoácidos. Es especulativo por supuesto, pero la acción de LH podría incluir el inicio de la proteólisis de la proteína lútea tiendas de tejidos, lo que podría explicar los niveles más bajos de proteína.

Conclusión

El ovario tiene dos niveles de síntesis de esteroides. Un nivel se produce durante la fase folicular, y un mayor nivel de síntesis se produce en toda la fase lútea. Creemos que el mayor nivel de síntesis se debe a, y el motivo de, el de la mitocondria HSD. Para sintetizar estradiol-17 β durante la fase folicular, son los precursores de esteroides viajaron tipo de célula a célula y tipo de orgánulos a orgánulos. La síntesis de la progesterona durante la fase lútea implica un tipo de células y dos enzimas. Con HSD en la mitocondria, en lugar de en los microsomas, la lanzadera de los precursores de esteroides es innecesario. También permite HSD y P450 scc para funcionar juntos como una unidad, una ventaja para la producción decidió altos niveles de progesterona. Esto es especialmente cierto si las dos enzimas se acoplan juntos por el NADH / NADP + transhydrogenase. Un lugar para mitocondrial HSD también resuelve el problema inherente a la tasa de limitación de malato-aspartato lanzadera, y se elimina el producto final de la inhibición pregeneolone convirtiendo a la progesterona. Por último, el hecho de que HSD y P450 scc tienen una fuerte afinidad por los demás, y simultáneamente se sintetizan, tentativamente sugiere un medio por el cual la estimulación de LH se traduce en un aumento en la actividad mitocondrial HSD.