Virology Journal, 2005; 2: 29-29 (más artículos en esta revista)

Evaluación cuantitativa de los efectos de uracil-DNA glycosylase sobre la degradación de amplificación del ADN y el ARN en la amplificación de PCR con transcripción inversa

BioMed Central
Steven B Kleiboeker (kleiboekers@missouri.edu) [1]
[1] Veterinary Medical Diagnostic Laboratory and Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine, University of Missouri, Columbia, Missouri 65211, USA

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Resumen

Aunque PCR y RT-PCR proporcionado un valioso enfoque para la detección de patógenos, el alto nivel de sensibilidad de estos ensayos también las hace propensas a resultados positivos falsos. Además de la contaminación cruzada con cierto muestras positivas, falsos resultados positivos también son posibles debido al "arrastre" contaminación de las muestras con amplificación de ADN generados por anteriores reacciones. Para reducir esta fuente de falsos positivos, generados por reacciones de amplificación en el que fue sustituido por dUTP dTTP pueden ser degradados por uracil DNA glycosylase (UNG). UNG no degradar ARN, pero cleave contaminando uracil-ADN que contienen timina, dejando que contienen ADN intacto. La disponibilidad de termolábiles UNG hace uso de este enfoque viable para RT-PCR. En este estudio, en tiempo real RT-PCR se utilizó para cuantificar la degradación UNG de amplificación del ADN y el efecto de la detección de ARN de UNG. Uso de los fabricantes recomienda condiciones, la degradación completa de ADN no se observó para las muestras que contienen 250 ejemplares de amplificación de ADN. UNG duplicar la concentración dio lugar a la degradación de las dos concentraciones más bajas de la prueba de ADN, pero también dio lugar a un aumento de 1,94 ciclos en la C T para detección de RNA. Para mejorar la degradación del ADN y reducir al mínimo el efecto en la detección de RNA, una serie de tiempo, la temperatura y se evaluaron las concentraciones de la enzima. Condiciones óptimas resultaron ser 0,25 U UNG por 25 μ l con una reacción de 20 minutos, incubación a 30 ° C antes de la RT-PCR. En estas condiciones, las altas concentraciones de amplificación de ADN podrían ser degradados mientras que el C T para detección de RNA se incrementó en 1,2 ciclos.

Antecedentes

Las técnicas moleculares han proporcionado un valioso enfoque para la detección de los agentes patógenos en los humanos y la medicina veterinaria [1 - 5]. Al igual que con cualquier técnica diagnóstica, el control de calidad de cada uno de los pasos es fundamental para garantizar la exactitud de los resultados. Al realizar el diagnóstico de PCR o transcripción reversa (RT)-PCR, la eliminación de falsos positivos es crucial para garantizar la precisión diagnóstica. Los falsos positivos pueden ocurrir debido a la contaminación en cualquier punto en la preparación de muestras y procedimientos de amplificación [6]. Por ejemplo, la contaminación cruzada entre las muestras positivas y negativas, pueden producirse durante la recogida de las muestras, la extracción de ácidos nucleicos, PCR o RT-PCR o reacción en asamblea durante el análisis de la electroforesis en gel de agarosa. Además de la contaminación de las muestras positivas, falsos resultados positivos también son posibles debido a la contaminación de las muestras en cualquier punto en el protocolo con el ADN generados por anteriores positiva la reacción de amplificación. Esta fuente de contaminación es de especial preocupación ya que una positiva reacción de amplificación pueden generar en exceso de 10 11 moléculas de producto (amplificación) de ADN por reacción. Teniendo en cuenta que diez o menor número de moléculas de ADN plantilla puede generar un resultado positivo por PCR o RT-PCR, incluso minutos los niveles de amplificación de la contaminación puede dar lugar a falsos positivos. Además, la estabilidad inherente de ADN bajo una variedad de condiciones ambientales potencialmente podría conducir a falsos resultados positivos semanas o meses después de la contaminación de los reactivos o con equipos de amplificación de ADN.

Uracil-DNA glycosylase (UNG) es una enzima de reparación del ADN que se cleave uracil-ADN que contiene dejando el natural, que contienen timina ADN no afectado [7, 8]. Durante la PCR, deoxyuridine trifosfato (dUTP) puede ser sustituido por deoxythymidine trifosfato (dTTP) en la síntesis de ADN producto. Así, para reducir la frecuencia de falsos positivos debido a la contaminación de amplificación, una recomendación común [9 - 12] ha sido la de sustituir dUTP para dTTP como fuente de nucleótidos para la reacción de PCR. Amplificación del ADN que ha incorporado dUTP pueden ser degradados con uracil-DNA glycosylase antes de posteriores reacciones de amplificación, por lo tanto, la prevención de estas moléculas de producir resultados positivos falsos actuando como plantilla. Este enfoque de la eliminación de la contaminación por arrastre ha llevado a varios fabricantes comerciales de PCR y RT-PCR para sustituir dUTP reactivos en la mezcla de reacción en el lugar de dTTP y en el caso de algunos fabricantes a incluir UNG como un estándar en los kits de reactivos. El éxito de este sistema para la eliminación de la contaminación de amplificación de ADN depende de la disponibilidad de un termolábiles UNG enzima, la inactivación de calor-que impide la división de productos de amplificación de ADN de la plantilla objetivo. La vida media de termolábiles UNG se ha estimado en 2 minutos a 40 ° C [13] con lo que la utilización de esta enzima factible para ambos PCR y RT-PCR aplicaciones desde la transcripción reversa paso se realizó a los 45 -- 50 ° C durante 30 minutos o más.

Real-time RT-PCR utiliza fluorescencia para detectar la presencia de los productos de amplificación de la reacción ocurre. El ciclo en el que una reacción positiva es ante detectable, el ciclo denominado umbral (C T) es proporcional a la concentración de la plantilla en una muestra. Real-time RT-PCR y PCR de amplificación de los productos son normalmente mucho más corto (por ejemplo, 75 - 150 bases en la longitud), en comparación con los generados por el nivel de PCR y RT-PCR ensayos. Además de la rápida cuantificación de la plantilla de ARN, PCR en tiempo real y RT-PCR ofrece ventajas significativas sobre nivel de PCR y RT-PCR para la detección de ADN o ARN en términos de reducción de la manipulación de muestras, el tiempo necesario para el análisis y la sensibilidad analítica. Sin embargo, lo que es más importante en tiempo real ensayos han reducido (aunque no elimina) la posibilidad de resultados falsos positivos debido a la contaminación cruzada de las muestras en tiempo real desde los ensayos se llevan a cabo en un "tubo cerrado", en la que los tubos No se abrió después de la amplificación es completa. No obstante, habida cuenta de las estrictas normas en vigor para ambos humanos y laboratorios de diagnóstico veterinario y consecuencias de los importantes resultados positivos falsos, incluso los laboratorios en tiempo real utilizando métodos pueden emplear estrategias como UNG Además antes de la RT-PCR para reducir la posibilidad de falsos positivos Resultados.

Si bien el uso de UNG amplificación para eliminar la contaminación se ha informado anteriormente para ensayos de RT-PCR [14, 15], el efecto de UNG cuantitativos sobre la sensibilidad del ensayo para la detección de RNA no se ha investigado hasta la fecha. Tampoco tiene una evaluación cuantitativa de las concentraciones de contaminantes de ADN que pueden ser degradados antes de la RT-PCR se realizó. En tiempo real (cuantitativa) RT-PCR la detección de Porcino arterivirus (Arteriviridae familia, el orden Nidovirales) RNA se utilizó para estas evaluaciones. Este virus es un importante patógeno de cerdos y es por lo tanto, con frecuencia el blanco de la investigación de diagnóstico con RT-PCR en representación de los principales de ensayo para la detección de patógenos en muchos laboratorios. Algunos de alto valor porcina hatos están libres de este virus lo que hace el informe de resultados falsos positivos particularmente problemático ya que la despoblación es un método común utilizado para eliminar este virus de una ganadería. En este estudio, se demostró que termolábiles UNG había una concentración, la temperatura y el tiempo dependen de efecto sobre la RT-PCR cuantitativa la sensibilidad y la degradación del ADN. Las condiciones son optimizadas de manera que efectos mínimos sobre la meta de amplificación del ARN se observaron sensibilidad y aumentar al máximo la capacidad de degradar traspaso de la contaminación de amplificación de ADN en una muestra.

Resultados
UNG Efecto de la concentración en la degradación del ADN y RT-PCR de amplificación de ARN

Evaluar el efecto de UNG sobre la degradación del ADN y el ARN de detección, las reacciones fueron realizadas en el marco de las condiciones recomendadas, pero el proveedor de UNG (Tabla 1]. El esquema de la amplificación fue de 10 veces la dilución de ARN viral o la amplificación de ADN. La amplificación de ADN de una era anterior RT-PCR en la que se utilizó dUTP en lugar de dTTP. Una enzima y la concentración dependientes de la temperatura se observó aumento de la T de C tanto la detección de ADN y ARN. Sin embargo, en la concentración de la enzima recomendado por el proveedor (0,5 U UNG por 25 μ l de reacción), la degradación completa de amplificación de ADN no se observó a 15 ° C - 25 ° C, incluso en las reacciones que contengan menos de 250 copias (Tabla 1]. En el doble de la recomendada concentración enzimática (1,0 U UNG por 25 μ l de reacción), la degradación completa de amplificación de ADN sólo se observó a 25 ° C en las dos diluciones que contienen las más bajas concentraciones de amplificación de ADN. Usando UNG concentraciones recomendadas por el proveedor, el aumento de ARN C T se observaron valores que van de 0,28 ciclos, de UNG 0,5 U / reacción y una incubación de 15 ° C, a 1,94 para los ciclos 1 U UNG / reacción y una incubación a 25 ° C.

Para optimizar aún más el efecto de la degradación del ADN en UNG y reducir al mínimo el efecto de amplificación UNG sobre ARN, RT-PCR se realizaron reacciones que contiene una serie de UNG de concentración de incubación más largo y más alto que la temperatura recomendada por el proveedor de enzimas (Tabla 2]. Un dependiente de la concentración se observó efecto de la degradación del ADN, con el menor concentración probada UNG (0,1 U por 25 μ l de reacción) el aumento de la C T para detección de ADN, pero no a eliminar completamente la contaminación de ADN incluso al menor concentración probada. Las mayores concentraciones probadas, 0,5 y 1,0 unidades de UNG por cada 25 ul de reacción, eliminado completamente todos los detectable uracil-ADN que contiene, incluida la mayor concentración de la prueba de amplificación del ADN que contiene alrededor de 250000 copias en un 25 μ l de reacción.

UNG un efecto dependiente de la concentración se observó también para la detección de RNA por RT-PCR (Tabla 2]. La menor concentración probada UNG, 0,1 U por 25 μ l de reacción, el aumento de la media de C T detección de RNA por ciclos de 0,59, mientras que la mayor concentración de UNG probado, 1,0 U por 25 μ l de reacción, el aumento de la media C T detección de ARN de 1,90 Ciclos. Intermedia C T aumentos se observaron con 0,25 y 0,5 U UNG por reacción. Los aumentos en los valores C T para detección de RNA tras incubación con UNG corresponden a 1,5 - 3,7 veces la disminución de ARN detectable.

Efecto de la temperatura y el tiempo de incubación sobre la degradación del ADN y RT-PCR de amplificación de ARN

El efecto de la temperatura sobre la degradación del ADN y el ARN de amplificación en presencia de UNG se evaluó en tres temperaturas de incubación antes de la RT-PCR (Tabla 3]. De incubación a 25 ° C antes de la RT-PCR aumento de la C, T de ADN para la detección de 8,67 por ciclos, pero no eliminar por completo una reacción positiva aún en la más baja concentración de la amplificación del ADN. De incubación a 30 ° C y 35 ° C eliminado reacciones positivas en las tres concentraciones más bajas de ADN y el aumento de la T C para la máxima concentración de ADN de los ciclos de 16,03 y 17,09, respectivamente. Un aumento dependiente de la temperatura en C T amplificación de ARN también se observó, con temperaturas de incubación de 25 ° C y 30 ° C resulta en incrementos más pequeños en los valores C T para detección de ARN de incubación a 35 ° C.

UNG con los tiempos de incubación de 10, 20 o 30 minutos se evaluó la degradación del ADN y el ARN efecto en la amplificación por RT-PCR (Tabla 4]. Una incubación de 10 min eliminado en la detección del ADN de las más bajas y el aumento de la concentración de C T por una media de 6,58 para los otros ciclos de diluciones de ADN. Los tiempos de incubación de 20 y 30 min eliminado progresivamente más ADN de las reacciones. Una vez que dependen de aumento de los valores de T C también se observó para la detección de RNA por RT-PCR, con 30 min de incubación con UNG resulta en el mayor aumento medio de 1,42 ciclos en la C T.

Detección simultánea de amplificación del ARN y ADN degradación

Para garantizar que los importantes niveles de contaminación de ADN podrían ser degradados a la vez que el RNA se amplificó y cuantificados por tiempo real de RT-PCR, de ARN viral fue contaminada con amplificación de ADN antes de UNG incubación y RT-PCR de amplificación (Fig. 1] . Para lograr esto, una cantidad constante de amplificación de ADN generados por un competidor heteróloga (que tiene el primer oligonucleótido viral, sino una unión de diferentes reconocimiento de la secuencia de doble etiquetado TaqMan oligonucleótido sonda) fue añadido a diez veces la dilución de ARN viral. En las reacciones que no contenía UNG, aproximadamente 1000 ejemplares de la contaminación de ADN fueron detectados en cada dilución de ARN viral (Figura 1A]. Sin embargo, la adición de 0,25 U UNG por reacción con incubación a 30 ° C durante 20 min antes de la RT-PCR eliminado completamente la señal de contaminación de ADN en cada reacción (Fig. 1B]. Las curvas de amplificación para la detección del ARN viral no fueron afectadas distintas de un aumento de la T C por una media de 1,2 ciclos, un valor coherente con los resultados que se muestran arriba.

Efecto de la incubación de UNG y antes de RT-PCR en las curvas de calibración para la cuantificación del ARN

Evaluar el efecto de UNG Además de las mezclas de reacción en las curvas de calibración utilizados para la cuantificación del ARN, las reacciones fueron llevadas a cabo utilizando 10 veces diluciones de heteróloga competidor ARN (Fig. 2]. Se analizaron las curvas de calibración para las reacciones sin o con un contenido UNG UNG 0,25 unidades y se incubaron 30 minutos a 30 ° C antes de la RT-PCR. Análisis de regresión para estas curvas se compararon a una curva estándar utilizando el mismo ARN diluciones que no fueron incubadas a 30 ° C durante 20 min antes de la RT-PCR. Análisis de regresión para las tres condiciones de reacción demostrada líneas paralelas con valores de R 2> 0,99. Las pendientes de las líneas eran esencialmente iguales en aproximadamente -3,330, que indican la eficiencia de amplificación, cerca de 100%. Sólo la intercepta y-difieren entre las tres condiciones de reacción, con los valores de las reacciones que contienen UNG y se incuba a 30 ° C por 20 min ligeramente mayor que las normas que no contenía UNG y no fueron incubados antes de la RT-PCR. La intersección y el valor de las reacciones que no contengan UNG y se incuba a 30 ° C durante 20 min antes de la RT-PCR se intermedios de los otros dos valores.

La detección del ARN viral baja concentración en reacciones que contienen UNG

Para determinar si UNG Además de incubación y antes de RT-PCR daría lugar a resultados negativos falsos en las condiciones descritas, 96 replicar las muestras que contienen aproximadamente 20 copias de ARN viral por replicar fueron amplificados por RT-PCR. De las 96 muestras analizadas replicar, amplificación positiva (definida como C T <40) no se detectó en tres muestras que contenían 0,25 unidades de UNG y fueron incubadas a 30 ° C durante 30 min antes de la RT-PCR (datos no presentados). Control de las reacciones de 96 (es decir, sin UNG añadido y no de incubación antes de la RT-PCR), amplificación fue detectado en todas menos una de las repeticiones. La media de C T aumento de las muestras que contienen UNG y se incuba a 30 ° C durante 30 min antes de la RT-PCR se ciclos de 1,56, un valor de acuerdo con los resultados mostrados arriba.

Discusión

Las técnicas de PCR y RT-PCR ofrecen varias ventajas en comparación con las técnicas tradicionales de diagnóstico de virus, especialmente en términos de la sensibilidad analítica y la hora de finalización del ensayo. Lamentablemente, el alto grado de sensibilidad, que se acerca al nivel de moléculas individuales, esta técnica también hace propenso a falsos positivos. Amplicon positivos generados por anteriores reacciones en el que fue sustituido por dUTP dTTP pueden ser degradadas por la UNG y, por tanto, en teoría eliminado como fuente de plantilla que podría causar falsos positivos en PCR o RT-PCR. UNG degrada a la contaminación de uracil-ADN que contiene dejando el natural, que contienen timina ADN intacto. El preciso, reproducible cuantificación de tiempo real RT-PCR proporciona un método rápido para evaluar y optimizar el uso de UNG para eliminar o reducir los efectos de amplificación de ADN en RT-PCR, así como determinar los efectos de la detección de ARN de UNG. Los fabricantes de recomendación para el uso de termolábiles UNG incluyen además de 1 unidad de enzima por 50 μ l de reacción, seguida de un tiempo de incubación de 10 min a 15 - 25 ° C. En este estudio, la concentración de esta enzima y la incubación de las condiciones no fueron encontrados para eliminar la amplificación de ADN, presumiblemente debido al menos en parte a la corta duración de la amplificación de ADN (114 bases). Para degradar constantemente alrededor de 500 copias de amplificación de ADN, una doble UNG aumento de la concentración era necesaria. Sin embargo, esta concentración de UNG dado lugar a un aumento de casi dos ciclo de alcanzar el umbral de detección de RNA. Estos resultados han sido corroborados por una reciente publicación, utilizando PCR en tiempo real para la detección de genes de una sola copia en la que se llegó a la conclusión de que los fabricantes de 'recomendó condiciones no son suficientes para degradar constantemente incluso mínima (por ejemplo, <30 copias) cantidades de amplificación de ADN [ 16].

Para determinar las condiciones óptimas para la degradación de amplificación con un mínimo efecto sobre la detección de RNA por RT-PCR, una serie de tiempo, la temperatura y se evaluaron las concentraciones de la enzima. De estos resultados, se demostró que la degradación de UNG de amplificación de ADN en la RT-PCR fue la concentración, el tiempo y la temperatura depende, como ha sido descrito previamente por PCR en tiempo real [16]. Para permitir la degradación considerable de las concentraciones de arrastre de amplificación de ADN al tiempo que se tiene mínimos efectos en la detección de RNA, la concentración óptima de UNG resultó ser 0,25 U por 25 μ l con una reacción de pre-amplificación de incubación a 30 ° C durante 20 min. Esta incubación se realizó después de completar la reacción se había reunido en los tubos de reacción, justo antes de la RT paso. Estas condiciones completamente degradadas unas 2500 copias de las transferencias de más de amplificación de ADN al tiempo que se reduce la concentración detectables de ARN viral de la plantilla en un 2,2 veces (es decir, C, T valores aumentó en una media de 1,2 ciclos). Si los niveles más altos de contaminación por el arrastre se encuentran, el aumento del tiempo de incubación por otros 10 min demostrado la degradación de un 10 veces mayor concentración de amplificación de ADN, mientras que sólo aumentando ligeramente la C T para detección de RNA. Es interesante observar que, sobre la base de análisis de las curvas de nivel, el aumento observado en el T de C ARN se debe tanto a la presencia de UNG y la incubación a 30 ° C antes de la RT-PCR.

Dado el relativamente largo tiempo necesario para la transcriptasa inversa paso, una termolábiles UNG que es inactivada con rapidez y eficacia a temperaturas inferiores a la de la RT paso debe ser utilizado para este enfoque que debe aplicarse para el control de falsos positivos en las reacciones de RT-PCR. La venta en el comercio termolábiles UNG utilizados en el presente estudio se inactiva rápidamente a 40 ° C con una vida media de 2 minutos [13]. Al final de la UNG de incubación, las muestras se celebraron a los 55 ° C para inactivar rápidamente UNG justo antes de la RT paso que era de 50 ° C durante 30 min. Para la RT-PCR reactivos utilizados (así como muchos otros comercialmente availably reactivos RT-PCR), la fabricación se establece que la RT 30 min paso puede realizarse a temperaturas de hasta 55 ° C (o superior para algunos sistemas de reactivo), Y analizaron las reacciones en experimentos preliminares (datos no presentados) demostró ningún efecto sobre RT-PCR después de una sensibilidad analítica 2 min de incubación a 55 ° C antes de la RT paso.

Los resultados presentados en este documento demuestra que la incubación con UNG parece aumentar igualmente la C T in vitro de ARN transcrito de ARN viral y, por lo tanto, la cuantificación mediante el uso de una curva estándar puede permanecer precisa siempre que todas las reacciones se realizan en las mismas condiciones. Sin embargo, un pequeño porcentaje de muestras positivas débiles no pueden ser detectadas debido a un aumento en la C T causados por UNG y de incubación antes de RT-PCR. A la reducción de la posibilidad de falsos negativos con diluir las muestras de RNA, los resultados de este estudio sugieren que repeticiones de dos o más reacciones debería ser suficiente, dado que la tasa de falsos negativos fue sólo aumentó un 2% para las muestras que contienen UNG y incubados antes de la RT - PCR. Asimismo, dos - cinco nuevos ciclos de amplificación puede proporcionar positivo de amplificación de la meta de ARN en las muestras con concentraciones muy bajas.

Conclusión

Evaluación cuantitativa de los efectos de UNG y la degradación del ADN en ARN de amplificación en un rango de concentraciones de la enzima, las temperaturas y los tiempos demuestra que la optimización de las condiciones de reacción permite la selección de las condiciones que maximizan el arrastre y reducir al mínimo la degradación de amplificación del efecto en la detección de ARN. Aunque este estudio se realizó en tiempo real con RT-PCR para facilitar información exacta cuantificación de los efectos de la UNG, estos resultados son potencialmente útiles para ambos estándar y en tiempo real de RT-PCR métodos de amplificación.

Métodos
Cuantitativo (TaqMan) RT-PCR

Reacciones de amplificación se realizaron mediante el Qiagen QuantiTect Probe RT-PCR Kit (Qiagen, Inc, Valencia, CA) con thermocycling y detección realizada en un Stratagene Mx4000 PCR en tiempo real de máquinas (Stratagene, Inc, La Jolla, CA). Las muestras se analizaron por triplicado. El protocolo de amplificación, oligonucleótidos de doble etiquetado y de la sonda utilizada para 5 'exonuclease (TaqMan) amplificación de la América del Norte PRRSV MLV Ingelvac fueron las descritas previamente [17] y amplificado a 114-bp fragmento. La amplificación en presencia de dUTP, el sentido y la línea de lucha contra el sentido capítulo contendrá 36 y 26 de uracil residuos, respectivamente. El doble etiquetado sonda utilizada para la detección de ARN competidor heteróloga (y de amplificación de ADN derivados de la competidor ARN) fue: 5'-HEX-TGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGT-BHQ2-3 '. Todos los oligonucleótidos y de doble etiquetado fueron sintetizados por las sondas de ADN Integrado Technologies, Inc (Coralville, IA). Control de las reacciones negativas, en la que se extrae de ARN normal (no afectados) en suero o tejidos de los cerdos se añadió como plantilla para la RT-PCR la mezcla de reacción, no produce una señal de la RT-PCR cuantitativa ensayo.

Preparación de ARN competidor heteróloga

Oligonucleótidos específicos primer sitios de unión para el PRRSV en tiempo real RT-PCR ensayo se incorporaron como 5 'extensiones en PCR primers e in vitro heteróloga competidor ARN transcrito se preparó y cuantificados por espectrofotometría utilizando métodos anteriormente descritos [18].

La extracción de RNA viral

Porcino arterivirus extracción de RNA de cultivo de células de las poblaciones de la cepa de la vacuna viva modificada Ingelvac (derivados de serie paso de los EE.UU. prototipo de la cepa VR-2332) se ha realizado mediante el kit Qiagen RNA viral (Qiagen, Inc, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante Instrucciones. Viral existencias se prepararon de células MARC-145 llevan de Dulbecco modificada de Eagle suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino y 2 mM de L-glutamina, 0,25 μ g / ml fungizone, y 0,5 mg / ml de gentamicina (todas suministradas por Mediatech, Inc, Herndon, VA). La infección viral de los cultivos celulares se mantuvieron a 37 ° C en una humidificado 5% de CO 2 vivero de aproximadamente 2 días hasta efecto citopático viral fue identificar fácilmente a toda la cultura. La extracción de RNA heteróloga competidor después de la transcripción in vitro se ha realizado mediante el Qiagen RNeasy kit (Qiagen, Inc, Valencia, CA).

UNG tratamiento de las reacciones antes de la RT-PCR

Los concentraciones de termolábiles uracil-DNA glycosylase (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN), purificado de la psychrophilic organismos marinos BMTU 3346 [13] se han añadido a la mezcla de amplificación maestro antes de la dispensación en los tubos de amplificación. Las muestras fueron luego celebrada en la termociclizador a las temperaturas indicadas para el indicado veces antes de la RT-PCR. Al final de la incubación, la termociclizador se programó a la rampa de muestras en el tipo máximo (2,2 ° C / sec) a 55 ° C y mantener a esta temperatura durante 5 min antes de los 50 ° C, 30 min RT paso. Control de las reacciones, que no contenía UNG y no fueron sometidos a incubación antes de la RT-PCR, fueron colocados en la termociclizador al comienzo de la fase de 55 ° C, antes de los 50 ° C, 30 min RT paso.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Agradecimientos

El autor desea agradecer Soleado J. Troxell y de expertos dedicado a técnicas.