World Journal of Surgical Oncology, 2005; 3: 18-18 (más artículos en esta revista)

Aumento del número de células epiteliales que circulan difundido después de la cirugía de pulmón de células no pequeñas de cáncer supervisado por MAINTRAC ® es un predictor de la recaída: un informe preliminar

BioMed Central
Axel Rolle (dr.rolle @ fachkrankenhaus-coswig.de) [1], Rainer Günzel (dr.rolle @ fachkrankenhaus-coswig.de) [1], Ulrich Pachmann (tzb.info @ t-online.de) [2] , Babette Willen (tzb.info @ t-online.de) [2], Klaus Höffken (klaus.hoeffken @ med.uni-jena.de) [3], Katharina Pachmann (katharina.pachmann @ med.uni-jena. De) [2]
[1] Fachkrankenhaus Coswig / Dresden, der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Alemania
[2] TZB Transfusionsmedizinisches Zentrum Bayreuth, der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Alemania
[3] Klinik für Innere Medizin II der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Alemania

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Resumen
Antecedentes

El cáncer de pulmón sigue siendo uno de los más frecuencia los tumores sólidos, y aún en fase Ia, la cirugía fracasa en el 30% de los pacientes que desarrollan metástasis a distancia. Se aventura la hipótesis de que estos deben haber desarrollado a partir de células tumorales circulantes oculta presente en el momento de la cirugía, o antes. El objetivo del presente estudio fue detectar esas células en la sangre periférica y para controlar estas células después de la cirugía.

Métodos

30 pacientes tratados por cáncer de pulmón con la cirugía fueron controlados por distribuir células epiteliales (CCA), tomando muestras de sangre periférica antes, 2 semanas y 5 meses después de la cirugía y / o radioterapia (RT), quimioterapia (CT) como en combinación con RT / CT magnetico utilizando talón Enriquecimiento y citometría de escaneo láser (MAINTRAC ®) para la cuantificación de estas células.

Resultados

En el 86% de los pacientes CCA se detectaron antes de la cirugía y en el 100% a las 2 semanas y 5 meses después de la cirugía. En el grupo control, que consiste de 100 donantes normales sin cáncer, el 97% fueron negativos para la CCA. Un número significativamente mayor de la CCA se encontró preoperatoria en pacientes con carcinoma de células escamosas que en aquellos con adenocarcinoma. En correspondencia con la magnitud de la manipulación del parénquima 2 semanas después de la cirugía, un aumento en el número de CCA se observó con resecciones limitadas (18/21), mientras que neumonectomía dado lugar a una disminución (5 / 8) de la CCA, 2 semanas después de la cirugía. El tercer análisis realizado 5 meses después de la cirugía identificado 3 grupos de pacientes. En el grupo de 5 pacientes que recibieron neo-adyuvante o quimioterapia / radioterapia había pruebas de que la vigilancia de la CCA puede evaluar los efectos de la terapia. Otro grupo de 7 pacientes que se sometieron a cirugía sólo mostró una disminución de la CCA y sin signos de recidiva. Un tercer grupo de 11 pacientes que sólo la cirugía, mostró un aumento de la CCA (4 con un primer descenso después de la cirugía y 7 con el continuo incremento). En el grupo con un crecimiento continuo durante los siguientes 24 meses, 2 principios de las recaídas en pacientes con adenocarcinoma estadio Ia se observaron. El aumento de la detección clínica CCA precedida por seis meses.

Conclusión

Consideramos, por lo tanto, que los pacientes con adenocarcinoma y el continuo incremento de la CCA después de la resección completa de cáncer de pulmón tienen un mayor riesgo de recaída temprana.

Antecedentes

El cáncer de pulmón sigue siendo el tumor sólido más frecuente en los hombres y representa la principal causa de muerte en las mujeres desde la década de 1980 en los EE.UU. [1]. Debido a un aumento constante en el hábito de fumar cigarrillos, incluso en Europa y Alemania, el cáncer de pulmón se ha convertido en tres veces más común en las mujeres durante los últimos 20 años [2].

A pesar de grandes progresos en el diagnóstico, el tratamiento y la multimodalidad de los pacientes con cáncer de pulmón el pronóstico se ha mantenido persistentemente mala durante los últimos 50 años, con tasas de supervivencia a 5 años del 9% para todos los pacientes [3]. El dilema terapéutico se hace evidente si los resultados de la fase I se examinan casos de cáncer de pulmón. Si los pacientes sometidos a una resección completa, la terapia de elección, y luego los 5 años de supervivencia es del 70%. Pero el tratamiento no ha logrado para el 30% de los pacientes que desarrollan metástasis a distancia en los dos años siguientes a la cirugía [4]. La metástasis en estos pacientes deben haber desarrollado a partir de células tumorales circulantes oculta presente en el momento de su original de la cirugía, o antes, llevando a una subestimación de la verdadera tumoral. Pantel et al [5] detectado células epiteliales en el 20-25% de las biopsias tomadas dentro de la cirugía de la médula ósea después de la resección del cáncer de pulmón. Sin embargo, aún hoy el papel de citoqueratina positivos en las células de médula ósea aún no está claro. Es posible que hayan llegado desde el tumor en una etapa temprana, o sembradas en la circulación durante la cirugía. Lt tampoco es claro si estas células tienen actividad proliferativa o son las llamadas células durmientes [6].

Utilizando un método rápido para la determinación de distribución de las células epiteliales (CCA) en la sangre periférica [7], que permite el seguimiento de estas células en virtud de la terapia, nos muestran que un único examen no es suficiente para determinar el resultado. Sin embargo, es necesario vigilar el comportamiento de estas células en el tiempo para poder predecir la recurrencia del tumor.

Métodos y métodos

Anti-coagulado de sangre periférica muestras fueron extraídas después de consentimiento informado de un grupo control de 100 sujetos normales de edades comprendidas entre los 17 y 73 años y entre el 30 de los pacientes antes de las sucesivas, y dos semanas después, la cirugía para el cáncer de pulmón. Una tercera muestra se obtuvo de 3 a 5 meses del postoperatorio, cuando los pacientes se observaron para el seguimiento. En todos los pacientes se siguieron los controles de rutina hasta 27 meses o la muerte con una mediana de seguimiento de 22 meses.

Siete pacientes fueron excluidos. En el caso de un paciente de cáncer de pulmón no se confirmó tras el análisis histológico y en otro paciente cáncer de pulmón avanzado se combina con la sarcoidosis. En 5 pacientes una o dos muestras fueron desaparecidos, por lo tanto, estos casos se omitieron y, a pesar de que no hay ninguna discrepancia más. De los restantes 23 pacientes, para que todos los datos y el seguimiento se completa, 20 eran hombres (edad media 64 años, rango 55 - 74 años) y 3 eran mujeres (edad media de 53 años con un rango entre 40 - 74 años) con un Equilibrada proporción de pronto para etapas avanzadas de cáncer de pulmón (12:11). En escena fue realizada por la radiografía de tórax, endobrochial broncoscopia, tomografía axial computerizada (TAC), el rastreo óseo, el disección de los ganglios linfáticos y el tamaño de los márgenes libres de tumor. Más información acerca de la cirugía, el tipo histológico de tumor etapa y el número de CCA se muestra en el cuadro 1.

Preparación de células

Los glóbulos rojos de 10 ml de muestras de sangre fueron lisadas, los glóbulos blancos de la sangre de ésta se gira hacia abajo y las células epiteliales se enriqueció mediante micro perlas de Miltenyi (Bergisch Gladbach, Alemania) [7] o el método de Diagnóstico por Labsoft (Halle, Alemania) [ 8]. Ambos métodos dado resultados comparables. El mismo método se utiliza siempre en el seguimiento de las muestras de la misma paciente. Las células se tiñeron de ratón conjugado con FITC anti-epiteliales de anticuerpos humanos (HEA, Milteny, Bergisch Gladbach, Alemania), reaccionó bien con HEA-micro-perlas de Miltenyi (Bergisch Gladbach, Alemania) o de células Seleccionar-micro-gránulos (Labsoft Diagnóstico Halle, Alemania) y, a continuación, bien separados más de las columnas Miltenyi proporcionada por la empresa de acuerdo a su descripción o en los viales que contienen las células se aplicaron a los imanes Labsoft proporcionada por la empresa. Negativas de las células que no estén obligados en las columnas se lavaron, las columnas eliminado del imán y la conserva células eluyen. En el método de células no Labsoft adjunta a la pared del vial eran absorbidas por fuera, los viales eliminado del imán y de las células retenidas en los viales fueron luego enjuagarse frente a la pared y estudiado.

Análisis

Para mediciones de las células se aplicaron a la adhesión de diapositivas (Menzel, Gläser, Alemania) y las mediciones empezaron cuando las células se han instalado usando un láser de escaneo Cytometer (LSC Compucyte ® Corporation, Cambridge, MA, EE.UU.). Las células podrían fácilmente ser contorneada y de manera inequívoca el uso de dispersión hacia adelante como un parámetro umbral. Antecedentes de fluorescencia se determinó dinámicamente para calcular tanto pico y en un integrante por fluorescencia de células fluorescentes hacer la base de cálculo equivalente para todas las células. La fluorescencia verde se muestran como scattergrams e histogramas.

La LSC ® permite al usuario trasladar las células contenidas dentro de la población positiva para el examen visual a través del microscopio (Figura 1]. Además una cámara CCD adjunta al microscopio permite tomar fotos y fluoromicrographs al mismo tiempo. Más detallado se podrá determinar la morfología en la tinción convencional panóptico (Figura 1].

Resultados

Circulante células epiteliales (CCA) fueron detectables en muestras de sangre de 25/29 pacientes (86%) antes de la cirugía, mientras que el 97% de los controles normales fueron negativos para estas células. El número de la CCA se calculó en relación con el volumen de sangre analizadas y no a los glóbulos blancos de la sangre, que varían considerablemente en el curso de la enfermedad. A 26 pacientes se disponía de evaluación histológica y reveló 15 casos de adenocarcinoma y 11 casos de carcinoma de células escamosas. La comparación de los números de la CCA preoperatorio revelaron valores más altos en pacientes con células escamosas que en aquellos con adenocarcinoma y de estos valores difirieron significativamente (p = 0.046) (Figura 2]. Ni el tamaño ni la positividad de los ganglios linfáticos correlaciona con el número de células tumorales circulantes antes de la cirugía. Con respecto a la extensión de la resección 1 pleurectomy, 8 pneumonectomies, 1 bilobectomy, 12 lobectomies, 4 resecciones segmentarias y 3 exploratorio thoracotomies se realizaron. Lobectomía es más frecuente que la neumonectomía en pacientes con adenocarcinoma (69% vs 36%) y más frecuente que la neumonectomía lobectomía en aquellos con carcinoma de células escamosas (54% frente a 6%) (Figura 3].

Catorce días del postoperatorio, la CCA se detectaron en todos los pacientes, incluidos los 3 células de las que no había sido detectable antes de la cirugía. En los casos con resección limitada (3 exploratorio thoracotomies, 4 resecciones segmentarias, 12 lobectomies, 1 bilobectomy) del parénquima manipulación era más amplia. Esto dio lugar con más frecuencia en un aumento (85,7%) que en una disminución (14,3%) en la CCA, mientras que en los casos de resección completa del pulmón (neumonectomía) disminuyó el número de CCA (62,5%) con más frecuencia que el aumento (37,5%) (Figura 4]. Nosotros, también, la CCA investigó en un paciente que había para la cirugía y de neumotórax observó un aumento comparable en la CCA como en el tumor de los pacientes, pero con una rápida disminución re-ya después de dos semanas (Figura 5a].

Un tercer análisis de la CCA se realizó entre el 3 y 5 meses después de la cirugía. En 23 (76%) de 30 pacientes consecutivos considerada no resecable tienen un cáncer de pulmón de células pequeñas (NSCLC) se disponía de datos completos con una mediana de seguimiento de 22 meses (rango 9 - 27 meses) (Tabla 1].

Cinco de los 23 pacientes sometidos a quimioterapia (CT) o quimioterapia / radioterapia (CT / RT). Estos pacientes fueron considerados separadamente de los 18 pacientes que habían completa resección curativa de sus tumores sin tratamiento adyuvante. Dos pacientes fueron sometidos a toracotomía exploratoria: una con carcinoma de células escamosas (paciente 10) fue tratado con CT adyuvante con la consiguiente disminución de la CCA y sigue vivo 25 meses después de la cirugía. El otro paciente con adenocarcinoma (paciente 16) mostró un aumento de la CCA, a pesar de la combinación de RT / CT y 9 meses más tarde murió con la progresión tumoral.

Tres de los 21 pacientes con resección del tumor recibió tratamiento adicional: 1 lobectomía paciente con adenocarcinoma había estado ganglionar N2 (paciente 19). Este paciente con un nivel N2 estado recibieron RT adyuvante. Posteriormente, mostró una disminución de la CCA y está vivo, 23 meses después de la cirugía, sin signos de recidiva. Un paciente con carcinoma de células escamosas (paciente 1) recibieron terapia neoadyuvante y posteriormente fue tratado con neumonectomía. Él mostró un ligero aumento de la CCA, pero todavía está vivo, sin signos de recidiva. Otro paciente con adenocarcinoma (7 pacientes) fueron sometidos a RT, pero con ninguna disminución significativa en la CCA y murió 26 meses más tarde con la progresión tumoral. Entre estos nuevos pacientes que recibieron radioterapia y / o quimioterapia recaídas ocurrieron sólo en aquellos con adenocarcinoma y el aumento de los números de la CCA, a pesar del tratamiento.

De los otros 18 pacientes que habían resección curativa completa de los tumores, 7 mostraron una disminución, y 11 mostraron un aumento de la CCA durante los 3-5 meses de seguimiento después de la cirugía.

De los 7 pacientes ex 6 habían tenido cada vez mayor el número de células después de la cirugía y, posteriormente, disminuyendo en los meses siguientes (los pacientes 11, 17, 20, 21, 22, 23), 4 con adeno-y 2 con carcinoma de células escamosas y todas menos una ( Paciente 21) había lobectomía (Figura 5a]. Todos se encuentran en remisión completa continua. 1 paciente (4 pacientes) con carcinoma de células escamosas ha neumonectomía y disminuye el número de células (Figura 5c], y él, también, está en remisión completa continua.

Entre los 11 pacientes con aumento de la CCA hubo 4 con un primer descenso después de la cirugía seguida de un incremento posterior (Figura 5c]. Ninguno ha mostrado principios de la recaída hasta el momento. Siete con un crecimiento continuo, desde antes de la cirugía y 5 meses después del tratamiento (Figura 5b], 4 con carcinoma de células escamosas y el adenocarcinoma con 3. Dos recaídas se observaron entre estos pacientes durante el posterior de 2 años de seguimiento. Los dos, un hombre (56 años) y una mujer (41 años de edad), había adenocarcinoma fase I bis. Tenían continuamente creciente CCA y el incremento se ha producido seis meses antes de repetidos exámenes clínicos podría verificar la enfermedad recaída. Ambos recibieron quimioterapia después del diagnóstico de la recaída, pero falleció a pesar de 9 y 24 meses después de la cirugía con sistémica propagación de su tumor.

En resumen, entre los pacientes con tratamiento adyuvante tras la resección, así como en curatively resecado pacientes, los pacientes con adenocarcinoma y de un continuo aumento de la CCA en el curso de su enfermedad tienen un riesgo significativamente mayor de recaída temprana que aquellos con disminuyendo el número de células y Que aquellos con carcinoma de células escamosas, aunque estos últimos muestran un número creciente de la CCA.

En los pacientes que recayeron no solo los valores de las células tumorales circulantes en diferentes puntos de tiempo, pero sólo el aumento en el número de células es un factor predictivo de recaída.

Discusión

El análisis de las células epiteliales que circulan en la sangre periférica de pacientes con pulmón de células no pequeñas de cáncer, hemos sido capaces de detectar CCA viven en el 86% de los pacientes antes de la cirugía. Esto representa un número significativamente más elevado y frecuencia que informó de otros grupos de análisis de micrometástasis tomadas de la médula ósea [9, 10], pero el número de células se encuentran en el mismo rango que las indicadas por Cristofanilli y compañeros de trabajo [11]. Esta discrepancia se puede explicar por varias modificaciones de la validez de la manipulación de análisis: 1) En contraste con la antigua autores [9, 10] hemos utilizado lisis de glóbulos rojos [7] para la preparación de células blancas de la sangre. Durante ficoll-separación usados en la preparación de las células de aspirado de médula ósea se observó una pérdida de hasta el 90% de las células epiteliales antígeno positivo y no hay ninguna razón por la que circulan las células epiteliales debe tener la misma densidad de propiedades que las células mononucleares (Pachmann presentado para su publicación] 2.) Micrometastatic células pueden ocultarse en la grasa de los grumos aspirado de médula ósea y, por tanto, se perderá cuando el análisis para la preparación de suspensiones de células mononucleares. 3) La parte de la sangre a admixed aspirado de médula puede variar entre el 10 y el 90%, resultando en una alta variabilidad de los materiales utilizados para el análisis. A pesar de que el método aplicado por nosotros también es adecuado para muestras de la médula ósea, que prefiere el análisis de muestras de sangre periférica, que son fáciles de obtener y se pueden extraer varias ocasiones.

El número de CCA detectado por nosotros en pacientes con cáncer de pulmón es algo inferior a la cifra registrada recientemente por Cristofanilli et al [11] en pacientes con cáncer de mama metastásico. En pacientes positivos encontramos entre los años 2000 y 6 × 10 6 células epiteliales calcular el número de células en la circulación asumiendo que el paciente tiene aproximadamente 5 litros de sangre. Los valores de 5 a 22000 células por 7,5 ml de sangre reportados por Cristofanilli et al [11] se traduciría en 3000 a 13 × 10 6 células en la circulación. La frecuencia de forma preoperatoria CCA pacientes fue comparable a la de Racila et al [12] y Krag et al [13], que también se utiliza un método similar para el análisis de sangre de pacientes con cáncer de mama.

Hemos preferido la detección de anticuerpos fluorescentes obligados a vivir la superficie de las células epiteliales antígeno positivo realizado por un láser de escaneo automatizado Cytometer LSC ® a los métodos basados en PCR. PCR métodos son actualmente considerados como los más sensibles procedimientos, pero hay una alta frecuencia informó de falsos positivos [14 - 16]. Además, nuestro procedimiento de separación posterior, e incluso el cultivo de las células aisladas. Definitivamente el cultivo de permitir la determinación de si las células están en suspenso, o tienen la potencia de la diferenciación en las células tumorales.

Cabe mencionar que se observó significativamente mayor número de CCA preoperatoria en pacientes con carcinoma de células escamosas que en aquellos con adenocarcinoma. Esto puede ser debido a la más antigua está situado en el centro (junto a los grandes vasos) que podría conducir a una mayor difusión que se da en los tumores ubicados más periféricamente.

Dos semanas después de la cirugía todos los pacientes fueron positivos para la CCA, pero no hay correlación de fase, el tamaño del tumor o afectación ganglionar. Inesperadamente se observó una fuerte correlación entre el aumento postoperatorio y resecciones limitadas (resecciones segmentarias y lobectomies) y una disminución de la CCA después de pneumonectomies. Sólo podemos explicar esta observación por la ampliación del parénquima manipulación de la participación de la separación entre los lóbulos del parénquima puentes y fines de la ligadura de los vasos pulmonares durante lobectomies o segmentectomies. En contraste, normalmente pneumonectomies comenzar con la ligadura de los vasos y la posterior resección del pulmón. Si nuestros datos confirman una vez más la importancia del cuidado de "no tocar" preparación durante resecciones oncológicas [17].

Sin embargo, durante las resecciones del parénquima también, las células epiteliales normales de los pulmones se pueden movilizar y lavarlo entrar los buques. Esto puede ser cierto en el caso de que se observó una reducción de la CCA durante los siguientes seis meses de observación. Nuestros intentos de diferenciar benigno aisladas células epiteliales de las células malignas por su morfología no, y las técnicas de biología molecular tendrá que ser aplicada [18, 19] para resolver este problema. Pero en general se acepta la premisa, que se difundirán las células normales mueren en un corto período de tiempo, y sólo la parte de las células malignas que se tendrá una posibilidad de supervivencia de desconocidos períodos de tiempo. [18]. Control de la CCA después de cinco meses, por lo que se espera para la detección de supervivientes sólo células epiteliales malignos. Una vez más encontramos la CCA en todos los pacientes.

Análisis del aumento o la reducción de la CCA en los 5 pacientes que recibieron tratamiento neoadyuvante y / o CT y RT adyuvante debido a su condición nodal se indica que este parámetro puede eventualmente convertirse en un instrumento para vigilar la eficacia de las intervenciones terapéuticas, un efecto que realmente estamos investigando Ahora en los pacientes que recibieron la TC para el cáncer de pulmón.

De los 18 pacientes tratados con resección curativa completa todos los 7 pacientes del grupo con una disminución del número de la CCA fueron sin signos de recaída hasta 27 meses después de la cirugía. En el grupo de 11 pacientes con un número cada vez mayor de la CCA, 6 carcinomas de células escamosas y ninguno de ellos ha recaído durante el tiempo de observación de 2 años, de conformidad con los datos publicados [20]. En cambio, en el grupo de los adenocarcinomas 2 / 5 principios de recaídas se observó, tanto en pacientes con etapa I bis con el aumento de la CCA precedida recaída clínica abierta por 6 meses.

Conclusión

Así, el seguimiento postoperatorio de la CCA puede convertirse en un predictor pronóstico fiable de la recaída. La observación de que sólo el 20% de los pacientes en el grupo de riesgo desarrollar principios de la recaída confirmada por otros estudios [21] y que los pacientes con carcinomas de células escamosas pueden tener altos y en el tiempo, incluso un número cada vez mayor de la CCA requieren análisis adicional sobre la CCA para obtener Más información sobre su potencial metastásico [22]. Estos análisis sobre enriquecido aisladas y cultivadas CCA se están llevando a cabo en nuestro laboratorio.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

AR: llevaron a cabo los estudios, y redactado el manuscrito

RG: concibe el estudio, y participaron en su diseño y coordinación

UP: participó en el diseño del estudio y realizó el análisis estadístico

BW: llevó a cabo el inmunoensayos

KH: preparación del manuscrito

KP: participó en el diseño del estudio y realizó el análisis estadístico

Todos los autores leído y aprobado el manuscrito

Beca de investigación

No declarado

Agradecimientos

Ninguno