AIDS Research and Therapy, 2005; 2: 2-2 (más artículos en esta revista)

Vigilancia procesados, maduros virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 partículas inmediatamente después del tratamiento con un inhibidor de la proteasa que contienen régimen de tratamiento

BioMed Central
Heather A Baird (hab5@case.edu) [1], Andre J Marozsan (anm2036@med.cornell.edu) [1], M Michael Lederman (michael.lederman @ case.edu) [1], Alan Landay (alanday @ Rush.edu) [3], Donna Mildvan (mildvan@ix.netcom.com) [4], Daniel Kuritzkes R (Daniel.Kuritzkes @ UCHSC.edu) [5], Harold A Kessler (hkessler@rush.edu) [6], Eric J Artes (eja3@case.edu) [1]
[1] de la División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de casos y el Centro de Investigación para el SIDA, la Universidad Case Western Reserve, Hospitales Universitarios de Cleveland, Cleveland, OH, EE.UU.
[2] Departamento de Farmacología de la Facultad de Medicina Case, Case Western Reserve University, Cleveland, OH, EE.UU.
[3] Departamento de Inmunología y Microbiología, Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center, Chicago, IL, EE.UU.
[4] División de Enfermedades Infecciosas, Beth Israel Medical Center, New York, NY, EE.UU.
[5] Escuela de Medicina de Harvard, Brigham and Women's Hospital, Boston, EE.UU.
[6] Sección de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center, Chicago, IL, EE.UU.

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Resumen

Inhibidores de la proteasa (IP) bloquean el VIH-1 en una maduración de partículas infecciosas del virus mediante la inhibición de la proteasa procesamiento de gag y gag-pol proteínas precursoras. Hemos utilizado un simple anti-VIH-1 p24 Western blot para supervisar la tramitación de los precursores gag p55 en la cápside p24 maduras inmediatamente después de la primera dosis de un IP que contienen régimen de tratamiento. Prueba de PI Se observó actividad en el plasma virus tan pronto como 72 horas después del tratamiento de inicio y fue predictivo de disminución de ARN viral en plasma a las 4 semanas.

Antecedentes

Asamblea y el transporte de los 55 kDa gag (p55 gag) y 160 gag-pol (p160 gag-pol) proteínas de la membrana plasmática interior es esencial para el embalaje de la genómica viral RNA, tRNA Lys anfitrión, el 3 de ejemplo, así como De las interacciones con el VIH-1 sobre de las glicoproteínas [5]. Floracíon y el virus de liberación inicia la tramitación de la gag y gag-pol proteínas precursoras. Esta etapa de procesamiento que requiere la dimerización de dos precursores gag-pol (por lo menos en la región de la proteasa) que permite a una baja eficiencia de la división de las proteínas precursoras de la liberación plena y activa la proteasa (PR) homodimeros [16]. Estas enzimas continuación, la maduración completa de proteínas para producir partículas de un virus infeccioso. Por lo tanto, los inhibidores de la proteasa (IP) parecen ser más activos en el bloqueo de la replicación del VIH-1 en la siguiente brotación de las partículas del virus inmaduro [4, 6]. En cambio otros medicamentos antirretrovirales (ARV), como inhibidores de la transcriptasa inversa de nucleósidos (INTI) y los no análogos de nucleósidos inhibidores de RT (NNRTI), el bloque de la transcripción reversa durante intracelular de la replicación del VIH-1 [3].

Hasta la fecha, el mejor método para controlar la inhibición de la replicación del VIH-1 es evaluar las concentraciones de virus en el plasma [10]. Varios comerciales, aprobado por la FDA kits de ensayo (VIH-1 Quantiplex (bDNA) ensayo, AMPLICOR HIV-1 MONITOR ensayo, NucliSens HIV-1 ensayo) se refieren a la medición de los niveles de virus a través de la transcripción reversa PCR-amplificación genómica del ARN del VIH-1 [8] . Es importante reconocer sin embargo, que estas pruebas no pueden vigilar la propiedades farmacodinámicas de muchos agentes antirretrovirales inmediatamente después de iniciar el tratamiento. Inhibidores de la proteasa del VIH-1 bloque de la proteasa del virus de la transformación de las células en libertad, en contraste con NNRTIs INTI o que inhiben la replicación intracelular durante una etapa, es decir, la transcripción reversa. La vida media del virus en plasma se estima en aproximadamente 6 horas [13, 18]. Pero la vida media de activar las células CD4 + y la producción de infectados con el VIH, incluso en presencia de inhibidores de la proteasa, es aproximadamente de 1,2 días [13, 18, 19] durante la primera etapa decadencia Un ensayo de medición de los niveles de ARN viral no distingue entre el virus inmaduros (procesamiento Bloqueado por IP) y el virus infeccioso, que encapsidate HIV-1 RNA genómico. La duración prevista para los inhibidores de la proteasa para borrar la mayoría de las partículas de virus libre de la circulación y activan las células (no latente o inactivo células infectadas) es de aproximadamente 4 semanas. Así, un ensayo realizado RNA viral en plasma no ofrece una evaluación completa de los PI actividad durante al menos 1-4 semanas.

Métodos

En este estudio, hemos probado la capacidad de los tres ensayos para medir la cantidad de viriones infecciosos tanto defectuoso y / inmaduros de partículas virales en el plasma de pacientes infectados por VIH que iniciaron el tratamiento con un IP-régimen. La realización de tres ensayos de validación in vitro utilizando infectados por VIH-1 en líneas celulares de la presencia o ausencia de inhibidores de la proteasa y otros antirretrovirales. Estas pruebas fueron seguidas por análisis in vivo utilizando muestras de plasma de pacientes que recibieron un IP basado en régimen de tratamiento. A continuación se presenta un breve resumen de los dos primeros ensayos que podrían detectar los efectos de la PI actividad in vitro, pero no in vivo.

El primer ensayo participan medición de potencial de virus infeccioso. Estamos en serie de células diluida cultura libre de sobrenadantes de crónicamente infectados por el VIH U87.CD4.CCR5 células tratadas con inhibidores de la proteasa. Este plasma diluido y sin diluir, se añadirá a no infectada células mononucleares de sangre periférica (PBMC). A pesar de que este ensayo se podría utilizar para medir el potencial infeccioso de alto título de virus en el cultivo de tejidos, sólo plasma que contiene una carga viral extremadamente alta (> 10 4 copias de ARN viral / ml) podría apoyar cualquier infección por VIH-1 tratados de PHA/IL-2 PBMC independientemente de la condición de tratamiento de los pacientes (datos no presentados). La concentración de los virus por ultracentrifugación hicieron muy poco para aumentar título de virus infecciosos de plasma.

El segundo ensayo de amplificación de PCR involucrados fuerte-stop ADN viral encontrado en la celda libre de virus. En informes anteriores se ha demostrado que el ADN viral se encuentra partículas de VIH-1 [9, 17], sino que estéricos trabas o la falta de sustratos dNTP límite de la transcripción reversa y la presencia de ADN viral a 1:10000 a 1:1000 viriones [1, 2] . Hemos demostrado que un defectuoso proteasa suprime la síntesis de todo el ADN del VIH-1 en el virus de partículas [1, 2]. VIH-1 fuerte ventanilla de ADN no se detectó mediante amplificación por PCR de virus producidos a partir de las células con infección crónica en presencia de inhibidores de la proteasa (datos no presentados). Sin embargo, la carga viral de> 10000 RNA copias / ml en pacientes que se requiere incluso para detectar la presencia de ADN del VIH-1 en plasma, que es coherente con resultados anteriores. Por lo tanto, este ensayo no era eficaz para los pacientes que empiezan la terapia IP con una carga viral más baja (<10 3-4 RNA copias / ml).

En contraste con los ensayos descritos anteriormente, un anti-p24 Western blot tuvo éxito en la medición tanto in vitro como in vivo PI efectos y fue la más simple en su diseño y aplicación. Inicialmente a prueba este ensayo nos U87.CD4.CXCR4 células infectadas con un virus de tipo salvaje HXB2 o el inhibidor de la proteasa del virus resistente, RF (PR contiene mutaciones I84V y V82F) [12]. Tras establecerse la infección del virus de la producción y estable durante tres días (según la medición de la actividad RT en la cultura sobrenadante), culturas fueron tratados con 0,2 y 20 nM lopinavir (LPV) o 2 y 200 nM nevirapina (NVP). La mayor concentración de cada fármaco fue de aproximadamente 100 veces mayor que el informado IC 50 valores (es decir, concentraciones más bajas de cada droga) [11, 14, 15]. Sobrenadante de células de la cultura libre (1 ml) fue cosechado en el 0, 4, 8, 24, y 72 h después Además de drogas. Virus se pildoradas desde el sobrenadante por ultracentrifugación (35000 g durante 1 h) y luego resuspendido en 50 μ l de dodecil-sulfato sódico (SDS) buffer de lisis (1% SDS, 10% de glicerol, 10% β-mercaptoetanol, Tris 0,04 M pH 6,8); de 10 μ l, que se calienta a 95 ° C, separados en Tris-HCl-12,5% prefabricados de geles de poliacrilamida (Bio-Rad), y transferir al polivinilideno difluoride membranas (Immobilon P; Millipore) por electroblotting (BioRad). Membranas fueron incubadas con el bloqueo de reactivos (5% de leche-0,05% de Tween-fosfato en bufferedsaline) durante 1 h a temperatura ambiente luego hibridizado con un ratón anti-p24 anticuerpo monoclonal (diluida 1:1000; Fitzgerald Industries International, Inc) en la noche a la mañana 4 ° C. Tras el lavado, las membranas se incubaron con peroxidasa de rábano-conjugado de cabra anti-ratón IgG1 antisuero (diluida 1:40000; Pierce) por 3 horas. Inmunocomplejos que se visualiza con el sistema ECL (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las películas fueron analizados utilizando el software BioRad Cantidad Uno.

Resultados y discusión

Fig. 1, paneles AyB muestran los análisis Western blot y p55: p24 ratios de dos virus crecido en el cultivo de tejidos, RF (inhibidor de la proteasa resistente) y HXB2 (inhibidor de la proteasa sensible) y tratadas con 20 nM LPV. Dos grandes bandas apareció en la película de la ECL blot. El más rápido fue el producto de la migración de procesado cápside p24 (CA) y la banda fue más lento que emigran sin p55 gag. Observamos cantidades ínfimas de parte cleaved gag producto que contenga la matriz (MA), p17 y p24 CA, es decir, 41 kDa. En esos experimentos, los HXB2 p55: p24 aumenta durante las primeras 72 horas, de 20 nM LPV tratamiento que indica una inhibición de la transformación gag. En cambio, no había pruebas de una disminución de los precursores gag con el procesamiento de RF virus tratadas con 20 nM LPV según lo indicado por una constante p55: p24 ratio de 0,1 en las primeras 72 h de tratamiento. El tratamiento con una menor concentración de LPV (0,2 nM) o con NVP (2 o 200 nM) no dio lugar a una diferencia significativa en la HXB2 o RF p55: p24 ratios en el tiempo (datos no presentados). En el cultivo de tejidos, ya los tiempos de incubación con LPV (20 nM), el virus de la reducción de la producción a niveles en los que las cantidades de p55 y p24 productos son difíciles de detectar por análisis de Western blot.

Para probar la utilidad de este simple ensayo Western blot para supervisar el tratamiento inicial PI, nueve pacientes que se inscribieron en la A5036s Subestudio del ensayo clínico ACTG A5014 Subestudio [7]. Todos los pacientes en tratamiento ARV A5014 eran ingenuos y fueron asignados aleatoriamente a recibir o bien + LPV el no nucleósido inhibidor RT + NVP o NVP tres nucleósidos inhibidores de RT: lamivudina (3TC) + stavudine (D4T) + abacavir (ABV). Todos los participantes y los investigadores en este estudio fueron cegados a los brazos de tratamiento. Diez ml de sangre se señalaron en Acid Citrato Dextrosa (ACD) tubos antes de la primera administración del fármaco, entonces 4, 8, 12, 24, 72 horas, tres días y cuatro semanas post administración del fármaco. Dos alícuotas de 3,5 ml de plasma fueron enviadas en hielo seco a CWRU y luego se almacena a -70 ° C antes de su análisis.

Además de los análisis de Western blot, el sub-estudio también se pide una medida del potencial infeccioso por el VIH-1 se encuentran en el plasma. Para estas pruebas estamos expuestos VIH-negativos células mononucleares de sangre periférica de muestras de plasma obtenidos antes e inmediatamente después del tratamiento con la PI-PI-o no contengan régimen TARGA. Sólo las muestras de plasma de un paciente (de 9) dio lugar a la infección productiva de PHA/IL-2 tratados PBMC culturas lo que sugiere que este no es un ensayo sensible. Desafortunadamente, no hay evaluación de la actividad de PI pueden ser evaluados utilizando este ensayo infecciosas ya que este paciente fue tratado con NVP y los tres INTI. Es poco probable que los niveles virales en el plasma es el único factor que contribuye a la capacidad del virus para infectar plasma PBMC culturas ya que todos los pacientes de este subestudio ha RNA viral cargas aproximadamente 10 4 copias / ml al inicio del tratamiento. El nivel de virus de la producción o el éxito de PBMC infecciones no aumentó si el virus se concentra desde el plasma por ultracentrifugación. Esta etapa de concentración también eliminar cualquier residuo de drogas en el plasma que pueden afectar a la infectividad del virus en plasma después del tratamiento inicial.

Los datos preliminares indicaron que las concentraciones plasmáticas de proteína eran demasiado elevados para concentrar eficientemente virus y dio como resultado excesivo de antecedentes sobre la Western blot para el VIH-1 gag proteínas. Así pues, de 1,5 ml de plasma de cada muestra se diluye con 3,5 ml de solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) antes de la concentración de virus por ultracentrifugación. Los procedimientos para el análisis de Western blot se han descrito anteriormente. Fig. 2A muestra los resultados de Western blot empleando muestras de los pacientes AyB de la ACTG5014 ensayo clínico. Es importante señalar que se trataba de un ensayo doble ciego, y que todas las muestras de cada paciente fueron analizados antes de que el conocimiento de los regímenes de tratamiento [7]. Curiosamente, la proporción de p55: p24 es mayor que 1 de cada 8 de 9 muestras de los pacientes antes de su tratamiento con antirretrovirales. Alto p55: p24 ratios sugieren un incremento de la proporción de partículas virales no infecciosas a los viriones en el plasma. La proporción de p55: p24 en el VIH-1 propagadas en el cultivo de tejidos es generalmente mucho menor que uno, que sugieren una mayor proporción de enfermedades infecciosas a no infecciosas de virus en plasma. La mayoría de las proteínas plasmáticas o libre proteínas virales fueron separados de los virus a través de centrifugación y granulación del virus. Un 95% de reducción de la tinción de azul de Coomassie de todas las proteínas de la SDS PAG siguiente transferencia sugirió que tanto la proteínas p55 y p24 se electrotransferred de manera eficiente a las membranas de nylon. Aumento de los coeficientes de p55: p24 no es selectiva debido a la unión de los anticuerpos a p55 gag considerando los anticuerpos anti-p24 deberían obligar, al menos, de la forma más eficiente a CA p24 que a los sin p55 gag. También es posible que los antecedentes p55 se debe a la rápida rotación, y, por tanto, que viriones nacientes constituyen una gran fracción del total. Estos viriones puede ser más infeccioso que la procesa por completo los visto en el cultivo de células, ya que se procesan rápidamente en el curso del ensayo.

Predijimos que el p55: p24 proporción aumentaría durante tres primeros días de tratamiento con IP baños en la posible relación entre este IP dosis (cada 12 h). Los datos preliminares con los pacientes a partir de un IP que contienen sugerir un régimen de tratamiento PI-mediada por la inhibición de p55 procesamiento dentro de 8-12 h de tratamiento (datos no presentados). Sin embargo, estos estudios se realizaron con los pacientes a partir RIT + SAQ o IND contienen regímenes de tratamiento, y no con los pacientes tratados con LPV. Como se indica en los resultados de experimentos de la infección por el cultivo de tejidos se muestra en la Fig. 1, la p55: p24 ratio debería permanecer estable en plasma de las muestras obtenidas de los pacientes que recibieron la no-PI regímenes TARGA que contiene (es decir, +3 TC + NVP D4T + ABV) ya que ni INTI NNRTI ni inhibir la transformación de la gag o gag-pol precursores.

Aunque sólo un ejemplo de estos análisis se muestra (Fig. 2B, grupo Iy II), el Western blot resultados de los plasmas de cada cuatro pacientes tratados con el +3 TC + NVP D4T + ABV combinación mostró una relación constante de p55: p24 Después del tratamiento. En los pacientes asignados al azar a recibir la LPV + NVP régimen, la relación de p55: p24 aumentó a 72 h después de la dosificación inicial (Figura 2B]. Este aumento de la p55: p24 relación se mantuvo después de 4 semanas de tratamiento PI. Resultados anteriores revelaron que la terapia HAART dado lugar a una disminución de la ARN en plasma y la infecciosidad en un día [20] Sin embargo, la eficacia del tratamiento ARV puede verse afectada por factores tales como las concentraciones de drogas, el cumplimiento, la potencia y la selección de las quasiespecies resistentes a los ARV. Lamentablemente, dos de los pacientes asignados al azar a recibir la combinación LPV + NVP abandonado el sub-estudio de 5036 antes de las 72 h de extracción de la muestra, es decir, el momento en que es probable necesarios para detectar una LPV bloque de la proteína viral en la maduración. En un paciente, la banda de p24 en el Western blot estaba por debajo del límite de detección en todas las muestras de plasma. Hubo una aparente demora en la LPV actividad in vivo después del tratamiento, en comparación con el tratamiento en el cultivo de tejidos (Figs. 1 y 2]. A más largo tiempo es probable necesario para alcanzar concentraciones inhibitorias en la sangre u otros tejidos mientras que el efecto de LPV en partículas de virus de nueva producción fue inmediata en el cultivo de tejidos.

Casi todos los fármacos antirretrovirales pacientes naive reclutados en AACTG 5014 demuestran una disminución de la carga viral RNA a niveles indetectables después de 8 semanas de tratamiento con cualquiera de régimen. Esta disminución de la carga viral se asoció con un aumento en el recuento de células CD4. En pacientes B, C, y D, la caída de la carga viral fue probablemente mediado por tanto NVP y LPV inicial, pero la disminución de la carga viral ARN (el plazo de una semana) podría ser más de una medida de NVP que LPV actividad inhibitoria (Fig. 2C ). Dentro de los tres días, PI parece ser el bloqueo de la proteasa división de los precursores gag proteínas en el virus de las partículas encontradas en el plasma (Fig. 2B]. Esta proporción aumentó sólo ligeramente durante las próximas cuatro semanas. Debido a que este fue un estudio piloto sobre un número limitado de pacientes, es difícil determinar lo que constituye un cambio significativo en p55: p24. Sin embargo, parece que hay una diferencia significativa observada con la PI-en el régimen de 72 horas y 4 semanas. La mínima disminución de la carga viral observado después de tres días post NVP + LPV tratamiento (<1 log) aumentó de un 13 - a más de 100 veces descenso después de cuatro semanas de tratamiento (1,5 a 3 log disminución; los grupos II, III, IV en la Fig. 2C y 3A]. Curiosamente, la relativa disminución de la carga viral entre estos tres LPV + NVP pacientes tratados en cuatro semanas también parecía corresponder a la relativa inhibición de la proteasa división en tan sólo tres días después del tratamiento (Fig. 3]. Paciente B mostró un retrasado y lento descenso de la carga viral (en cuatro semanas) y un mayor aumento de la p55: p24 ratio (en tres días) que la observada en los pacientes CyD (Fig. 3]. Un mayor aumento de la p55: p24 ratio paciente B se refleja en el muy bajo nivel de p55 detectado. Hubo una variación significativa en el p55: p24 ratio (detectados por Western blot) entre todos los de la PI-pacientes no tratados. Aunque difícil de probar, esta variación puede estar relacionada con diferentes coeficientes de virus infecciosos: la no producción de partículas infecciosas del virus en personas infectadas con el VIH. Estos datos sugieren que la proporción de p55: p24 a los tres días siguientes a la iniciación del tratamiento PI pueden ser predictivos de la inmediata inhibición del VIH-1 por inhibidores de la proteasa en un paciente. Cabe señalar que sin la inscripción de un mayor número de pacientes que empiezan la terapia basada en PI, es difícil entender la relación entre el aumento relativo de la p55: p24 y ratios de respuesta a la terapia, salvo que el rápido aumento de la relación es fuerte indicador de la Anti-VIH PI actividad en el paciente.

Conclusión

En resumen VIH inhibidores de la proteasa bloquean la tramitación de p55 gag y gag-pol p160 proteínas precursoras del virus de brotación durante o después de la liberación del virus. Sin embargo, el inhibidor de la proteasa no se opone a la incorporación de los genomas ARN del VIH-1 en el virus de partículas. Así, a raíz de PI tratamiento, la carga viral sobre la base de ensayos de detección de RNA viral medida no tanto, las partículas de virus inmaduros y viriones encuentran en el plasma. Hemos desarrollado un método para medir la actividad anti-VIH de un inhibidor de la proteasa por un procedimiento sencillo. En tres pacientes tratados con LPV + NVP, la proporción de sin p55: p24 procesados aumentó a 72 horas y durante los próximos cuatro semanas de tratamiento. En contraste, la proporción de VIH-1 p55: p24 no cambió durante las cuatro semanas de estudio en los pacientes tratados con un régimen de NNRTI (+3 TC + NVP D4T + ABV). Este estudio, aunque limitado en el número de pacientes, ha proporcionado evidencia de que el VIH-1 p24 Western blot se puede utilizar para medir de inmediato la actividad antiviral de los inhibidores de la proteasa. Datos preliminares in vitro también sugiere que la incapacidad de IPs a bloquear PI-resistentes de VIH-1 en pacientes podrían evaluarse dentro de los 3 días de tratamiento. Sobre la base de estas conclusiones que ahora estamos probando la utilidad de esta prueba en pacientes previamente tratados con IP altamente para predecir el éxito de una nueva IP que contienen régimen de tratamiento dentro de los 3 días de iniciar esta terapia. Además, este estudio indica que la mancha occidental es una excelente herramienta para la evaluación de la actividad de los inhibidores de la proteasa in vitro, y puede ser útil en la evaluación de nuevos medicamentos supuestamente activa contra cepas resistentes a los actuales agentes, o para evaluar la actividad de diferentes combinaciones De los inhibidores de la proteasa utilizando una medida más perspicaz que la infectividad viral.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

AJM HB y el trabajo de laboratorio realizado en el presente documento. EJA supervisó el trabajo de laboratorio. MML y AL se la PI de los padres del estudio A5014. DM es el estadístico para A5014 y 5036. RDC fue el protocolo para virólogo A5014.

Agradecimientos

La investigación para este estudio se realizó en la Case Western Reserve University (EJA) y con el apoyo de fondos y Social de la Ciencia y la Systems Inc NIH / NIAID Grupo de Ensayos Clínicos del SIDA. Damos las gracias a la AACTG5014 y AACTG 5036 s equipo por su coordinación de la recogida de muestras y apoyo. Se prestó apoyo adicional a EJA del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de los NIH (AI49170). Todos los virus de trabajo se realizó en la seguridad de la biotecnología de nivel 2 y 3 instalaciones de la CWRU Centro de Investigación para el SIDA (AI36219).