Nuclear Receptor, 2005; 3: 1-1 (más artículos en esta revista)

Receptor de la hormona tiroidea se unen al DNA y T 3-transcripcional dependiente de la activación se inhiben por toxinas urémicas

BioMed Central
M Guilherme Santos (gmsantos@hotmail.com) [1], Carlos J Pantoja (pantoja@cmpmail.ucsf.edu) [1], Aluízio Costa e Silva (costasilva@terra.com.br) [2], Maria C Rodrigues (Mcsoares@unb.br) [1], C Ralff Ribeiro (farmol@unb.br), Luiz A Simeoni (lsimeoni@unb.br) [1], Noureddine Lomri (nlomri@noos.fr) [3], Francisco AR Neves (chico@unb.br) [1]
[1] Laboratorio de Farmacología Molecular, Departamento de Ciencias Farmacéuticas de la Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Brasilia, Brasil
[2] SOCLIMED - Unidad de Diálisis, Brasília, Brasil
[3] Universidad de Cergy-Pontoise, UFR de Ciencias y Técnicas, Laboratorio ERRMECe, BP222, 2 Ave Adolphe Chauvin, 95302 Cergy-Pontoise, Francia

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Resumen
Antecedentes

Hay una gran coincidencia entre clínicos de insuficiencia renal crónica (IRC) y el hipotiroidismo, lo que sugiere la presencia de hipotiroidismo en pacientes urémicos. Aunque los pacientes tienen baja FCI T 3 y T 4 con niveles normales de la hormona estimulante del tiroides (TSH), que muestran una mayor prevalencia de bocio y de las pruebas de sensibilidad a los tejidos debilitados T 3. Sin embargo, no existen estudios de examinar si los receptores de la hormona tiroidea (TR) desempeñar un papel en la disfunción de la hormona tiroidea en pacientes FCI. Para evaluar los efectos de un medio ambiente urémico en función de TR, que investigaron el efecto de plasma urémico sobre TR β1 se unen al DNA como heterodimers con el alfa del receptor de retinoide X (RXR α), y en T 3-transcripcional dependiente de la actividad.

Resultados

Se demostró que el plasma urémico recogidos antes de la hemodiálisis (Pre-HD) redujo significativamente TR β1 RXR-α unión a ADN. Esa inhibición también se observó con un receptor de la vitamina D (VDR), pero no con una peroxisome proliferador activado del receptor-gamma (PPAR γ). A base de células de ensayo confirmado este efecto donde urémico pre-HD ultrafiltrate inhibe la activación transcripcional inducida por la T 3 en las células U937. En ambos casos, los efectos inhibitorios se invierte cuando el plasma urémico y la urémico ultrafiltrate fueron, y que se utilicen después de la hemodiálisis (HD-Post).

Conclusión

Estos resultados sugieren que dializable toxinas en el plasma urémico bloquear selectivamente la unión de la TR-β1 RXR α afectar al ADN y actividad transcripcional T 3. Estos hallazgos pueden explicar algunas características de la hormona tiroidea y el hipotiroidismo resistencia observada en pacientes FCI.

Antecedentes

La insuficiencia renal crónica (IRC) está asociada con disturbios en el medio interno, con repercusiones en el inmunitario, hematopoyético, gastrointestinal y endocrino y los sistemas de órganos [1 - 4]. Los pacientes con IRC avanzada pantalla una variedad de anormalidades hormonales incluidas las perturbaciones del hipotálamo-hipófisis-hormona tiroidea eje endocrino. El metabolismo periférico de hormona tiroidea es también alterada en los pacientes con IRC [5 - 9].

En uremia diversos hormona tiroidea características fisiológicas se alteran. Tyroxine total y libre (T 4) y 3,5,3 '-triyodotironina (T 3) niveles en el suero se redujo con frecuencia en los pacientes con IRC [10, 11]. La reducción de los niveles de T 3 se podría explicar por una disminución de la conversión periférica de tejido de T 4 a T 3 [12]. La mayoría de los pacientes del FCI, sin embargo, se consideran de eutiroidismo como lo demuestra normal de la hormona estimulante del tiroides (TSH) niveles [11, 13]. Además, la prevalencia de enfermedades de la tiroides, incluido el hipotiroidismo y bocio, también son más altos en los pacientes del FCI que en la población general [10].

Las hormonas tiroideas control de numerosos aspectos de desarrollo de mamíferos y el metabolismo, de los que la mayoría de estas acciones son mediados por receptores específicos de la hormona tiroidea (TR). Una importante actividad metabólica de las hormonas tiroideas es aumentar el consumo de oxígeno de los tejidos blanco [14, 15]. De hecho, en la insuficiencia renal experimental y en pacientes urémicos el aumento previsto en el consumo de oxígeno basal tras la administración de T 3 no se observa, lo que sugiere que FCI se asocia con la resistencia a la acción de la hormona de la tiroides [16 - 18]. Sin embargo, actualmente se desconoce si los receptores de hormonas tiroideas juegan un papel en la disfunción tiroidea observado en pacientes urémicos.

Ligando-TR se regula factores de transcripción de la superfamilia de receptores nucleares que incluye hormonas esteroides y de la vitamina D, y también los receptores PPAR γ [15, 19, 20]. TR modulan la expresión de genes específicos vinculantes por las secuencias de ADN, conocidas como elementos de respuesta tiroidea (TREs), que se encuentra en los promotores de genes regulados-TR. TREs se componen de repeticiones de la mitad de consenso AGGTCA sitio en una variedad de diferentes orientaciones, incluyendo directa repite espaciados por cuatro nucleótidos (DR-4), invertida palindromes (F2) y palindromes [21, 22]. En presencia de la T 3, TR preferentemente con la forma heterodimers receptores X retinoides (RXRs) aunque unliganded TR se une al ADN ya sea como homodimeros o monómeros [20, 23].

En los últimos años, se ha hecho evidente que las toxinas urémicas puede afectar a la función de algunos receptores nucleares, como el receptor de la vitamina D (VDR). Estudios anteriores sugieren que las toxinas urémicas inhibir la unión de VDR a ADN y puede contribuir a la vitamina Dy la resistencia observada en pacientes con IRC [24 - 28]. Por lo tanto, es concebible que uremia también induce modificaciones en los receptores de hormonas tiroideas y, en consecuencia, desempeña un papel en la hormona tiroidea disfunción observada en pacientes urémicos.

Se investigaron los efectos de la uremia en TR β1 función mediante el estudio de la capacidad de la TR para obligar a las secuencias de ADN en la presencia o ausencia de plasma urémico FCI recogidos de los pacientes. Nuestros resultados mostraron que el plasma urémico redujo significativamente la unión de heterodimers TR (TR β1 RXR-α), pero no de homodimeros (TR β1-TR β1) a la DR-4. Además, el plasma urémico también inhibe la unión de un VDR heterodimer (VDR-RXR) a la RD-3, mientras que la unión de PPAR γ al DR-1 no han sufrido modificaciones. Por otra parte, la hemodiálisis (HD) disminuye el efecto inhibidor de la FCI de los pacientes plasma en la unión de ambos TR y VDR heterodimers a ADN. Cuando humanos promonocyte células fueron incubadas con ultrafiltrate recogidos Pre-HD la activación transcripcional inducida por T 3 es inhibido. Esta inhibición se perdió cuando las células fueron tratadas con ultrafiltrate recogidos después de la HD. Por lo tanto, sugerimos que dializable toxinas urémicas bloquear selectivamente la unión de TR β1 RXR-α y VDR-RXR heterodimers de ADN y reducir las actividades transcripcional regulada por estos receptores. Estos resultados indican que la hormona tiroidea disfunción observada en la uremia puede explicarse en parte por T 3 resistencia inducida por la alteración de la función TR β1.

Resultados
Plasma urémico inhibe la unión de la hTR β1-α hRXR sobre DR-4

Para estudiar los efectos de plasma urémico en la capacidad de TR β1 a obligar a un TRE analizamos la unión de la hRXR α-β1 heterodimers a hTR DR-4. En este ensayo, el complejo de proteínas de ADN fue visualizado por el etiquetado TR β1 con 35 S. En presencia de la T 3, la adición de cantidades cada vez mayores (Figura 1; carriles 2-4) de plasma normal de las personas mejora de la unión de la hRXR α-β1 a hTR ADN. Por el contrario, TR de incubación con plasma urémico (carriles 5-7) con anterioridad a la hemodiálisis redujo significativamente la unión de heterodimers (RXR-TR) a la DR-4. Banda densitometría análisis independiente, de 5 de experimentos mostraron que la reducción de plasma urémico hRXR α-hTR β1-DR-4 formación de los complejos de 77 ± 15%, en comparación con el plasma de sujetos normales (no se muestra). Resultados similares fueron observados para la tiroides respuesta elemento F2 (invertida palindrome) en el que plasma urémico también inhibe la RXR-TR unión a ADN (no se muestra). Pre-tratamiento de la hTR β1 con T 3, no consiguió mejorar la capacidad de la α-hRXR dímero hTR β1 a obligar a ADN.

Utilizamos plasma urémico de cuatro diferentes pacientes a fin de determinar si la inhibición de la observada RXR α-TR β1 se unen al DNA (DR-4) fue paciente específico. Plasma urémico muestras de los cuatro pacientes inhibido RXR α-TR β1 vinculante para DR-4 a diversos grados (no se muestra). Sin embargo, no hemos podido detectar ninguna correlación entre el deterioro TR vinculante y anormalidades en los niveles plasmáticos de urea, creatinina o de la hormona tiroidea.

Para excluir la posibilidad de que la inhibición de la hRXR α-hTR β1 se unen al DNA inducida por plasma urémico podría ser debido a la degradación proteolítica de TR β1, incubadas 35 S-TR β1 etiquetados, en las mismas condiciones que en el turno de gel de los experimentos, con o normal Plasma urémico a 4 ° C, durante treinta minutos. S-35 TR etiquetados β1 muestras fueron analizadas por SDS-PAGE. Como era de esperar, los principales productos de traducción de TR β1 fue de 53 kD y de incubación de estos productos con plasma urémico normal o no modificar la traducido [35 S] TR β1 (Figura 2]. Estos resultados indicaron una ausencia de la actividad proteolítica urémicos que podrían intervenir en la disminución de TR-RXR formación de los complejos de ADN.

Hemodiálisis mejora hTR β1-α hRXR vinculante para DR-4

Se desconoce aún por qué el plasma urémico disminuido TR β1 RXR-α unión a ADN, en comparación con el plasma no urémicos. El efecto observado podría atribuirse tanto a la falta de algún factor (s) normalmente presente en el plasma normal o de la presencia de algún inhibidor productos presentes en el plasma urémico. Para probar la segunda hipótesis, se analizó la influencia de plasma urémico, recogidos antes y después de la hemodiálisis, en TR β1 RXR-α-4-DR formación de los complejos usando gel-ensayos de cambio. En estos experimentos, [35 S] TR β1 fue normal o incubadas con plasma urémico, recogidos antes (pre-HD) o 4 h después de la hemodiálisis (HD-post). As shown in Figure 3 , uremic plasma collected before HD (lanes 5–7) decreased the binding of hTRβ1-hRXRα to DNA (DR-4), relative to normal plasma (lanes 2–4). Sin embargo, cuando estos receptores fueron pre-incubadas con plasma urémico recogidos de la misma paciente después de la hemodiálisis (carril 8-10), una importante mejora de hTR β1-α hRXR vinculante para DR-4 se observó. Aunque la mejora de formación de los complejos de hemodiálisis, no se recupera por completo la inhibición causada por el plasma urémico. Densitometría análisis demostró que la hemodiálisis aumentó en un 50% la hTR β1-hRXR α heterodimer se unen al DNA en comparación con el pre-HD plasma urémico (no se muestra).

La hemodiálisis reduce el efecto inhibidor de plasma urémico a hVDR RXR-α unión a ADN

En opinión de que HD mejora de la unión de la hTR β1-α a hRXR DR-4 elemento de respuesta, y que los estudios anteriores mostraron que urémico soluciones inhibido hVDR RXR-α vinculante al RD-3-elemento de respuesta (VDRE) [26, 27, 29] que decidimos Para determinar si el plasma urémico recogidos antes y después de la hemodiálisis tiene el mismo efecto sobre hVDR RXR-α vinculante para DR-3.

En consecuencia, un experimento similar se llevó a cabo con hVDR tratados con 1,25 (OH) 2 vitamina D 3 (VD 3). [35 S] hVDR se incubaron con no urémicos plasma, plasma urémico recogidos antes y después de la hemodiálisis. Como se muestra en la figura 4, en comparación con el control (lane1), la incubación de VDR con plasma normal de aumento de las personas [35 S] hVDR RXR-α vinculante al RD-3 (carriles 2-4). Por el contrario, cuando [35 S] VDR se incubaron con plasma urémico recogidos antes de HD, se observó una reducción significativa de hVDR-α hRXR vinculante al RD-3 (carril 5-7). Por otra parte, si se compara con pre-HD plasma urémico pre-incubación con plasma urémico recogidos después de la hemodiálisis (carriles 8-10) mejoró hVDR-α hRXR vinculante para DR-3. En conjunto, estos resultados sugieren que dializable toxinas son responsables de la reducción obligatoria de hTR β1-hRXR α y VDR-RXR α a ADN.

Plasma urémico no inhibe la unión de la hPPAR γ-hRXR heterodimer al DR-1

Siguiente decidimos evaluar si el plasma urémico perjudica vinculante ADN de otros miembros de la superfamilia de receptores nucleares. Hemos realizado ensayos de gel de cambio utilizando el ácido graso nuclear receptor PPAR γ y de su elemento de respuesta, DR-1. Los miembros de la familia PPAR han demostrado desempeñar un papel importante en la obesidad y el síndrome de plurimetabolic [30] y la resistencia a la insulina también ha sido descrita en pacientes urémicos [31]. En contraste con lo observado con TR β1 y VDR, el gráfico 5 muestra que la incubación de [S 35] hPPAR γ con plasma urémico no vinculante de reducción de la PPAR-γ hRXR a α DR-1 (carriles 2-4 frente a los carriles 5-7 ). Tal resultado indica que el efecto inhibidor de plasma urémico no se extiende a todos los miembros de la superfamilia de receptores nucleares.

La actividad inhibitoria de plasma urémico no es termo-lábil

Nuestros resultados demuestran que la hemodiálisis corregido parcialmente la inhibición de hTR β1-α hRXR vinculante para DR-4 causada por el plasma urémico. Por lo tanto, la hipótesis de que dializable toxinas pueden causar el efecto inhibidor de la proteína en el plasma urémico-ADN formación de los complejos. Para obtener más información sobre la naturaleza de estas toxinas que se calienta normal y plasma urémico durante 5 minutos a 100 ° C para probar si el factor inhibitorio fue termo-lábil. Estamos posteriormente realizaron ensayos de gel de cambio. En el control de la configuración de nuestro experimentales que se utilizan en estos experimentos [32 P] etiquetados DR-4 con etiqueta TR β1 RXR-α (Figura 6]. Además, con el fin de evitar cualquier efecto de las fosfatasas plasmática en [32 P] ADN, también se incubaron las normales y urémicas plasmas con un cóctel inhibidor de la fosfatasa (carril 6).

Calefacción el plasma de individuos normales no afecta a la unión de la hTR β1-hRXR α heterodimer a [32 P] DR-4 (carril 1 en comparación con el carril 2). Como se muestra en los experimentos anteriores, el plasma urémico disminuido significativamente la hTR β1-α hRXR - [32 P] DR-4 formación de los complejos (carril 4). Sin embargo, la calefacción de plasma urémico mejoró la unión de la hTR β1-hRXR α heterodimer a [32 P] DR-4 (carril 5). Además, los efectos de plasma urémico persistió en la presencia de inhibidores de la fosfatasa (carril 6).

Urémicos Ultrafiltrate perjudica T 3 activación transcripcional

Por último, si examinamos el efecto inhibitorio in vitro de plasma urémico sobre TR unión a DNA pueden afectar a las funciones de TR como un regulador de la transcripción basada en una celda de ensayo (Figura 7]. Estamos U937 células transfectadas con la codificación de cDNA humanos TR β1 y un reportero de genes con un DR-4 respuesta elemento aguas arriba de la secuencia de codificación de firefly luciferase. Se utilizó medio RPMI-1640 tratados con ultrafiltrate (UF), solución concentrada 10 veces de lo normal o pacientes urémicos recogidos antes o después de la hemodiálisis. Como se muestra en la Figura 7, en ausencia de IU (Control), T 3 transcripción activado por 5,7 ± 1,2 veces. Cuando las células fueron tratadas con UF normal de las personas, no observamos cambios significativos en la activación de la transcripción luciferase reportero (4,7 ± 0,74 veces; ns). Curiosamente, en comparación con el UF normal de las personas, recogidos UF Pre-HD reducido de pacientes urémicos T 3 dependiente de la activación transcripcional por el 66% (1,6 ± 0,35, p <0,05). Por otra parte, las células U937 tratadas con UF recogidos Post-HD no tiene efecto significativo sobre T 3-activación de la transcripción dependiente (4,8 ± 1,47 veces; ns). Estos resultados sugieren que las toxinas urémicas perjudicar T 3 inducida por la activación transcripcional de hemodiálisis y que reduce su efecto inhibidor.

Discusión

Uremia es un químico toxemia sistémica con repercusiones en los diferentes órganos y sistemas. Los pacientes con insuficiencia renal crónica demuestran varias disfunciones endocrinas, como la perturbación de la hormona tiroidea y el metabolismo son diferentes de los pacientes con el síndrome de eutiroidismo enfermo. En éste último, la conversión de T 4 a T 3 es reducido, pero la generación de T 3 inversa (rT 3) de T 4 se incrementa. En pacientes urémicos, rT 3 es típicamente normal [32 - 34]. Además, Lim et al. Mostraron resistencia a la hormona tiroidea en pacientes de hemodiálisis con tejidos periféricos redujo significativamente la sensibilidad a la hormona de la tiroides [17]. Datos recientes de nuestro laboratorio indican que a fin de mantener el estado de eutiroidismo uremia mostró que aumenta T 3 afluencia eritrocitos a través de la membrana [35]. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que el FCI afecta a la función tiroidea de múltiples maneras. Los mecanismos moleculares implicados y el papel de los receptores de hormona tiroidea en esta disfunción, sin embargo, no se comprenden totalmente.

En el presente estudio se observó que el plasma urémico afectado a la capacidad de TR β1 y VDR heterodimers (TR β1 RXR-α y VDR-RXR α) que se unen a ADN (DR-4 y DR-3, respectivamente), mientras que la capacidad de PPAR γ-α a RXR Se unen a ADN (DR-1) no fue alterada. Curiosamente, no hubo correlación entre la actividad inhibitoria y de los niveles plasmáticos de urea, creatinina, la hormona tiroidea y paratiroidea de los pacientes incluidos en este estudio. Sin embargo, el pequeño número de pacientes se opone a conclusiones definitivas.

Para investigar si estos hallazgos fueron secundarios a la presencia de toxinas urémicas dializable, que compararon el efecto de plasma urémico recogidos antes y después de la hemodiálisis, en TR β1 RXR-α o VDR-RXR α unión a ADN. Nuestros resultados muestran que el efecto inhibitorio de plasma urémico se redujo significativamente por hemodiálisis, lo que sugiere que dializable toxinas son, de hecho, participan. No se identificaron la toxina que es responsable de este efecto, pero nuestros resultados sugieren la presencia de termo-resistente molécula (s). Más análisis de estas toxinas dializable Actualmente se están llevado a cabo para identificar y caracterizar las moléculas responsables de este efecto inhibidor.

Los mecanismos responsables de nuestras conclusiones no son claras. En el síndrome urémico reducción de la liquidación de muchas toxinas desempeña un papel clave en esta patogénesis. Aunque VDR degradación ha sugerido en la insuficiencia renal [36], la inhibición de la urémico TR β1 RXR-α unión a ADN no se puede explicar por la actividad proteolítica de plasma urémico desde nuestra SDS-PAGE no mostró plasma urémico dependientes de la degradación de TR β1.

Nuestros resultados están de acuerdo con otros estudios, que han demostrado que las toxinas urémicas participan en VD 3 resistencia observada en pacientes con insuficiencia renal crónica [37]. Urémicos ultrafiltrados derivados de hemo o peritoneal pacientes dializados se ha demostrado que inhiben la interacción con el ADN de VDR [27, 28]. Otros estudios mostraron que el VDR formación de los complejos sobre los diferentes tipos de VDREs puede reducirse por urémico soluciones recogidas de los pacientes después de hemo o diálisis peritoneal [28]. Nuestros resultados nos permiten especular sobre la posibilidad de un mecanismo inhibitorio de la misma toxina urémico (s) de la inhibición de ambos RXR-TR-DR-4 y VDR-RXR-DR-3 formación de los complejos.

Para evaluar si toxinas urémicas afectan también a otros miembros de la familia de receptores nucleares, se estudió el efecto de plasma urémico sobre PPAR-γ RXR α vinculante para DR-1. Contrariamente a lo que se observó con TR β1 y VDR, la pre-incubación de PPAR γ con plasma urémico no influyó PPAR-γ RXR α se unen al DNA. Este resultado sugiere que la inhibición de la proteína de ADN complejo causado por el plasma urémico se produce sólo con algunos receptores nucleares. En conjunto, nuestros resultados indican que las toxinas urémicas ejercen su efecto inhibidor al actuar específicamente sobre TR β1 y VDR heterodimers.

El mecanismo molecular involucrado en este fenómeno no es claro. El hecho de que el PPAR-γ RXR α heterodimer no fue afectada por el plasma urémico sugiere que estas toxinas no interactúan directamente con RXR α. Otro posible modelo para explicar los efectos de las toxinas urémicas de plasma en la unión de la TR para el ADN sería una acción directa sobre el ADN que podría bloquear su interacción con TR β1 y VDR heterodimers. Sin embargo, a pesar de que utiliza el DR-1 en PPAR γ ensayo, en contraste con el DR-4 (TRE) y DR-3 (VDRE), esta hipótesis no es firme apoyo de los resultados de este estudio, como PPAR-γ RXR heterodimers obligar α Normalmente al ADN en presencia de plasma urémico. Otra alternativa que no se puede excluir un efecto inhibidor de la urémico toxina en la superficie de TR y VDR dominio vinculante ADN (DBD), alterando su capacidad de unión a DNA. Patel et al. Atribuido a la formación de bases de Schiff entre "reactivo aldehídos" residuos de la lisina y el DBD de la VDR para explicar el efecto inhibidor de la urémico ultrafiltrate sobre el carácter vinculante de VDR a ADN [26]. Sin embargo, en otro estudio, mutagénesis punto de los diferentes residuos de la lisina en el DBD no pudo confirmar esta idea [28]. Además, debemos considerar que la toxinas urémicas pueden interactuar con TR y VDR, provocando cambios conformacionales estructurales sobre estos receptores, por lo tanto, alterar la formación heterodimers.

Hemos tratado de demostrar la relevancia fisiológica de estos resultados mediante el examen de los efectos de las toxinas urémicas T 3 en la activación transcripcional. Nuestros resultados mostraron que urémico ultrafiltrate recogidos antes de la hemodiálisis inhibido T 3-transcripcional inducida por la activación, lo que confirma los resultados de la in vitro. Por el contrario, en presencia de ultrafiltrate recogidos después de la hemodiálisis, la activación transcripcional inducida por T 3 es similar a la del grupo control tratado con ultrafiltrate recogidos de las personas normales. Por lo tanto, la hipótesis que dializable toxinas son responsables de la resistencia a la acción de T 3 documentado en pacientes FCI.

En resumen, toxinas urémicas que circulan en el plasma de pacientes FCI reduzcan selectivamente la unión de TR β1 RXR-α a la alteración del ADN y la activación transcripcional TR β1 mediada por T 3. Por otra parte, la hemodiálisis parcialmente corregido este efecto inhibidor, lo que sugiere la presencia de una toxina dializable. Desde TR β1 funciona como un heterodimer con RXR α, estos hallazgos podrían explicar algunas características de hipotiroidismo y resistencia a la hormona tiroidea se encuentran comúnmente en pacientes FCI. Futuros estudios son necesarios para identificar las toxinas y caracterizar mejor los mecanismos implicados en la resistencia a la acción de T 3 pacientes en IRC.

Materiales y métodos
Pacientes y procedimientos clínicos

Cuatro pacientes del programa de diálisis crónica Soclimed Clínica de Diálisis se matricularon en nuestro estudio. Todos los pacientes fueron hombres cuya edad oscilaba entre 19 a 43 años, con la media de edad está 34 años. Actuaron bien nutridos y clínica y de laboratorio de eutiroidismo; ninguno tenía un historial de enfermedad tiroidea, el tratamiento con hormonas tiroideas, el tratamiento con amiodarona o clínicamente detectables bocio. La etiología de su insuficiencia renal crónica fue la siguiente: glomerulonefritis crónica (2), la hipertensión (1), nefropatía por reflujo (1). La media de los niveles séricos de urea era de 178 ± 44,8 mg / dL (120 a 233 mg / dL), mientras que la de creatinina fue del 12,6 ± 2,7 mg / dL (9,9 a 16,3 mg / dL). Los pacientes estaban en hemodiálisis 3 veces por semana, durante 4 horas usando un 1,8 m 2 Fresenius Polysulfone ® filtro. Normal sujetos control sanos constaba de tres hombres, la edad que van de 23 a 41 años, con la media de edad de 32 años. El protocolo experimental fue aprobado por los Derechos Humanos en la Comisión de Investigación de la Universidad de Brasilia y de todos los individuos normales y pacientes dieron su consentimiento informado.

Por el ADN in vitro vinculante ensayo, el plasma urémico se recogió inmediatamente antes y después de las 4 h de hemodiálisis, en 20 μ alicuotar las muestras y surtida L a -20 ° C. Ultrafiltrate urémico (UF) también fue recogido antes y después de 4 horas de hemodiálisis. Lyophilisation fue utilizado para concentrar muestras ultrafiltrate. Los liofilizados se re-bidistillated suspendido en el agua a 10 veces la solución concentrada, como efectos de la UF no son detectables a concentraciones más bajas (1 veces, 2,5 veces, 5 veces concentrado, no se muestra). Las muestras fueron posteriormente desalado por filtración utilizando filtros Centricon 3. Tras la centrifugación, el pellet fue re-suspendido en medio RPMI-1640, (10% suero bovino recién nacido; 2 mM glutamina, 50 unidades / mL de penicilina, 50 μ g / ml estreptomicina) y corregir el pH a 7. Normal UF fue recogido de control de plasma de los sujetos sanos. La solución de tratamiento se preparó de la misma manera que la solución urémicos. Todos los experimentos se realizaron con la urémico a partir de la misma muestra de pacientes que mostró el más fuerte efecto inhibidor.

Gel cambio obligatorio de ensayo

Gel cambio ensayos se utilizaron para evaluar la unión de la S-35 sintetizado en la etiqueta TR lisado de reticulocitos 600 fmoles de etiqueta DR-4 (5'-AGCT TC AGGTCA CAGG AGGTCA GAG -3 ') y palindrome invertida - F2 (5'- TTC TGACCC CATTGG AGGTCA GAG -3 ') 35, S-VDR a la etiqueta de la etiqueta DR-3 5'-AGCT TC AGGTCA AGG AGGTCA GAG - 3') y el 35 S-la etiqueta a la etiqueta de PPAR γ DR-1 (5'-AGCT TC AGGTCA G AGGTCA GAG - 3 '). Sensibilidad y especificidad de este ensayo se han caracterizado previamente [23]. En resumen, la etiqueta de proteínas migrarán en el gel de poliacrilamida nondenaturating sólo cuando la obligación de ADN. Además, el gel de cambio también se realizó a través de síntesis sin etiqueta TR y 32 P-etiquetados DR-4.

La síntesis in vitro de los receptores de plásmidos se realizó a través de codificación hTR β1 hRXR α, y hPPAR γ [38] y hVDR [39] con el TNT-junto Reticulocyte Lisado System (Promega, Madison, WI)-metionina que contiene una mezcla de aminoácidos libres, y cualquiera de 20 μ M frío Metionina o 35 S-metionina etiquetados. ADN plásmido (0.2-2 μ g) se añadió a TNT Rápida Master Mix y incubados en 50 μ l durante 90 min a 30 º C. Para confirmar la eficacia de la traducción reacción S-35 etiquetado traducido proteínas de sodio fueron analizados por electroforesis en gel de dodecil sulfato (SDS-PAGE). El complejo ADN-TR fue visualizado por el etiquetado lisado de reticulocitos traducido receptores con 35 S o usando ADN marcado con 32 P utilizando polinucleótido quinasa. Antes de incubación con el ADN, el lisado de reticulocitos traducido receptores fueron tratados con TR β1, VDR y ligandos de receptores PPAR γ (T 3, 1,25-dihidroxi-vitamina D 3, y 9 - cis-ácido retinoico, respectivamente) durante 30 min a 4 ° C. Etiquetados más ligandos de receptores nucleares fueron incubadas en diferentes volúmenes (0,5, 1 y 2 μ l), de plasma urémico o normal durante 30 min a 4 ° C. Tras la exposición de plasma, los receptores nucleares se incubaron durante otros 20 minutos a temperatura ambiente (20-30 ° C) en una solución que contiene 2 μ g no específicos de ADN poli (dIdC) (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ), la fría respuesta específica elemento (10 ng / reacción), nonradioactive RXR α y vinculante en un buffer de 20 μ L reacción a lo descrito previamente [23]. Cuando no se usen los receptores nucleares de la etiqueta de gel de cambio experimento se realizó con 32 P-DR-4 (2000-5000 cpm). Un cóctel inhibidor de la fosfatasa 2 (Sigma, P 5726) fue añadido cuando el ADN fue etiquetada (32 P-RD-4). La unión de amortiguación que figuran 0,2 mM Na 2 HPO 4, 0,2 mM NaH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, y el 5% de glicerol. Final muestras se cargan el 5% nondenaturing gel de poliacrilamida, previamente correr durante 30 min a 200 V. Para separar las proteínas de ADN complejos, el gel se ha ejecutado a 4 ° C durante 90-180 min a 240 V, utilizando un buffer de funcionamiento ( PH 7,5 para 10X stock a temperatura ambiente) que contenía 6,7 mM Tris-base, 1 mM EDTA, y 3,3 mM acetato de sodio. El gel de poliacrilamida se seca al final de la electroforesis y autoradiographed.

Cultivo de células, genes y Ponente Transfections ensayos

Humanos promonocyte U937 células se mantuvieron en la cultura como ha sido descrito previamente [38]. Para los ensayos de transfección, las células fueron colectadas por centrifugación y transfección resuspendido en solución (0,5 ml / 1,5 × 10 7 células) que contiene PBS, 100 mM de calcio y 0,1% de dextrosa y mezclado con 2 μ g de humanos TR β1 expresión vector, 4 μ g de la luciferase (Luc) y 500 ng reportero β-galactosidasa de control de vectores. El reportero plásmido contiene un elemento de respuesta TR sintético que contiene dos copias de DR-4 clonado inmediatamente aguas arriba de un mínimo de la timidina kinasa (tk) promotor (-32 / +45) vinculado a luciferase secuencias de codificación [38]. Las células fueron transferidas a una cubeta y electroporated utilizando un gen de Bio-Rad de pulso a 300 V y 960 μ F.

Inmediatamente después de la electroporación, las células fueron transferidas a un nuevo medio RPMI-1640 con o sin tratamiento normal o urémicos ultrafiltrate solución (10 veces concentrado) que antes o después de la hemodiálisis. Las células fueron entonces chapada en 12 de plato y bien tratada por triplicado con T 3 10 -7 M o etanol (vehículo). Después de 24 h, las células fueron recolectadas por centrifugación, lisadas mediante la adición de 150 μ l 1X buffer de lisis (Promega) y ensayados para luciferase (kit de Promega Corp) y β-galactosidasa (kit de Tropix, Inc, Bedford, MA) Actividades. Todos los experimentos de transfección se realizaron al menos tres veces.

Estadísticas

Los datos fueron analizados por la prueba de Kruskal-Wallis seguida de Dunn's Test de Comparación Múltiple en su caso. P <0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

GMS llevado a cabo todos los experimentos y preparó el manuscrito. CJABP ayudado con células de la cultura y la preparación manuscrito. ACS y MCS seleccionada y controlada de los pacientes urémicos y recogidas todas las muestras de plasma matriculados en el presente estudio. RCJR la Liga y participó en el diseño del experimento. NL ayudó con el análisis de los datos y en la redacción del manuscrito. FARN concibe el estudio y participaron en su diseño y coordinación. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Brasil (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq 520654/02-1, CNPq / PADCT SBIO 620003/02-2) y CAPES-COFECUB Programa, conceder 434/03. Damos las gracias a todo el personal de Clínica de Diálisis Soclimed; Rilva Soares para toda la asistencia técnica; Cristina Luisa Simeoni para ayudar en la preparación de este manuscrito; Marília Barros de revisar el manuscrito y el Profesor John Baxter D útil para el debate.