Journal of Translational Medicine, 2005; 3: 15-15 (más artículos en esta revista)

CD34 + en las células cultivadas con células madre y el factor de la interleukina-2 generar células CD56 + con efectos antiproliferativos sobre líneas de células tumorales

BioMed Central
Giuseppe Sconocchia (Giuseppe.Sconocchia @ RoswellPark.org) [1], Maurizio Provenzano (mprovenzano@mail.cc.nih.gov) [2], Katayoun Rezvani (rezvanik@nhlbi.nih.gov) [1], Jongming Li ( Lij@nhlbi.nih.gov), Jos Melenhorst (melenhoj@mail.nih.gov) [1], Nancy Hensel (Henseln@nhlbi.nih.gov) [1], A John Barrett (Barrettj@nhlbi.nih.gov ) [1]
[1] Subdivisión de Hematología, la célula de vástago Allotransplantation Sección Nacional del hogar Pulmón y Sangre, Bethesda, MD, EE.UU.
[2] Departamento de Medicina de Transfusión, Clínica Center, National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE.UU.

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Resumen

Estimulación in vitro de células CD34 + con IL-2 induce la diferenciación de las células NK. Con el fin de definir las etapas de desarrollo de células NK, que influyen en su generación de las células CD34, cultivadas G-CSF movilizadas de sangre periférica de células CD34 + en presencia del factor de células madre y la IL-2. Después de tres semanas la cultura encontramos una diversidad de CD56 + subconjuntos que poseen granzyme A, pero carecía de los aparatos necesarios para citotóxicos clásicos NK-como la citotoxicidad. Sin embargo, estas células CD56 + tiene la peculiar característica de la inhibición de la proliferación de los K562 y P815 líneas celulares en una celda de contacto de manera dependiente.

Introducción

Clave de las células NK son mediadores de la inmunidad innata de contribuir a immunosurveillance mediante el reconocimiento y el asesinato de tumores y virus de las células infectadas. Son citolítica y producen citoquinas inflamatorias [1, 2]. Pareja NK son células CD3-CD56 + CD16 + y de forma variable. La molécula CD56 es un 120-180 KD N-glicosilada vinculados isoforma de la molécula de adhesión celular neural (NCAM) [3]. Se expresa en las células NK, células NK-T, y un subconjunto de células dendríticas. Células NK se originan en la médula ósea de una Lin-CD34 + células progenitoras linfoides común [4]. En ausencia de estroma de médula ósea, células NK generación requiere una combinación de IL-2 o IL-15 [5, 6] y factor de células madre (SCF) [7]. Sin embargo, las primeras etapas de la generación de células CD56 + y el origen de la diversificación en madurar tipos de células CD56 + no está bien caracterizado.

Estamos anteriormente que en la cultura con la IL-2 y SCF diferenciar células CD34 + CD56 + en varias subpoblaciones - un menor de edad mieloide subconjunto consistente de las grandes CD56 + CD33 dim-como los macrófagos y las células linfoides un importante subconjunto de las células CD56 brillante. Ambos tipos de células tenían bajo o ausente perforin y no granzyme B [8]. En el estudio de la función de las células inmaduras CD56 +, se observó que habían insignificante citotoxicidad. Aquí se describe un novedoso celular-dependientes en contacto con la inhibición de la proliferación de líneas de células CD56 + cultivadas por lo que sugiere que las células CD56 + células inmaduras pueden tener propiedades reguladoras del crecimiento novela.

Materiales y métodos
Anticuerpos y reactivos

Fluoroscein isotiocianato (FITC)-conjugadas anti-CD56, anti-CD16, anti-CD33, anti-CD3, anti-CD2, anti-CD11a, anti-CD94, anti-CD80, anti-CD44, anti-granzyme A, Allophycocyanin ( APC)-conjugadas anti-CD56, anti-CD11c, anti-CD38, anti-CD69, anti-CD117, (Pe)-conjugadas anti-CD117, NKB1 (KIR3DL1), anti-CD3, anti-CD16, anti-CD56, Anti-perforin, PerCP-conjugadas anti-CD3, anti-CD69, anti-CD8 y congruencia isotipo ratón mAbs se compraron y de Becton Dickinson (S Jose, CA). Pe-conjugadas anti-CD34, P58.1 (NK2DL1), P58.2 (NK2DL2), NKG2A se compraron de Immunotec (Marsella, Francia). Magnética cuentas no conjugada anti-CD56 y los Mac mini imán se compraron de Miltenyi Biotec (Auburn, CA). (APC)-conjugadas anti-CD95 (Pe) y no conjugada anti-CD95L se compraron de Caltag (Burlingame, CA). Ácido hialurónico se adquirió de Sigma (S Louis, Mo)

El aislamiento de células, la activación y expansión

Células CD34 + fueron seleccionados de forma positiva normal de donantes G-CSF-movilizó a las células madre de sangre periférica (PBSC) contado, y congelado en nitrógeno líquido hasta su uso. Todos los donantes dieron su consentimiento informado por escrito para donar células madre en protocolos de NIH 99-H-0046 y 95-H-0049. Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron separados por Ficoll-hypaque densidad de la separación. Las células fueron cultivadas en RPMI 1640 complementado con un 10% o 10% AB FCS suero, glutamina (2 mM), la gentamicina, en lo sucesivo, a medio terminar. CD34 + células se cultivaron en medio completo, en 24 o 12 o 96 y placas U (Costar), durante un mínimo de 10 a un máximo de 70 días. Las células fueron estimuladas cada 5-7 días con SCF (20-50 ng / ml) (Peprotech, Rocky Hill, NJ) con o sin IL-2 (200 U / ml) o IL-15 (1-100 ng / ml) . Para obtener poblaciones puras NK, células CD34 + estimulado por 15-21 días con IL-2 se tiñeron con un Pe-conjugadas anti-CD56 y CD56 + Moab células fueron aisladas por la clasificación electrónico utilizando un EPICS ALTRA Flow cytometer (Beckman Coulter, Miami, FL ). En algunos experimentos, las células inmaduras CD56 + fueron seleccionados con un anti-CD56 conjugado magnetica talón columna (Miltenyi Inc). Vigorosa la presión mecánica eluyen células CD56 + retenido en la columna. Sangre periférica células NK negativamente fueron seleccionados por la clasificación magnética utilizando un Miltenyi Kit de aislamiento. Positiva y negativamente seleccionado sangre periférica las células NK se ampliaron aún más en vitro de la siguiente manera: 100 μ l de 1 × 10 5 / ml CD56 + fueron mezclados con 100 μ l de 75 Gy en las células irradiadas LCL completo suplementado con IL-2 (10 U / ml ) Y el 15% son medianas acondicionado chapada en Costar 96 / w ronda final placas. Las células fueron estimuladas cada 3 días con CM complementado con un 15% de la CM requiere tiempo.

Análisis de citometría de flujo

En algunos experimentos, las células se tiñeron con Pe-conjugada anti-CD56 o anti-c-Kit (un color). En otros experimentos, las células fueron incubadas con FITC-anti-CD56 y anti-Pe-c-Kit (dos colores) o una combinación de Pe, FITC, PerCP, y APC-conjugado de anticuerpos específicos para las moléculas deseado (cuatro colores). En todos los casos las células se tiñeron en hielo, durante 30 minutos, se lava dos veces, fijado en el 1% paraformaldehido (PFA). Para los experimentos de tinción intracelular (IC), 1 millones de células fueron teñidas con un Pe-conjugadas anti-CD56 durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad a más de 2 ml de solución de lisis FACS se añadió a la mezcla de células.

Después de 10 minutos de incubación en RT, las células fueron lavadas y permeabilized con 0,5 ml FACS perm mezcla durante 10 minutos a TA. Las células que fueron teñidas con un anti-Pe-conjugadas anti-Perforin Moab y un FITC-conjugado anti-granzyme A moAb o Pe y FITC-conjugado moAb isotipos de control de ratón durante 30 minutos a RT, lavada y fija en 200 ul de 1% PFA. Las células fueron analizadas por un 4 filtros BD FACScan Excalibur. Transeuropeas de los experimentos así, después de un primer equilibrado (1 hora a 37 ° C) con total medio, 200 μ l de 5 × 10 4 - 1 × 10 5-CD34 de células derivadas de células NK o IL-2 activado células NK culturas fueron incubadas en Completar medio en la parte superior del compartimento de trans-así de una placa de 12 transwell (Costar, Cambridge, MA) en la presencia o ausencia de 5 × 10 3 - 5 × 10 4 K562, mientras que 1 ml de la cultura, de 5 × 10 3 fueron K562 Cultivadas en el compartimiento inferior. Un 0,4 μ m de policarbonato membrana separa los compartimentos superiores e inferiores. Después de una incubación de 2 días, alícuotas de 200 μ l de cultivo celular K562 fueron retirados del compartimiento inferior y etiquetados con 3H-TdR. La ruptura y el lavado de la cosecha permite entonces transmembrana de la parte superior del compartimento. Las células fueron contados o etiquetados con 3H-TdR.

Microcytotoxicity ensayo

Para revertir anticuerpos dirigidos citotoxicidad de células (ADCC) 6 repeticiones de 20 μ l de las células efectoras se incubaron en un 60 y (40 μ l de profundidad) Terasaki placa de 30 m a temperatura ambiente en la presencia o ausencia de 5 μ l (10 μ g / ml ) 3g8 (anti-CD16). Al mismo tiempo, FcR + P815 (2 × 10 6) se incubaron en 1 ml de medio completo suplementado con 10 μ l de Calcein-AM (Molecular Probes, Junction City, OR) de 30 'a 37 ° C, lavados cuatro veces Y diluido a 1 × 10 5 / ml. Después de la dilución de las células efectoras, 10 μ l de las células diana se añadieron, las placas fueron centrifugadas y se incuba a 37 ° C durante 4 horas. En algunos experimentos, con efectores no mAbs fueron retados con células K562. Unos minutos antes de la digitalización de las placas utilizando un detector fluorescente 5 μ l fluoro-amortiguación se añadió a cada pocillo. El porcentaje de lisis se calculó de la siguiente manera: 1 - (media-media prueba en blanco) / (max media-media en blanco) × 100.

Transcriptasa inversa reacción de polimerasa en cadena

ARN total fue extraído a partir de 1 × 10 6 positivamente seleccionados G-CSF-movilizó a la sangre periférica de células CD34 +, PBMC, en reposo o IL-2 activado total de la sangre periférica de células CD56 + y células NK utilizando Triazol reactivo; complementarias de ADN (cDNA) en el primer capítulo se produjo Leucemia Maloney murino utilizando la transcriptasa inversa (Roche), con un oligo (dt) 12-18 contra el primer sentido (Roche). El ADNc de interés es más grande, como se muestra en el cuadro I. Fragmentos amplificados fueron analizados en el 1,5% en la electroforesis en gel de agarosa la presencia de bromuro de etidio (Sigma, S Louis, MO).

Proliferación de ensayo

La proliferación de K562 y P815 se midió utilizando el tritio, la incorporación de timidina (3H-TdR) ensayo. Los tres primeros U-pozos de cada fila horizontal de 96 placas y se llenaron con 200 μ l de las células NK seleccionados negativamente o positivamente seleccionados de sangre periférica de células CD56 +, y luego de 100 μ l de las células fueron cultivadas en serie diluido en el resto de los pozos previamente cargadas con 100 μ l De la CM. Más tarde, el 1 × 10 4 K562 o P815 células se añadieron a los cultivos celulares. Después de 2 días de incubación, las células fueron pulsados con 1 μ Ci de 3H-TdR por así (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) Dieciocho horas después, 3H-TdR se midió usando una beta scintillation counter.

Resultados
Cinética de la generación de células CD56 +

Después de tres semanas de estimulación con IL-2 y el SCF, G-CSF movilizadas de sangre periférica de células CD34 + generado-CD2, CD56 alta (10,6 ± 11,4) (rango 3-39%) y CD56 baja (3,4 ± 2,0) (rango 0.7-5 %) En una muestra de tamaño normal, de 7 de los donantes (REF). Algunos de alta células CD56 y CD94 expresadas NKG2A pero carecían de expresión de KIR con inmunoglobulina como dominios KIR2DL2, mientras que CD56 se baja KIR negativa (Figura 1].

CD56 + células inmaduras falta granzyme By perforin

Hemos evaluado la próxima etapa de diferenciación de las moléculas asociadas a la citotoxicidad de células inmaduras CD56 +. Perforin y granzyme B mRNA expresión se midió por RT-PCR en las células CD34 + estimulados con IL-2. Perforin se observó en el día 0-1 de la cultura, pero desapareció durante el día 7. Tinción intracelular de las células inmaduras CD56 + reveló una granzyme un contenido comparable a la que se encuentra en la IL-2 activado PBL (Fig. 2]. En particular, la reducción de la intensidad de GAPDH banda puede reflejar la pérdida de viabilidad de las células a medio plazo la cultura.

Inducción de NKp46 inmaduros en células CD56 +

Luego trató de determinar si la estimulación de las células CD34 + con IL-2 y SCF inducida por los receptores NK citotóxica natural (NCR) de expresión. En un plazo de dos semana de la cultura, las células inmaduras CD56 + NK expresó algunas moléculas incluyendo activación CD44, CD69 y CD38 (datos no presentados), pero no expresó NCR genes hasta por lo menos 6 semanas. Al tiempo que las células CD56 + expresaron NKp46 pero no NKp30. Huellas de NKG2D y NKP80 expresión de ARN también se detectó por PCR (Fig. 3].

Ensayos funcionales de las células CD56 +

IL-2 activado células inmaduras CD56 + mostró citotoxicidad contra K562 insignificante en comparación con el potente lisis exhibido por las células NK de sangre periférica. Del mismo modo, en una inversión ADCC ensayo, las células inmaduras CD56 + recubierto con una anti-CD16 (3g8) mostró sólo baja citotoxicidad contra la FcR + línea celular, P815, mientras que el control de la sangre periférica de células NK fueron fuertemente citotóxica. Entonces investigó el efecto de las células CD56 + en la proliferación de las líneas celulares. Descanso células CD34 + no inhibió la proliferación K562, mientras que el flujo ordenados, tres semanas en cultivo de células CD56 + culturas K562 inhibió la proliferación de las células en una forma dependiente de dosis, hasta alcanzar el 90% de inhibición en un E: T ratio de 10:1. La inhibición de la proliferación inducida por las células inmaduras CD56 + osciló entre el 29 y el 96,5% (Cuadro 2]. Inmaduras de células CD56 + también comparativamente inhibe la proliferación de células resistentes a la línea NK P815, que indica que la inhibición de la proliferación es independiente de la resistencia de esta línea NK-a la citotoxicidad mediada. A diferencia de las células inmaduras CD56 +, derivados de sangre periférica de células CD56 + proliferado en la presencia de IL-2. No obstante atribuible a la proliferación de células K562 se suprimió cuando cultivadas con células CD56 + (Fig. 4]. Trans-así los experimentos se utilizaron para determinar si la inhibición de la proliferación celular K562 es mediada por células, la interacción o por factores solubles. En tres experimentos, el promedio de 3H-TdR incorporación de las células cuando K562 separados por una membrana de las células inmaduras CD56 + fue 5361 ± 1967 versus 5110 ± 1539 cpm para K562 crecimiento en la ausencia de factores solubles CD56 +. Esto sugiere que la proliferación es sobre todo bloqueado por contacto célula-célula (Tabla 3]. De examinar más a fondo el mecanismo de inhibición de la proliferación de K562, K562 cultivadas con cualquiera de las dos magnéticamente ordenados inmaduros células CD56 + en una cámara alta transwell y K562 células en la cámara baja durante dos días. K562 células viables (> 95% con azul de tripan negativos células) se recuperaron a partir de células inmaduras CD56 +, pero no de maduro CD56 + culturas. Después de agotar la K562/immature CD56 + CD56 + culturas de las células, utilizando anticuerpos recubiertos con perlas magnéticas, K562 residual de las células proliferado de nuevo, lo que indica que en ausencia de citotoxicidad, inhibición de la proliferación es reversible (datos no presentados).

Discusión

Prolongado de la cultura humana con células CD34 + IL-2 o IL-15, con o sin estroma de médula ósea pueden generar células citotóxicas células CD56 + [9, 5]. Estas células son CD94 + y + NKG2A pero no está claro si expresan otros KIRs [9 - 11]. Aquí hemos realizado un estudio de las primeras etapas de la generación de células NK de G-CSF movilizado células CD34 +. Después de tres semanas de estimulación con SCF + IL-2, que identificó un NK inmaduros de la población CD94 + + NKG2A KIR-células CD56 +. Estamos anteriormente que estas inmaduras CD56 + poblaciones son heterogéneas. Cabe destacar que hay una menor CD56 dim subconjunto de células CD33 + que pueden ser precursores de una nueva población de monocitos CD56 + [12]. La mayor población CD56 + CD56 + con brillante expresión y linfoide características incluyen un c-Kit + CD11a de células más maduras y un c-Kit-CD11a + subconjunto. El c-kit + celular puede ser el precursor de la c-kit-célula que ha perdido la respuesta a SCF y ha adquirido integrinas necesarios para la formación de meta-efector conjugados y asesinato [13]. Sin embargo, todos estos subconjuntos son CD56 + inmaduros con respecto al funcionamiento citotóxica aparato.

Pareja citotóxica células NK pueden ser generados a partir de células CD34 + cuando cultivadas con un IL-15-la producción de fibroblastos humanos bazo línea celular [14]. Sin embargo, la generación de las células NK completamente funcional toma muchas semanas de cultivo de células. Utilizando una línea celular de estroma estimulado con IL-15 Sivori et al no observar NK contra la citotoxicidad mediada K562 dentro de los primeros meses de la cultura. Después de un mes, las células expuestas citotoxicidad, pero permaneció KIR negativos [15]. Del mismo modo, en nuestros experimentos, la cultura a largo plazo inducidas por algunos marcadores NK maduros - NKp46 y NKp80 la expresión de los genes. Sin embargo durante el primer mes de la cultura CD34-derivadas de células CD56 + ejercida insignificante citotoxicidad. En ausencia de cualquier T, B o mieloide y algunos marcadores de células NK marcador (incluyendo NK marcadores de activación CD38, CD44 y CD69), consideramos importante la población de células CD56 + que se inmaduros células NK [16 - 19]. Su incapacidad para ejercer citotoxicidad es coherente con perforin y granzyme B knock-out modelos de ratones que carecen de la citotoxicidad mediada por células, mientras que granzyme A los ratones knock-out conservar citotoxicidad [20 - 22]. Como consecuencia de ello, mientras que las células NK maduras someterse funcional anergia y apoptosis en contacto con las células K562 [23, 24] cultivos mixtos de inmaduros CD56 + y K562 mantiene el número de células.

Porque inmaduras CD56 + células producen una variedad de citoquinas [6], hemos explorado la posibilidad de que puedan tener propiedades funcionales distintas de la citotoxicidad. Sorprendentemente, purificada de células inmaduras CD56 + inhibió la proliferación de las células K562 y de la línea de células NK resistente a bajas P815 E: T ratios. La ausencia detectable perforin excluidos de la posibilidad de que el efecto era debido a la contaminación por una pequeña población de células NK sobrevivir. Máxima inhibición de la proliferación es visto sólo cuando efector de meta se produjo el contacto. Esto sugiere que las células inmaduras CD56 +, mientras que carecen de citotoxicidad, había una novela-en contacto con la célula dependiente efecto citostático. Nuestros resultados sugieren que las observaciones anteriores de la médula ósea células NK hematopoyesis regular a través de una vía no citotóxica [25 - 28]. No está claro cuál es el mecanismo utilizado por las células inmaduras CD56 + para K562 y P815 de inhibición de la proliferación. Superficie celular TGF-beta expresión de CD56 + células inmaduras pueden ser responsables de dicha inhibición desde el momento de células CD34 + SCF y la IL-2 estimulación adquirir TGF-beta de la expresión génica (datos no presentados).

En conclusión, como se describe aquí las primeras etapas de generación de células NK de G-CSF movilizado células CD34 + en presencia de SCF y la IL-2. Aunque las células NK inmaduras carecen de los aparatos necesarios para citotóxicos clásicos como la citotoxicidad NK-que tienen la peculiar característica de la inhibición de la proliferación de los K562 y P815 líneas celulares. En nuestro futuro estamos planeando estudios para evaluar si los efectos antiproliferativos de células inmaduras CD56 + también de la participación de las células mieloides linajes y no líneas de células hematopoyéticas. Es posible que estas células normalmente residen en la médula ósea y tienen un efecto regulador en la hematopoyesis

Agradecimientos

Damos las gracias a Philip McCoy y Keyvan Keyvanfar (NHLBI, HB, NIH, Bethesda, EE.UU.), que amablemente nos ha proporcionado asistencia técnica para el tratamiento electrónico de la clasificación de células.