Virology Journal, 2005; 2: 31-31 (más artículos en esta revista)

Identificación de un truncado nucleoproteína metapneumovirus aviar en las células infectadas por codificada por un segundo-AGO-, en el marco de la larga duración de genes

BioMed Central
Rene Alvarez (ralvarez@vet.uga.edu) [1], Bruce S Seal (bseal@saa.ars.usda.gov) [1]
[1] Southeast Poultry Research Laboratory, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Athens, GA 30605, USA
[2] Present address: Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens, GA 30605, USA
[3] Las aves de corral Unidad de Investigación de la Seguridad Microbiológica, ARS, USDA, 950 College Station Rd., Athens, GA 30605, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Metapneumoviruses aviar (aMPV) causar una enfermedad del tracto respiratorio superior, con baja mortalidad, pero una alta morbilidad, principalmente en pavos comerciales. Hay tres tipos de aMPV (A, B, C), de la que el tipo C se encuentra sólo en los Estados Unidos. Los virus relacionados con aMPV incluir humanos, especies bovina, ovina, caprina y virus respiratorio sincitial y el virus de la neumonía de ratones, así como el recientemente identificado metapneumovirus humano (hMPV). El aMPV hMPV y se han convertido en el tipo de virus de un nuevo género dentro del Metapneumovirus. El aMPV nucleoproteína (N), secuencias de aminoácidos de los serotipos A, B, C, y se suman para un análisis comparativo. Basado en predijo antigenicidad de las secuencias de proteínas de consenso, cinco aMPV específicos N péptidos fueron sintetizados para el desarrollo del péptido-antígenos y antisueros.

Resultados

La presencia de dos aMPV nucleoproteína (N) de genes codifican polipéptidos se detectó en aMPV / C / US / Co y aMPV/A/UK/3b infectado células Vero. Nucleoproteína 1 (N1) codificados a partir del primer marco de lectura abierta (ORF) se predice que sea 394 aminoácidos de longitud para aMPV / C / US / Co y 391 aminoácidos de longitud aproximada de aMPV/A/UK/3b con pesos moleculares Kilodaltons de 43,3 y 42,7 kilodaltons, respectivamente. Nucleoproteína 2 (N2) se ha planteado la hipótesis de que se codifican por un segundo en los ORF-marco con ORF1 codifica una proteína y predice que contiene 328 aminoácidos para aMPV / C / US / Co o 259 aminoácidos para aMPV/A/UK/3b Con la aproximación de los pesos moleculares de 36 kilodaltons y 28,3 kilodaltons, respectivamente. Péptido anticuerpos a la N-terminal y C-terminal de porciones de la proteína N aMPV confirmó la presencia de estos productos en ambos aMPV/C/US/Co- y aMPV/A/UK/3b-infected células Vero. N1 y N2 para aMPV / C / US / Co ORFs fueron molecularmente clonado y expresado en células Vero utilización de vectores de expresión eucariotas para confirmar la identidad de la aMPV codifican proteínas.

Conclusión

Esta es la primera informó de la identificación de los posibles, en el marco de accesorios N2 ORF productos genéticos entre los miembros de la Paramyxoviridae. Secuencia genómica de los análisis relacionados con los miembros de la Pneumovirinae distintos aMPV, incluida la humana por virus respiratorio sincicial y virus sincicial respiratorio bovino demostrado la presencia de este segundo potencial ORF entre estos agentes.

Antecedentes

Metapneumovirus aviar (aMPV) causa la rinotraqueítis de pavo (TRT) y se asocia con el síndrome de la cabeza hinchada (SHS) de los pollos que es acompañada por lo general de infecciones bacterianas secundarias que pueden inducir aumento de la morbilidad y la mortalidad. Metpnuemovirus aviar se registró por primera vez en Sudáfrica durante el decenio de 1970 y posteriormente fue aislado en Europa, Israel y Asia [1, 2]. Durante el año 1997, la mortalidad por infecciones entre aMPV pavos comerciales en los EE.UU. varió entre cero, y el 30% cuando se acompaña de infecciones bacterianas, con condenas debido a la atmósfera sacculitis. Ésta fue la primera aMPV brote de infecciones en los EE.UU. que anteriormente era considerado exótico a América del Norte. El virus que causa la enfermedad fue designado un nuevo tipo C aMPV genéticamente diferente de homólogos europeos [3 - 5], y posteriormente se demostró que se guardan más relación con el metapneumovirus humano (hMPV) de diversos lugares geográficos [6, 7]. Infecciones entre los pavos comerciales con aMPV / C continuar en la parte norte-central de EE.UU. resultando en sustanciales pérdidas económicas para la industria avícola [6, 8, 9].

Pneumoviruses son miembros de la familia Paramyxoviridae que contienen un nonsegmented, sentido negativo-ARN del genoma de aproximadamente 15 kb de longitud. Los virus relacionados con aMPV incluir humanos, bovinos, ovinos y caprinos virus sincicial respiratorio y el virus de la neumonía de ratones [10], así como el recientemente identificado hMPV [11]. Aunque la longitud del genoma es similar, pneumoviruses diez genes que codifican en general, en comparación con seis o siete en otros paramixovirus. Estos incluyen el no proteínas (NS1 y NS2), la nucleoproteína (N), phosphoprotein (P), la proteína matriz (M), pequeñas proteínas hidrófobas (SH), la glicoproteína de superficie (G), proteína de fusión (F), la segunda matriz de proteínas ( M2) y un ARN viral dependiente de la RNA polimerasa (L). El pneumoviruses tener un F proteína que promueve la fusión de células, pero estos virus no hemagglutinate, ni tienen actividad de la neuraminidasa en su apego a proteínas G. Esta es una importante característica distintiva de los otros paramixovirus [10].

Dado que el genoma de un tamaño limitado, no muchos virus ARN segmentados, incluida la pneumoviruses, han ideado mecanismos para aumentar la capacidad de codificación de la proteína. Esto puede ocurrir en dos niveles: 1) transcripcional del mRNA de procesamiento o modificación [12 - 14] o 2) la traducción, en la que las proteínas pueden ser producidos a partir de distintos marcos de lectura abierta (ORFs) o de iniciación a la traducción no AGO o codones AGO [15 - 17]. Entre los pneumoviruses, codificación de uso secundario sólo se ha documentado para el M2 gen, que codifica dos proteínas. El M2-1, un factor de transcripción antitermination, processive es necesaria para la síntesis de RNA y de la lectura a través de transcripción de genes en los cruces. El M2-2 se ha involucrado en el cambio entre la transcripción del RNA viral y la replicación [18]. En este informe, se presenta evidencia de la utilización de un segundo marco de lectura abierta, en el gen que codifica N truncada nucleoproteína (N2) entre aMPV / C / Co aMPV/A/UK/3b y de las células infectadas.

Resultados
Metapneumovirus aviar N gen putativo AGO poseen varios sitios de inicio

El aMPV / C / US / Co nucleoproteína es codificada por el gen N predijo con un peso molecular de 42-45 kD [7, 19]. El gen N va de 1191 a 1206 nucleótidos de longitud [6, 19], con la primera AGO nucleótido en la posición 14 (Fig. 1] en los tres subtipos (A, B, y C). El aMPV / C / US / N Co gen putativo ha adicional en los sitios de inicio de nucleótidos posiciones 212, 350, 416, 758, 785, 827, 896, y 1022 con el "verdadero" Kozak [20] secuencias de nucleótidos en las posiciones 413 (ACCAUGG ACCAUGG ACCAUGG) y 893 (GAGAUGG GAGAUGG GAGAUGG), predijo con productos de traducción de 28,5 kD kD y 10,78, respectivamente. El gen ha aMPV/A/UK/3b N putativo adicional en los sitios de inicio de nucleótidos posiciones 161, 212, 293, 410, 413, 605, 722, 749, 749, 776, 818, 887, y 1013 con el "verdadero" Kozak [20] secuencias de nucleótidos en las posiciones 602 (AGGAUGG AGGAUGG AGGAUGG), 719 (AGGAUGG AGGAUGG AGGAUGG), y 884 (AAAAUGG AAAAUGG AAAAUGG), predijo con traducción de los productos kD 21,26, 16,73 kD, kD y 10,54, respectivamente.

Metapneumovirus aviar de las células infectadas producen dos proteínas (N1 y N2) codificada por dos marcos de lectura abierta dentro del gen N

Cinco péptidos en el aMPV N gen (Fig. 2] se utilizaron para generar afinidad de los anticuerpos purificados conejo péptido. Este enfoque fue explotado para determinar si alguno de los sitios alternativos de inicio de la aMPV N gen se utilizaron durante una infección activa de la célula. AMPV / N-péptido de anticuerpos dirigidos contra aMPV / C / US / N Co proteína aminoácidos 10-29 (DLSYKHAILKESQYTIKRDV) con sólo 3 cambios en ambos aMPV tipos AyB de aminoácidos en las posiciones 12 (S para S), 19 (K A la D) y 26 (K para R) reaccionó con los tres nucleoproteins por completo longitud oeste blot (Fig. 3A, Lanes 3, 4, y 5), pero no ha reaccionado con toda proteínas en células Vero no infectadas (Fig. 3A, Lane 2). Los tres virus se nucleoproteins entre 42-45 kD basado en SDS-PAGE/western blot (Fig. 3A]. Luego aMPV/C-N2 la prueba de anticuerpos contra el péptido de aminoácidos 128-148 a mediados de parte de la de la aMPV / C / US / Co aislar (Fig. 2] de la mancha occidental que se reconoce ninguna traducción de los productos N codificada por el gen y la utilización de los sitios de inicio de cualquier secundaria. Western blot reveló N gen putativo dos productos en aMPV / C / US / Co-infectados células Vero, la primera, la nucleoproteína de larga duración con un peso molecular de aproximadamente 43 kD (Fig. 3B, Lane 3), y el segundo, Una pequeña proteína de aproximadamente 35-36 kD (Fig. 3B, Lane 3). El péptido de anticuerpos a los aminoácidos 303 a 393 (aMPV/C-N4) sintetizado a ser reactiva a la C-terminal de la proteína N aMPV / C reconoció también dos proteínas como en la Fig. 3B, Lane 3 (datos no presentados).

Para evaluar si la utilización de los sitios alternativos de inicio era exclusivo de los miembros del grupo aMPV tipo C, o si esto también se produjo en otros tipos aMPV, utilizado aMPV/A-N3 y aMPV/A-N5 péptido anticuerpos (anti-aMPV / Tipo A, N proteínas, aminoácidos 126-145 y 380-390, respectivamente). A diferencia de aMPV/C-N2 péptido de anticuerpos, los anticuerpos aMPV/A-N3-peptide (aminoácidos 126-145) reaccionó a sólo un largo nucleoproteína (Fig. 3C, carril 3) similar a la aMPV / N-péptido de anticuerpos (Fig . 3C, carril 2), mientras que aMPV/A-N5-peptide de anticuerpos (aminoácidos 380-390) reaccionó con la plena nucleoproteína longitud de aproximadamente 41-43 kD (Fig. 3C, carril 4) y un menor de proteína aproximadamente 28-30 kD (Fig. 3C, carril 4). Por último, todos los aMPV anticuerpos específicos no se cruzan con otros metapneumoviruses activa (datos no presentados).

Expresión de la N1 y N2 ORF metapneumovirus aviar de tipo C / Colorado en células eucarióticas

Análisis de secuencias de la aMPV / C / US / Co aMPV/A/UK/3b N genes y las secuencias de nucleótidos reveló que aguas abajo de la primera AGO (posición 14) se putativo múltiples sitios de inicio como se ha descrito anteriormente (Fig. 1]. Por lo tanto, utilizan software de análisis de secuencia para analizar la N gen putativo marcos de lectura abierta y predijo la traducción de productos de cada sitio putativo de inicio para los productos que daría lugar a la aproximación de las proteínas de menor tamaño que la banda reactiva que se detectó por mancha occidental (Fig. 3B , Carril 3 y Fig. 3C, carril 4). Dos proteínas previsto en el aMPV / C / US / Co secuencias correspondientes a un predijo peso molecular de aproximadamente 31,12 kD (tercer AGO) y otro a 28,5 kD (cuarto AGO) fueron detectados en la N secuencia genética.

Desde SDS-PAGE análisis no es necesariamente una medida precisa del tamaño molecular, tanto comienza sitios podría dar lugar a una proteína observados en aproximadamente 35-36 kD por SDS-PAGE, y, por lo tanto, ya sea sitio podría resultar en el segundo ORF producto. Por ello, utilizó dos conjuntos N1/N1189C primer N212/N1189C y que se extiende ya sea en toda su extensión o la ORF1 y ORF2 cualquier corriente abajo putativo ORFs de aMPV / C / US / Co, respectivamente (Fig. 2] para amplificar tanto por ORFs RT-PCR. Ambas ORFs fueron amplificados y clonados en un vector de expresión eucarióticos. Western blot de las células Vero expresó N1 y N2 ORFs reveló una reacción en la banda pCR3.1-N1ORF transfectadas células Vero con la aMPV / N de anticuerpos (Fig. 4, carril 4) correspondiente a la longitud completa de la nucleoproteína aMPV, similares A la observada en aMPV infectadas células Vero (Fig. 4, carril 3). Esta proteína no se visualizan en la pCR3.1-N2ORF transfectadas células Vero (Fig. 4, carril 5), tal como se esperaba desde el primer N212 es aguas abajo del péptido (aMPV / N, aminoácidos, 10-29) utilizados para Sintetizar aMPV / N péptido de anticuerpos. Sin embargo, cuando el aMPV/C-N2 (péptido de anticuerpos dirigidos a los aminoácidos 383-393 de aMPV / NC proteína) se utiliza para la occidental blot, dos proteínas se reactiva en el pCR3.1-N1ORF células Vero, la primera en aproximadamente 43 kD (Fig. 4, carril 8), similar a la observada en aMPV infectadas células Vero (Fig. 4, Lane 7), y la segunda, una proteína de aproximadamente 35 kD (Fig. 4, Lane 8), ligeramente menor De la N2 ORF aMPV proteínas en células Vero infectadas (Fig. 4, Lane 7). Western blot de la pCR3.1-N2ORF inducida células Vero demostró una reacción de la banda de aproximadamente 35 kD (Fig. 4, Lane 9), similar a los más pequeños en la banda de reacción pCR3.1-N1ORF transfectadas células Vero. La nucleoproteína de larga duración, como era de esperarse no estaba presente en el pCR3.1-N2ORF transfectadas células Vero, desde el primer N212 es aguas abajo de la primera AGO sitio web inicial (posición 14).

Discusión

La utilización de los distintos marcos de lectura abierta para la ampliación de la información genética en negativo-stranded RNA virus ha sido bien documentado [10, 16, 17, 21, 22]. Sin embargo, existen diversos mecanismos de acceso a esta información genética. El phosphoprotein del virus del sarampión codifica una sola ARNm, que se lee en dos iniciado independientemente superposición de marcos de lectura [17], mientras que la transcripción de genes de virus de la gripe segmentos 7 y 8 son empalmados en el núcleo de la producción de dos tamaños diferentes de mRNAs que comparten el mismo 5'-proximal AUG codón inicial [16]. El gen P del virus Sendai se informa, que se transcribe en dos polycistronic mRNAs, P / C y V / C, que se traducen a la síntesis de P, C, C ', Y1, Y2 y proteínas independiente de empezar en dos sitios de la superposición de lectura Marcos [23 - 25].

Dentro de los Paramyxoviridae, el virus de la enfermedad de Newcastle posee una polycistronic phosphoprotein (P) de genes. Transcripcional modificación de la NDV P gen mRNA permite la expresión potencial de dos proteínas más pequeñas putativo, y designado V W [12], que parece ser el resultado de la polimerasa de la tartamudez en el sitio de la edición de las secuencias [13, 14], para la inclusión De la no-G plantilla de los nucleótidos en el gen P [12]. En consecuencia, durante la traducción hay un marco de cambio resultante de la producción de la V W o proteína, independientemente del número de nucleótidos G insertado [12]. Previamente se le sugirió que NDV [26] utilizados potencialmente una alternativa en el marco AGO sitio web inicial de manifestación de un accesorio similar a la proteína del virus de Sendai proteína X [21] que se ha demostrado recientemente que no se utilizó durante la infección de células en cultivo [ 27].

Virus de la neumonía de ratones, humanos y virus sincicial respiratorio bovino, y el metapneumovirus aviar también poseen polycistronic gen (s) [28 - 30]. La M2 de genes de todos los pneumoviruses que se superponen parcialmente contiene dos marcos de lectura abierta, con el 5'-proximal marco de lectura abierta a favor de la utilización de los criterios de ubicación y secuencia de inicio de su sitio web [28, 29]. El gen P del virus de la neumonía de los ratones es la única conocida polycistronic phophoprotein gen en el pneumoviruses, y utiliza en el interior de iniciación marco AGO codones de iniciación para generar un máximo de otros cuatro compañeros de carboxilo terminal de los productos [30].

En el presente estudio, hemos demostrado que el gen de la nucleoproteína metapneumovirus aviar, subtipos A y C son supuestamente polycistronic. Esto puede ocurrir por la utilización de un segundo en el marco del sitio de iniciación (AUG) para la generación de un truncado nucleoproteína presente entre células Vero infectadas. Secuencia análisis demostró la presencia de múltiples putativo de iniciación (AUG) empezar sitios a lo largo de la N gen, sin embargo sólo una alternativa de inicio del sitio de nucleótidos en las posiciones 212 y 410 de APV / C y APV / A, respectivamente, parecen ser utilizado para transcribir la proteína N2 Visto en las células infectadas.

La proteína N del Pneumoviruses oscila en tamaño de 42-45 kD, basada en SDS-PAGE movilidad relativa, y es altamente conservadas entre metapneumoviruses [7]. La proteína N, que protege el ARN del genoma de ribonucleasas, está asociada con otras proteínas virales (P, M2, y la L), que en conjunto forman el complejo de transcripción. El nucleocaspid es la plantilla para la transcripción y replicación, el ARN del genoma por sí sola no puede cumplir la función de la plantilla. Pneumovirus infección en las células resultados en la acumulación de la proteína N citoplásmica en cuerpos de inclusión que puede ser visualizado por inmunofluorescencia [31] o [7] inmunohistoquímica como relativamente grandes puntos que son por lo general muy cerca del núcleo de las células infectadas.

La elaboración de mapas de varias paramixovirus N proteínas, incluyendo el virus de Sendai y el sarampión, indicó que la proteína N tiene dos grandes dominios, el dominio amino terminal que parece ser necesario para la formación de nucleoproteína, que contiene los dominios necesarios para ARN vinculante y NN interacciones, en tanto que la carboxi - Interactúa con el dominio phosphoprotein (P), en particular cuando es parte del complejo de la polimerasa [32, 33]. En bovinos virus sincicial respiratorio (bRSV), la eliminación de la C-terminal de 32 aminoácidos de la proteína N inhibe la interacción con la proteína P, mientras que la remoción de 32 aminoácidos de la N-terminal tiene un efecto mínimo [32]. Sin embargo, casi todos de la N 2-391 de aminoácidos es necesaria para apoyar bRSV minigenome la síntesis de RNA [34]. La proteína truncada N2 abarca 328 aminoácidos (250 para aMPV / Tipo A) del carboxilo terminal de la escuela para pedir una proteína N, lo que sugiere que N2 puede no ser involucrados en el complejo de la polimerasa. Sin embargo los dominios responsables de la unión de la ARN y NN NP vinculante permanecen intactos, lo que sugiere que N2 puede jugar un papel alternativo en las células durante la infección viral.

Métodos
Células y virus

Células Vero se mantiene como monocapas en los medios de comunicación esencial mínimo (MEM) para contener complementada el 8% de suero fetal bovino con 100 unidades / ml penicilina G, 0,025 μ g / ml, anfotericina B, y 100 unidades / ml estreptomicina. El aMPV / C / US / Co y aMPV/A/UK/3b aislamientos se obtuvieron del Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (NVSL, APHIS, USDA, Ames, Iowa). Los virus se propagan en el 95% confluyentes en monocapas de células Vero MEM completarse para contener 2% de SFB y antibióticos, tal como se describe anteriormente [3]. Las células fueron infectadas en la multiplicidad de infección de los 10 (moi = 10), y el virus fue adsorbido por 1 hora a 37 ° C. Medios de comunicación y se añadió células fueron incubadas a 37 ° C, 5% CO 2 durante 72 horas o hasta 90% de efecto citopático se observó por microscopía de luz. Las células se raspó y cosechada por centrifugación a 8000 × g.

Computer análisis, la síntesis de péptidos y la producción de anticuerpos

La nucleoproteína (N) aMPV secuencias de genes de los serotipos A, B, yC (Genbank adhesión números: AAC55065, AAG42499, y AAF05909) se analizaron en el GeneWorks (Intelligentics, Mountain View, CA) y Mac Vector (Accelrys, San Diego, CA) el análisis de los programas de ordenador para determinar hydrophilicity, antigenicidad, y la identidad de las secuencias de aminoácidos deducida. Las secuencias fueron alineadas para la máxima similitud, y una secuencia de consenso se determinó a través de la mayor prevalencia de aminoácidos para cada residuo. Cinco péptidos con secuencias: 1) aMPV / N: DLSYKHAILKESQYTIKRDV; 2) aMPV/C-N2: DKEARKTMASATKDNSGPIPQ; 3) aMPV/A-N3: ERTTREAMGAMVREKVQLTK, 4) aMPV/C-N4: LNINEEGQNDY, y 5) aMPV/A- N5: LGGDDERSSKF fueron escogidos sobre la base de la antigenicidad y hydrophilicity que se utilizarán para la generación de aMPV péptido basado en anticuerpos. Péptidos fueron sintetizados en la Investigación Genética (Huntsville, AL) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

En pocas palabras, la cría de conejos aMPV / N péptido anticuerpos son producidos por la Investigación Genética (Huntsville, AL) de acuerdo al protocolo del fabricante. Dos conejos fueron inyectados con 0,1 mg de KLH-conjugados péptido emulsificado con adyuvante completo de Freud y se inyecta en cuatro subcutánea (SQ) sitios en el día 1. En los días 14, 42, y 56 conejos, se inyecta de nuevo (Impulsores) con 0,1 mg de KLH-conjugados péptido emulsificado con adyuvante completo de Freud [35]. Los sueros fueron recogidos en los días 0, 28, 56 y 70. Conejo pre-inmune sueros se utilizaron como controles negativos de los ensayos de conejo.

SDS-PAGE y Western blot ensayo

Concentración de proteínas de la fracción sobrenadante de las células infectadas se midió la concentración de proteína por el reactivo de Bradford (Bioworld, Dublin, OH) a 595 nm. Infectados sobrenadantes fueron desnaturalizados en la muestra buffer Laemmli (BioRad, Hercules, CA) y se hierve durante 5 min. Desnaturalizado polipéptidos (6 μ g de proteína / carril) se separaron en un dodecil sulfato sódico 4-20% de poliacrilamida Criterio (Biorad, Hercules, CA) por electroforesis en gel de gradiente (SDS-PAGE) a 120 V por 2 horas [36]. Polipéptidos se transfirieron a nitrocelulosa mediante la aplicación de un voltaje constante de 10 V durante 1 hora en un Biorad (Hercules, CA) Trans-Blot SD Semi-seco de transferencia de células [37]. Blots fueron bloqueadas con BLOTTO (20% seco de la leche en PBS) durante la noche a 4 ° C durante 1 hora a 37 ° y 3 X lavados en buffer fosfato salino (PBS). Purificado por afinidad conejo de anticuerpos anti-péptido (diluida 1:100) se utilizó como fuente primaria de los anticuerpos y se incubaron durante 1 hora a 37 ° C seguido de 3 lavados en PBS. Secundaria de anticuerpos (α-conejo IgG-fosfatasa alcalina, Sigma, The Woodlands, TX) fue añadido (1:500), se incubaron 1 hora a 37 ° C, lavar 3 X en PBS y desarrollado utilizando un kit de sustrato de fosfatasa alcalina (Vector, Burlingame, CA).

Aislamiento Viral RNA acompañado por RT-PCR de amplificación de aMPV / C / US / Co N1 y N2 ORF las secuencias de nucleótidos

Total RNA fue aislado [38] de aMPV / C / US / Co-infección de células Vero lisados utilizando Qiagen "RNeasy" kit (Qiagne, Valencia, CA), según el protocolo del fabricante. ARN fue analizada por la pureza por electroforesis en gel de agarosa en un gel de agarosa al 1,5%, a 125 voltios, y manchadas de 10 μ g / ml de bromuro de etidio (Sigma, The Woodlands, TX). El aMPV N1 y N2 ORFs fueron transcritas invertir utilizando el N1 (5'-GAAATGTCTCTTCAGGGGATTCAG-3 ') y N1185C (5'-AATCATTCTGGCCTTCCTCAT-3') o el primer par N212 (5'-ATGCAGTACGTGAGCACC-3 ') y N1185C ( 5'-AATCATTCTGGCCTTCCTCAT-3 ') primer par, seguido por 30 ciclos de PCR [39]. RT-PCR productos de amplificación fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa y de la longitud completa de productos N1 ORF y la N2 ORF producto fueron extirpados y purificados antes de la clonación en la expresión del vector pCR3.1-Topo (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Molecular, la clonación, la secuenciación de nucleótidos, y de expresión eucarióticos de pCR3.1-N1ORF y pCR3.1-N2ORF

La ORF N1 y N2 ORF fragmentos de aMPV / C / US / Co fueron clonados en el vector de expresión eucarióticos pCR3.1-Topo (Invitrogen, Carlsbad, CA), según el protocolo del fabricante. Plásmido de ADN fue aislado utilizando Qiagen la miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA). Doble varados secuenciación con Taq polimerasa (Applied Biosystems Inc) y la etiqueta fluorescente dideoxynucleotides se realizó con un secuenciador automatizado [40] de ambos productos de amplificación para verificar la identidad y asegurar que no se introduzcan cambios en la ORFs se había hecho con respecto al original N gen. El pCR3.1-N1ORF y pCR3.1-N2ORF vectores fueron transfectadas en células Vero utilizando lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA). Proteína fue inducida con IPTG (Sigma, The Woodlands, TX) a las 24 horas después de la transfección y proteínas totales fueron cosechadas por raspado. Una parte alícuota de uninduced y inducidas en células fueron lisadas 2 X Laemmli de amortiguamiento, se hierve durante 5 minutos y separados por SDS-PAGE en un 4-20% Criterio (Biorad, Hercules, CA), en gel de gradiente, seguido de electroblotting nitrocelulosa en que se describió anteriormente .

Conflicto de Intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Dr Alvarez fue un post-doctoral asociado y llevó a cabo la primera experimentación siguientes diseño de péptidos y la producción de antisueros, bajo la dirección del Dr Seal. Dr Alvarez inició el proyecto de escritura de manuscritos con posteriores ediciones y revisiones por ambos autores.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por ARS, USDA CRIS proyecto N º 6612-32000-015-00D-085 y de los EE.UU. de aves de corral y de huevos Asociación de subvención no. 404 BSS, que apoya a la síntesis de péptidos y anticuerpos para la inmunización comercialmente.