Virology Journal, 2005; 2: 33-33 (más artículos en esta revista)

Caracterización de la proteasa de dominio de Rice tungro bacilliform virus responsable de la tramitación de la proteína de la cápside poliproteínas

BioMed Central
Philippe Marmey (marmey@mpl.ird.fr) [1], Ana Rojas-Mendoza (arojas@cnb.uam.es) [2], Alexandre de Kochko (dekochko@mpl.ird.fr) [1], Roger N Beachy (rnbeachy@danforthcenter.org) [3], M Claude Fauquet (iltab@danforthcenter.org) [3]
[1] IRD, UMR DGPC «», BP 64501, 34394 Montpellier cedex 5, Francia
[2] Protein Design Group, Centro Nacional de Biotecnologia, Campus Universidad Autonoma Cantoblanco, 28049 Madrid, Spain
[3] Donald Danforth Plant Science Center, 975 North Warson Road, St. Louis, MO 63132, USA

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Resumen
Antecedentes

Rice tungro bacilliform virus (RTBV) es un pararetrovirus, y un miembro de la familia Caulimoviridae del género Badnavirus. RTBV ha abierto un largo marco de lectura que codifica una gran poliproteínas (P3). Pararetroviruses muestran similitudes con los retrovirus en la organización molecular y replicación. P3 putativo movimiento contiene una proteína (MP), proteína de la cápside (CP), el aspartato proteasa (PR) y de la transcriptasa inversa (RT) con un ribonucleasas H actividad. PR es miembro de la agrupación de las proteasas retrovirales y sirve para proteolytically proceso P3. Trabajo previo establecido en la N-y C-terminal de las secuencias de aminoácidos de la CP y TR, de la teoría de procesamiento de PR, y las estimaciones de la masa molecular de PR por mancha occidental ensayos.

Resultados

Una masa molecular de una proteína que se asoció con viriones fue determinada por HPLC en la línea de masas de ionización electrospray análisis espectral. Comparación con las proteasas retrovirales secuencias de aminoácidos que permiten la caracterización de un dominio putativo de la proteasa en esta proteína. La creación de modelos estructurales revelaron una gran semejanza con las proteasas retrovirales, con global de los pliegues que rodean el sitio activo están bien conservadas. Expresión en E. Coli putativo de dominio se vio afectado por la presencia o ausencia de la parte activa en la construcción. Análisis de la transformación de la CP de PR, utilizando pulso persecución etiquetado experimentos, demostraron que la proteína de 37 kDa cápside depende de la presencia de la proteasa en las construcciones.

Conclusión

Los resultados sugieren la caracterización de la proteasa RTBV dominio. Secuencia de análisis, creación de modelos estructurales, los estudios in vitro de expresión son pruebas para examinar el putativo de dominio como el dominio de la proteasa. Análisis de la expresión de diferentes péptidos correspondientes a los diversos ámbitos de la P3 sugiere un tratamiento de los CP de PR. Este trabajo aclara la organización de la RTBV poliproteínas, y su procesamiento por el RTBV proteasa.

Antecedentes

Planta pararetroviruses se clasifican como miembros de la familia Caulimoviridae que comprende 6 géneros [1]. Al igual que los retrovirus, los miembros de este grupo de virus de la transcriptasa inversa para uso de la replicación del genoma [2, 3]. Sin embargo, se diferencian en dos puntos principales: los retrovirus tienen un genoma de RNA que pararetroviruses tienen un genoma de ADN, y, una forma de retrovirus proviral integrado en el cromosoma de acogida mientras que el ADN de pararetroviruses acumula en el núcleo de múltiples copias de un cromosoma circular [4].

Retrovirus y pararetroviruses muestran similitudes en su organización y molecular proceso de replicación y están relacionados filogenéticamente. Estos grupos de virus de la producción directa de un terminal redundante ARN que se utiliza como replicativa intermedio y como mRNA. Muchos de los genes que codifican por pararetroviruses son homólogas en secuencia y / o en función análoga a los de los retrovirus. El genoma de todos los replicación de los retrovirus competentes consta de tres grandes elementos genéticos que figuran en el orden gag-pol-env (estructural-replicación sobres proteínas). Cada proteína se produce como resultado de frameshifting durante la traducción, o la supresión de los codones de parada en la poliproteínas. Productos de la gag ORF representan los componentes estructurales de la matriz viral, es decir, la cápsida y nucleocapsidproteins; dominios de la pol generalmente comprenden la proteasa, la transcriptasa inversa, ribonucleasas y una endonucleasa / integrasa. Pararetroviruses codificar el gag-pol básicas, pero carecen de una integrasa, como la integración del ADN viral en el cromosoma de acogida no es necesario [5].

Retrovirus pararetrovirus poliproteínas y se cree que son procesados por su propio aspartato proteasas [3, 6, 7]. Estas proteasas contienen varias regiones conservadas en comparación con los demás y compartir las secuencias consenso en el sitio activo, pero no muestran homología con otras proteasas virales. Proteína fisuras por estas y otras proteasas dependen de la secuencia de aminoácidos y de conformación cerca de la división sitio [6].

Rice tungro es una de las principales enfermedades del arroz en el sudeste de asia y es causada por una doble infección por dos virus [8, 9]: Rice tungro bacilliform virus (RTBV) [10, 11], un miembro del género Badnavirus en la familia Caulimoviridae [ 1], y, Rice tungro virus esférico (RTSV), un virus de ARN-desamparados y miembro de la Waikivirus género en la familia Sequiviridae [12, 13]. RTBV es responsable de los síntomas de la enfermedad [8] y RTSV es necesario para la transmisión de los dos virus de la leafhopper vector Nephotettix virescens [14, 15].

RTBV es un genoma de ADN de doble varados 8,0 kbp con dos específicos de cada sitio, discontinuidades resultantes de la replicación de la transcriptasa inversa [3, 16]. El genoma RTBV tiene cuatro marcos de lectura abierta (ORF) [17]. ORF3 tiene similitudes con el gag-pol núcleo de los retrovirus. El poliproteínas (P3) contiene una proteína putativo movimiento (MP), proteína de la cápside (CP), el aspartato proteasa (PR), y de la transcriptasa inversa (RT) con un ribonucleasas H actividad. La N-y C-terminal de aminoácidos (aa) secuencias de la CP se deduce de masa MALDI-TOF análisis espectral [18]. La ubicación de la CP de dominio, que está codificada por aa 477-791 en P3, fue confirmada por immunodetection reacciones planteadas utilizando anticuerpos contra diferentes sectores de la ORF3 [18]. P3 secuencia aa 985-995 homologías muestra a la parte activa de aspartato proteasas codificada por retrovirus y pararetroviruses, con la secuencia DSGS cree que se la proteasa RTBV sitio activo. El cambio de una a D (ácido aspártico a una alanina), en esta secuencia afecta el procesamiento proteolítico de la RT [19]. Detección de RTBV productos genéticos in vivo reveló una importante proteína de 13,5 kDa en los preparativos de virus, mediante el uso de un anticuerpo contra la aa dominio 881-1098 [10, 20]. El anticuerpo se utilizó en inmunoelectrónica etiquetado obligatorio y mostraron reacciones en la superficie de la partícula del virus, lo que sugiere que la PR se encuentra en o cerca de la superficie del virus de partículas [20].

En este trabajo se utiliza el análisis de espectrometría de masas para caracterizar la proteasa RTBV dominio en una proteína asociada con viriones purificados, y confirman la hipótesis de in silico de modelos y estudios de expresión in vitro. Análisis de los productos de la transformación in vitro de P3 sugiere que RTBV aspartato proteasa involucrada en la liberación de la CP de la poliproteínas P3.

Resultados
Determinación de la masa molecular

En la línea de ionización por electrospray HPLC se utilizó para determinar la masa molecular de las proteínas que fueron aisladas en los preparativos de RTBV. Varios picos se observó la aplicación de este criterio, ninguno de los cuales corresponden a los conocidos masa molecular de las subunidades CP [18]. Muchos de los principales picos fueron acompañadas por una baja cantidad de proteínas de similares pero no idénticos cargo: presume que estos picos representados diversos cargos statesof el péptido / proteína. Reconstrucción de los datos, se aplicaron después de algoritmos para convertir a la familia de los picos de iones, dio una proteína con peso molecular de 13794 Da ± 4 (Figura 1]. La falta de recuperación o la detección de las proteínas del tamaño de las subunidades CP es probablemente el resultado de una retención en la columna HPLC debido a la muy básica cargo de la proteína; estima punto isoeléctrico (pI), de CP es 9,43.

Localización de la proteasa de dominio

Al comparar la secuencia conocida de la proteína en P3 con RTBV aspartato proteasas codificada por otros retrovirus que predijo que cinco posibles proteínas podrían obtenerse con un peso molecular de 13794 ± 4 Da que podría contener el sitio activo de dominio putativo DSGS (a aa 987-990 ) Y la secuencia de IIG. El IIG es motivo de secuencias conservadas entre las proteasas retrovirales y está situado en la aa 1063-1065 en P3. Los cinco predijo proteínas (Figura 2] se cubren aminoácidos 965-1085, 967-1086, 971-1091, 982-1102 y 984-1104, predijo con masas moleculares de 13790,71 Da, Da 13790,71, 13796,7 Da, Da y 13791,7 13795,7 Da, respectivamente. Estas predicciones de los cinco ámbitos se basan en la combinación de masa molecular y la presencia de motivos conservados, y no putativo de la proteasa división sitios que flanquean los cinco predijo proteínas.

Modelo estructural de la proteasa

La secuencia general de similitud entre aspartato proteasas es muy baja (por debajo de 25%) sobre la base de criterios de puntuación pairwise; veces, por lo tanto, hemos aplicado métodos de reconocimiento para detectar a distancia homólogos. La alineación de la secuencia de las proteínas seleccionadas para el análisis mostraron una fuerte conservación en el sitio activo de las proteínas (Figura 3]. La alineación entre el pairwise Rous sarcoma virus (RSV) y la plantilla RTBV secuencia se presentó a la elaboración de modelos comparativos. Como representado en el modelo (Figura 4], existe una gran similitud entre las estructuras previsto para RTBV y RV proteasas. La falta de identidad en la predicción de estructuras puede deberse a la inexactitud inherente de los modelos de programas, debido a las diferencias inherentes en el sustrato y proteínas, y otras características. Teniendo en cuenta estas diferencias, como se deduce por un sistema de asignación de plegado [21] (donde se obtuvieron resultados fiables), la secuencia de la proteasa tenían una estructura plegable predijo que era muy similar a varios otros aspartato proteasas. El general veces rodea el sitio activo es bien conservadas entre las RTBV putativo de la proteasa y RV proteasa utilizados como plantilla (Figuras 3 y 4].

Inducción de la proteasa putativo de dominio

Primers específicos (Ab-PR-F y Ab-PR-R) se han diseñado para ampliar el dominio putativo de la proteasa deducirse del análisis de espectrometría de masa (Figura 2-A]. ADN utilizado para la amplificación de PCR incluyó a la escuela para pedir RTBV clon pBSR63A, y plásmido pBS-mp/PR; las reacciones provocó el aislamiento de péptidos y PR mPR, respectivamente (Tabla 1 y Figura 5]. PR mPR y difieren unos de otros sólo en el aminoácido 987, en la que el residuo se cambió de Aspartic ácido (D) a Alanine (A). Los péptidos se expresaron en E. Coli y, después de la inducción de la expresión de genes de los extractos fueron sometidos a SDS-PAGE, y geles fueron teñidos con azul coomassie (Figura 6-A]. El tamaño esperado de los péptidos fue de aproximadamente 14 kDa. No hemos detectar una proteína en cultivos que contienen pTr-PR. Sin embargo, en extractos de las culturas que contiene pTr-mPR, la proteína mPR se detecta fácilmente en la posición de espera en el gel. Occidental ensayos de inmunoblot utilizando anticuerpos contra planteadas mPR (Ab-PR) confirmó que el péptido de 14 kDa fue mPR (Figura 6-C].

Análisis de la transformación de las poliproteínas P3

Pulso de persecución se utilizaron técnicas de etiquetado para revelar posible procesamiento de P3 de la proteasa en E. Coli. Después de 1 hora de inducción culturas fueron etiquetados con 35 S-metionina durante cinco minutos después de que la proteína extractos fueron sometidos a SDS-PAGE, seguida de la autorradiografía. Múltiples bandas se observaron en cultivos que contienen cada plásmido (Figura 7]. Péptidos representan a los patrones de proteínas que se expresan y se procesa entre 60 y 65 min después de la inducción. Patrones de péptidos inducida de construir pET-MP-PR y pET-MP-mPR fueron muy similares con una diferencia visible, a saber, la presencia de una banda de 37 kDa en las células que contienen pET-MP-PR. Esta banda está ausente en las células que contienen pET-MP-mPR, con el plásmido mutante PR. Esta diferencia también se observa entre las culturas que contienen construcciones pET-P3 y pET-mP3. La banda de 37 kDa no estuvo presente para el clon pET y pET-MP-28 (no insertar), pero fue en las células que contienen el código que construye un péptido que contiene el PC y la proteasa, es decir, pET-MP-PRand pET-P3.

Discusión

Proteasas retrovirales han sido estudiados durante muchos años ya que son esenciales en el control de la replicación de los retrovirus. Proteasas retrovirales contienen alrededor de 100 residuos de aminoácidos de longitud, y contiene una copia del sitio activo Asp Gly-Thr-Asp-Ser o Gly-[22]. Se propuso que se activa como homo-dímeros [23]. Cristalográfica estructuras de Rous sarcoma virus (RSV) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) demostró que el PR de los virus son dímeras, con dos copias del sitio activo se incorporaron a la proximidad en el cruce entre el dímero asociados [24, 25] . Hasta la fecha, numerosas proteasas retrovirales han sido investigados, y sus estructuras determinada [26]. La proteasa retroviral se forma por la duplicación de los cuatro elementos estructurales: una horquilla, una gran bucle, una α-hélice y una segunda horquilla. Active sitio secuencias se sitúan en la prolongación del anillo de la modelo estructural, que implica que el sitio activo es un número de aminoácidos lejos de la N-terminal de proteínas retrovirales.

El CP dominio fue previamente caracterizado por MALDI-TOF (matriz asistida por láser de desorción / ionización-tiempo de vuelo) el análisis de espectrometría de masas [18]. Un único dominio CP fue identificado, con posiciones de los amino-y carboxi-terminales de la CP en 477 bis y 791, respectivamente. La masa molecular de la CP está decidido a ser 37303 Da pI con un estimado de 9,43. Una base pI puede explicar la ausencia de picos relacionados con la CP en nuestra masa análisis espectral. En este trabajo, de viriones RTBV fueron sometidos a en línea HPLC-electrospray y espectrometría de masas de ionización de análisis. La columna HPLC se espera que hayan conservado la CP antes de análisis de espectrometría de masas. La masa molecular de la proteína que se encuentra por estos análisis se determinó que se 13794 ± 4 Da, con un putativo punto isoeléctrico de 6,3. Ya sospechábamos que esta proteína es la proteasa viral, que fue codificada en la proteína P3.

Cinco péptido dominios, con el previsto en masa de las proteínas identificadas en viriones, se encontró que contienen el principio activo DSGS sitio, el sitio activo de una aspartato proteasa, y de la región conservada IIG (Figura 2]. Se compararon las secuencias procedentes de los cinco putativo proteínas con secuencias de las proteasas retrovirales, un proceso que nos llevó a predecir que el péptido que comprende aa 965-1085 representa la proteasa, sobre la base de la posición de la parte activa dentro de la secuencia prevista. En la proteína predice la Aspartic de residuos de ácido sitio activo sería 23 aminoácidos fuera de la N-terminal, el sitio activo es de 25 y 37 bis de la N-terminal para el VIH y el RSV, respectivamente.

Para confirmar si la secuencia objeto es o no es una proteasa, se utilizó una combinación de secuencia y estructurales predicciones procedimientos para construir un modelo estructural para la RTBV proteasa (Figura 4-A] con RV proteasa como plantilla (Figura 4-B] . La coherencia en el reconocimiento veces se dio por resultados fiables en contra de las diferentes plantillas de la misma clasificación SCOP (SCOP clasificación b.50.1). Las proteínas de este redil muestran una beta cerrada barril. En el modelo, algunos de los capítulos beta elementos faltan, sin embargo el resto de las hojas beta se pueden organizar en una conformación predicho ya que son producto de la secuencia de las duplicaciones. Teniendo en cuenta que el dominio de la proteasa es parte de un multi-dominio de la proteína, adicional interacciones entre los dominios puede influir en el plegamiento de las distintas subunidades. La conservación en el sitio activo predicho, y predijo el plegamiento global de las secuencias nos llevaron a predecir que el dominio posee una actividad de la proteasa. Posteriores pruebas de que el experimento confirmó que el pronosticado sitio activo puede ser inactivo por mutación del D al A, predijo la estructura secundaria y el reconocimiento veces los análisis con el modelo de construcción que llevan a la conclusión de que la proteína implica un aspartato proteasa.

Plásmidos que codifican péptidos PR mPR y se introdujeron de expresión en E. Coli: sin embargo, PR no se acumulan en E.coli mPR mientras que se expresó con normalidad y reaccionó con Ab-RTBV y con anticuerpos Ab-PR. En otros estudios, de la mutación de un D en el sitio activo de la proteasa RTBV era la que afecta a su actividad [19]. Sugerimos que PR no se acumulan en E. Coli ya que el péptido es una proteasa activa que no se tolerará en el país de acogida. Los intentos anteriores para expresar las proteasas en el E. Coli han tenido resultados similares [27, 28].

Un antisuero contra la región aa 881-1098 de la P3 fue producida en los estudios anteriores [20], este péptido incluye el dominio de la proteasa. El uso de este anticuerpo, una proteína de aproximadamente 13,5 kDa se detectó por Western-Blots ensayos de virus en los preparativos y en los tejidos infectados, lo que sugiere que la proteína se detectó que representó a la proteasa viral [20]. Además, el antisuero se utiliza para etiquetar las partículas de virus, y reveló que la etiqueta se adjunta a la viriones. La caracterización de PR dominio, y las reacciones immunodetection realizado en el presente estudio están de acuerdo con los resultados anteriores, y también con los estudios realizados por Marmey et al. [18], que investigó un péptido que comprende aa 806-961 de P3, Que se denominó IR. IR no reaccionó con Ab-RTBV suero, lo que sugiere que la región de infrarrojos no contiene secuencias relacionadas con la CP. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que el péptido IR corresponde a la región intervenir entre PC y PR, y que puedan participar en la tramitación de P3 [18]. Con el presente estudio de la N-y C-terminal de secuencias de aminoácidos que se caracteriza ahora por CP, PR y RT-Rnase H [18, 19]. Sin embargo, no identificamos aparente secuencia de la división similitudes entre los sitios que podrán ser utilizados por el PR (Figura 8]. Esta falta de similitud de secuencia es habitual para aspartato proteasas virales [29, 30]. Otros detalles que aún beclarified en la organización de P3 son: caracterización de la circulación de dominio, y el orden y en el que las tasas de los distintos sitios en P3 se cleaved.

Un trabajo previo realizado en células de insectos utilizando baculovirus basado construcciones, incluidas las construcciones que en el sitio activo de la proteasa fue mutado reveló que fue procesada por RT PR [19]. En el presente trabajo, la transformación in vitro de la CP de PR se demostró en E.coli. Si immunoprecipitations con anticuerpos no fueron alcanzados por razones técnicas, la presencia de los 37 kDa péptido se asoció con la co-existencia de PC y PR activo en la construcción. Es la primera vez que esa transformación es para pararetroviruses demostrado (por ejemplo, Commelina virus del moteado amarillo, el virus del rayado del banano, el cacao hinchada disparar virus), donde PC y PR son componentes de la misma poliproteínas.

Nuestros resultados aclarar la organización de P3, y su procesamiento por su propia proteasa y dar lugar a un conocimiento más completo del proceso de replicación y los posibles puntos de control de pararetroviruses.

Métodos
RTBV cepa empleada para el análisis

El RTBV cepa utilizada para el análisis fue desde el Instituto Internacional de Investigaciones sobre el Arroz (IRRI, Los Baños, Filipinas). De la secuencia del genoma fue publicado [11], con el número de [GenBank: M65026].

Mutación del sitio activo de la proteasa

Plásmido pBS-mp/RT [19] contienen la putativo mutado la transcriptasa inversa y la proteasa de RTBV. El ácido aspártico en la secuencia DSGS DSGS (RTBV P3, aminoácidos 987) se cambió a la alanina, por lo que en la secuencia ASGS ASGS. PBS-mp/RT plásmido se utilizó para profundizar el sub-clonación.

El análisis por espectrometría de masas

En la línea de HPLC ionización por electrospray y espectrometría de masas [31], fue empleado. El protocolo experimental fue similar al descrito [19]. MacBioSpec algoritmos (Sciex) se utilizan para convertir la familia de los picos de iones, que son el resultado de la proteína en los diversos cargos que se dice, a una masa molecular exacta. Virus muestra fue desnaturalizado con guanidium clorhidrato en 4,8 M antes de la inyección en la columna.

Secuencia y el análisis estructural de predicción

El RTBV secuencia se utilizó como una consulta para el programa BLAST contra las bases de datos no redundantes y bases de datos de AP. No se identificaron importantes éxitos, con un adecuado e-valores por estas consultas. La secuencia fue remitida a veces los métodos de reconocimiento en el metaserver http://genesilico.pl [32]. Fiables plantillas se encontraron con puntajes altos, todos los cuales se encuentran en las proteasas retrovirales (todas las proteínas beta: SCOP clasificación b.50.1.1). Varios pairwise alineaciones entre RTBV plantillas y se comprueba mediante SQUARE [33], y además presentó a la elaboración de modelos de homología Swissmodel utilizando el programa [34]. Los modelos fueron evaluados utilizando PSQS http://www1.jcsg.org/psqs/ [35] y Whatif http://www.cmbi.kun.nl/gv/servers/ herramientas [36]. La estructura de la Rous sarcoma virus (RSV) proteasa (pdb código 1bai_A) siempre que el mejor modelo como aspartato proteasa viral, y se ha elegido para este propósito. Ilustraciones para el modelo se generaron utilizando MolMol [37].

Construcciones de plásmidos

A la escuela para pedir RTBV clon pBSR63A [11] se utilizó como matriz de ADN de las reacciones de PCR para amplificar regiones específicas de ORF3 usando primers específicos que se han diseñado para amplificar secuencias específicas del genoma RTBV. Constructores de la clonación fueron obtenidos por la PCR fragmentos en vectores y / o por la clonación con fines de los fragmentos obtenidos tras la digestión de construcciones con las enzimas de restricción y pBS-mp/PR (Tabla 1]. La clonación se realizó en pBluescript KS vector (Stratagene / EE.UU.), en pTrHis vector (Invitrogen / EE.UU.) y en el vector pET (Novagen / EE.UU.). Enzimas de restricción se utilizan de acuerdo con el fabricante (Gibco-BRL, EE.UU.).

Expresión de proteínas

Todos los vectores de la base pTrHis se transformaron en E.coli DH5-α. Los plásmidos resultantes fueron designados pTr-PR, pTr-mPR y dio lugar a la síntesis de péptidos, de nombre PR, mPR, correspondientes a las regiones entre los residuos 965-1085 (Figura 5], con el plásmido pTr-mPR codificación péptido con 987 aminoácidos mutados de D al A.

Análisis de la transformación in vitro

Todos los vectores pET se transformaron en E.coli BL21/DE3 (pLys S). Los plásmidos resultantes fueron designados pET-MP, pET-MP/PR, pET-P3, pET-MP/mPR, pET-mP3. Estos plásmidos codifican (en orden) péptidos, llamado MP, MP-PR, P3, MP-mPR, mP3 correspondientes a las regiones entre los residuos 1-606, 1-1195, 1-1675, 1-1195, 1-1675, respectivamente ( Figura 5]. Plásmidos pET-MP/mPR y pET mORF3 codifican péptidos con aminoácidos mutados 987 de la categoría D con A. Las bacterias fueron inducidos con IPTG en el medio M9 sales, utilizando rifampicina y una mezcla de aminoácidos que carece de metionina. A los 60 minutos, 35 S radiomarcado metionina se añadió durante cinco minutos. Las bacterias fueron centrifugadas durante tres minutos y Laemli resuspendido en buffer de muestras [38]. Las muestras fueron sometidas a electroforesis, el gel se seca y expuesta a rayos X película noche a la mañana.

Anticuerpos y Western blot

Los anticuerpos se obtuvieron a lo descrito previamente [18]. Péptido mPR, correspondiente a la región entre 965-1085 residuos de la construcción y expresó con pTr-mPR se utilizó para la fabricación Ab-PR. Un antisuero (Ab-RTBV) también se planteó en contra de viriones purificados. Las proteínas fueron sometidas a electroforesis en SDS / PAGE, y transferidos a una membrana de nitrocelulosa. La mancha se incubaron con antisuero en una dilución 1:1000. Se detectaron proteínas inmunogénicas utilizando una fosfatasa alcalina de cabra anti-IgG de conejo en dilución 1:10000. Las proteínas se visualizaron en la presencia de nitroblue tetrazolium y 5-bromo-4-cloro-3-fosfato indoyl, o utilizando el sistema de detección de Biomax quimioluminiscente (Kodak / EE.UU.).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

PM llevó a cabo la elaboración de los cebos, la construcción de diversos plásmidos, el análisis de la expresión in vitro y experimentos pulso persecución etiquetado; ARM realizó el análisis de modelos estructurales; AdK analizaron diversas secuencias por ordenador; RNB y CMF fueron los investigadores principales. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias al Dr SBH Kent masa para realizar análisis espectral, y el doctor F. Mathieu-Daudé de lectura crítica del manuscrito. El trabajo se realizó en el The Scripps Research Institute en ILTAB (Laboratorio Internacional para la Biotecnología Agrícola Tropical).