Virology Journal, 2005; 2: 36-36 (más artículos en esta revista)

Amphotropic virus de la leucemia murina dotación de proteínas está asociada con el colesterol ricos en microdomains

BioMed Central
Christiane Cerveza (chb@mb.au.dk) [1], Lene Pedersen (lp@mb.au.dk) [2], Manfred Wirth (mwi@gbf.de) [1]
[1] Biotecnología Molecular, Centro de Investigación alemán de Biotecnología, FMB, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig, Alemania
[2] Instituto de Medicina Clínica y el Departamento de Biología Molecular de la Universidad de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

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Resumen
Antecedentes

Colesterol microdomains ricos en lípidos, como balsas fueron recientemente identificados como regiones dentro de la membrana plasmática, que desempeñan un importante papel en el montaje y en ciernes de los diferentes virus, por ejemplo, el virus del sarampión y el virus de inmunodeficiencia humana. Por asociación de estos virus de nueva síntesis de proteínas virales con balsas de lípidos se ha demostrado.

Resultados

Aquí nos proporcionan evidencia de la asociación de proteínas de la envoltura (Env) 4070A de la amphotropic de aislar el virus de la leucemia murina (A-MLV), con balsas de lípidos. El uso de la centrifugación y el gradiente de densidad de inmuno análisis, que muestran que Env co-localiza con el colesterol, gangliósido GM1 y caveolin-1 en estas regiones específicas de la membrana plasmática.

Conclusiones

Estos resultados muestran que una gran cantidad de A-MLV Env se asocia con balsas de lípidos y sugieren que el colesterol ricos en microdomains son utilizados como portales para la salida de la A-MLV.

Antecedentes

Microdomains ricos en colesterol, como balsas y caveolae son regiones especializadas de la membrana plasmática y desempeñar un papel importante para varios procesos celulares por ejemplo, la transducción de señales, y para el ciclo de vida de algunos virus (por ejemplo, la entrada y salida de pasos). Estos dominios son enriquecidas en colesterol, sphingomyelin, gangliósido GM1 y caveolin proteínas [1]. Las moléculas de colesterol están intercaladas entre las cadenas de lípidos acyl y causa una disminución de la fluidez de la membrana de estas regiones con miras a su resistencia contra el tratamiento con detergentes no iónicos como el Tritón X-100 a 4 ° C [1], por lo que estas regiones son También se refirió a como detergente resistentes microdomains (gestión de los derechos digitales). La composición de lípidos específicas de gestión de los derechos digitales lleva a la incorporación selectiva y la concentración de proteínas celulares específicas (revisado en [1]].

Recientemente, el sobre de proteínas (Env), de la ecotropic virus de la leucemia murina (MLV-E), así como de virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) se muestra a asociarse con gestión de los derechos digitales para el transporte después de la membrana plasmática [2, 3] . Del mismo modo, las proteínas Gag del VIH-1 prefiero gestión de los derechos digitales, como celulares destinos después de la síntesis en el citoplasma [4 - 6]. Como el VIH-1 y E-MLV yema de membrana plasmática regiones donde la cápside viral y sobre las proteínas se enriquecen [7, 8], el DRM de la asociación de las proteínas virales llevó directamente a la idea de que la gestión de los derechos digitales son las plataformas de montaje y la gemación (revisado En [9]].

Glicosil fosfatidilinositol (gpi) de anclaje y grasos acilación Se ha demostrado que las proteínas directamente a balsas de lípidos (revisado en [10, 11]]. La mutación del VIH-1 o E-Env MLV Env palmitoylation sitios [2, 3] o el VIH-1 Gag myristoylation sitio [4] alteración de la asociación de estas proteínas con la gestión de los derechos digitales. Además, sacude de Env palmitoylation sitios llevado a una disminución de título viral debido a la reducción de Env incorporación a las partículas virales [3].

Viral en ciernes de gestión de los derechos digitales debe llevar a una composición de la membrana viral, que se asemeja a la composición de lípidos de la gestión de los derechos digitales y difiere de la media de la distribución de los lípidos en la membrana plasmática [9]. Por ejemplo, el enriquecimiento de la membrana del VIH-1 con sphingomyelin colesterol y [12, 13], apoya firmemente un papel para la gestión de los derechos digitales en el VIH-1 en ciernes (revisado en [9]]. En un informe reciente, que demostró que un aumento de 1,4 veces el contenido de colesterol de la membrana plasmática de las células NIH3T3 traducido en una más de 3 veces mayor de colesterol de la membrana viral amphotropic MLV (A-MLV) que dejaron de estas células [14 ]. Sugerimos que este fenómeno podría ser debido a la participación de la gestión de los derechos digitales en el montaje y la gemación de A-MLV. Para abordar esta cuestión, hemos realizado aquí densidad gradiente de centrifugación, tinción inmuno y la co-localización de los experimentos con A-MLV Env expresando NIH3T3 y 293 células.

Resultados
Triton X-100 insolubilidad de la A-MLV Env

Para investigar la asociación de A-MLV Env con gradiente de densidad de gestión de los derechos digitales a través de centrifugación, 293T células fueron transfectadas transitoriamente con un plásmido pHIT derivados de la codificación de la A-MLV envoltura de proteína [15]. Además, la codificación de una mayor expresión de plásmidos proteína verde fluorescente (eGFP) (pEGFP-N1, Clontech) fueron transfectadas transitoriamente en células 293T y no utilizarse como marcador de gestión de derechos digitales. Cuarenta y ocho horas después de transfección, las células fueron tratadas durante 10 minutos con el 1% TX-100 a 4 ° C y los lisados de células resultantes fueron cargadas a los gradientes de densidad discontinua. Debido a la insolubilidad de gestión de los derechos digitales, la membrana de estas regiones, así como sus proteínas asociadas a flotar a la parte superior de la gradiente [16].

Confirmando la rutina de los experimentos de fraccionamiento, sin modificar eGFP, que se localiza en el citoplasma, se encuentran exclusivamente en las fracciones solubles 5 y 6 (fig. 1A]. Por lo tanto, estas fracciones fueron consideradas como detergente fracciones solubles. A-MLV Env predominantemente a flote a la DRM fracciones 2, 3, y 4. Las fracciones 5 y 6 que figuran antecedentes de señales de alto, en la que no A-MLV Env específicas banda podría ser detectado (Fig 1A].

Adicional fraccionamiento experimentos se realizaron con A-MLV producir células NIH3T3. Análisis de la resultante Dot Blots reveló que al menos el 60% de la proteína Env viral se localiza dentro de las fracciones insoluble en el detergente, cuando las células fueron tratadas con TX-100 a 4 ° C (Figura 1B y 1C]. Como antecedentes inespecíficos se encuentra sólo en detergente fracciones solubles (Figura 1A], la sobreestimación de la cantidad de asociados DRM A-MLV Env es poco probable. Además, TX-100 tratamiento de las células a 37 ° C disuelto balsas y reducido drásticamente el porcentaje de Env asociados con fracciones insoluble en el detergente (Fig. 1D]. En resumen, estos datos implican que una gran fracción de la A-MLV Env está localizado en gestión de los derechos digitales.

A-MLV Env exhibe propiedades de las proteínas asociadas con DRM

Para verificar A-MLV Env asociación con la gestión de los derechos digitales a nivel celular, un conjunto de inmuno experimentos se realizaron empleando DRM (caveolin-1 (cav-1)) y no DRM (CD71), marcadores. Además, la superficie de la célula del receptor de la toxina del cólera, la glycolipid GM1, se detectó con la etiqueta fluorescente subunidades de la toxina del cólera, lo que representa un método estándar de gestión de derechos digitales para la identificación [17]. Cav-1 es un componente principal de caveolae, que son en forma de matraz invaginaciones de la membrana plasmática que participan en los procesos de endocítica. Cav-1 también está presente en balsas de lípidos, que se cree que son los precursores de caveolae ( "pre-caveolae") [18]. El receptor de la transferrina (CD71) está localizada en clathrin revestidos piscinas o en otras regiones de la membrana plasmática, pero está ausente de la gestión de los derechos digitales [17, 19].

Wild-tipo A-MLV NIH3T3 liberación de las células cultivadas en cámara de diapositivas fueron lavadas con PBS o el 0,5%, TX-100 a 4 ° C, y posteriormente fijado a la superficie del cristal con paraformaldehído. Las células fueron tratadas con filipin, un colesterol vinculante tintes fluorescentes [20], y teñidas para el DRM marcadores GM1 y cav-1 FITC etiquetados utilizando la toxina del cólera o anti anticuerpo cav-1, respectivamente, y para CD71 utilizando un anticuerpo anti CD71 . A-MLV Env se detectó utilizando un anticuerpo anti-Env (83A25 [21]]. El relativamente leve TX-100 tratamiento era suficiente para dispersar CD71, que no está asociado con gestión de los derechos digitales, a lo largo de la membrana plasmática, mientras que el DRM marcadores GM1 y cav-1 y A-MLV Env permanecieron como puntos discretos (Fig 2A, comparar la izquierda Columnas y media).

En otro set-up, las células fueron tratadas durante 30 minutos con 5 mM metil-beta-ciclodextrina (MBCD) a 37 ° C y, posteriormente, con el 0,5% TX-100 a 4 ° C antes de paraformaldehído fijación y tinción inmuno (Fig . 2A, columna derecha). MDCB se conoce para extraer el colesterol de las membranas plasmáticas y es ampliamente usado para perturbar gestión de los derechos digitales [22]. Determinación enzimática de colesterol reveló que aproximadamente el 60% del colesterol fue retirado de la membrana plasmática a MBCD tratamiento (datos no presentados). Debido a la perturbación de la estructura de gestión de derechos digitales, un tratamiento combinado MBCD/TX-100 debería dar lugar a la dispersión de la gestión de los derechos digitales y de las proteínas concentradas en él. De hecho, el tratamiento combinado MBCD/TX-100 incluso dio lugar a la distribución de GM1, así como A-MLV Env fluorescencia en la membrana plasmática, mientras que cav-1 aún se detecta en puntos discretos en MBCD/TX-100 células tratadas (Fig. 2A , La columna de la derecha). Con respecto a la distribución en la membrana plasmática, la resistencia TX-100, y la extracción de MBCD, A-MLV Env exposiciones similares propiedades que el DRM marcador GM1 y distintas propiedades en comparación con CD71. Estos resultados están de acuerdo con los resultados obtenidos de densidad gradiente centrifugations que demuestra que A-MLV Env a un alto grado se asocia con la gestión de los derechos digitales.

A-MLV Env co-localiza con DRM marcadores

Finalmente, se realizaron estudios de co-localización de las proteínas Env con DRM inmuno marcadores en los experimentos. Una vez más, hemos utilizado una combinación de TX-100 y tratamiento inmuno coloraciones. Wild-tipo A-MLV NIH3T3 producción de las células cultivadas en cámara de diapositivas fueron lavadas con PBS o el 0,5%, TX-100 a 4 ° C, y posteriormente fijado a la superficie del cristal por paraformaldehído tratamiento. Las células fueron incubadas con filipin, un colesterol vinculante tintes fluorescentes [20], y DRM marcadores GM1 y cav-1 se detectaron utilizando FITC etiquetados contra la toxina del cólera o de anticuerpos cav-1, respectivamente. A-MLV Env se detectó utilizando un anticuerpo anti-Env (83A25 [21]]. Como se esperaba para una proteína asociada a DRM y de los resultados de los análisis de Dot Blot (Fig. 1B y 1C], aproximadamente el 50% de A-MLV Env co-localizada con lugares ricos en colesterol (Fig. 3A]. De acuerdo con el experimento muestra en la figura 2A, A-MLV Env no dispersarse en la membrana plasmática después de tratamiento TX-100 (Fig. 3A]. Además, la A-MLV Env también co-localizada con cav-1 y GM1 resultando en manchas amarillas en fusionada fotografías (Fig. 3B y 3C]. No co-localización se observó cuando las células fueron teñidas con A-MLV Env y de la no-DRM marcador CD71 (datos no presentados).

En su conjunto, los datos confirman que inmuno de la A-MLV Env en gran medida se asocia con la gestión de los derechos digitales.

Discusión

Una serie de investigaciones anteriores han mostrado que la membrana plasmática de las células animales es un conjunto heterogéneo de lípidos que contiene distintas bilayer ricos en colesterol micro-dominios, como gestión de los derechos digitales, que son responsables de una serie de funciones biológicas, por ejemplo, la concentración y la clasificación de las proteínas [1] . Una variedad de virus como el VIH-1 y virus del sarampión explotar gestión de los derechos digitales para su montaje y en ciernes [6, 23] después de asociación de ciertas proteínas estructurales con gestión de los derechos digitales.

Aquí nos muestran que la mayor parte de la membrana plasmática A-MLV Env se asocia con gestión de los derechos digitales. Utilizando métodos bioquímicos e inmuno encontramos que aproximadamente el 60-80% de la A-MLV Env está localizado en estos microdomains. De igual modo, Li et al. Han informado de que la dotación de proteínas estrechamente relacionadas del virus de la leucemia murina Moloney (MoMLV), que muestra un 62% de identidad a la A-MLV Env en el nivel de proteína [2, 24], se asocia con balsas. Similar a MoMLV Env, A-MLV Env no está completamente localizado en gestión de los derechos digitales. Esto no es raro que las proteínas asociadas a DRM-como se ha demostrado, por ejemplo, el VIH-1 p17 y gp41 [6].

La inmuno método utilizado aquí para la investigación de la asociación de gestión de derechos digitales de la A-MLV Env ha demostrado ser adecuada. Los marcadores para DRM (cav-1, GM1) y no DRM regiones (CD71) de la membrana plasmática exhiben las propiedades espera cuando las células fueron tratadas con el detergente no iónico TX-100. Estos experimentos mostraron que la A-MLV Env asemeja GM1 o cav-1 tras el tratamiento con TX-100. MBCD se conoce a disolver gestión de los derechos digitales a través de la extracción de colesterol de la membrana plasmática. Como se esperaba para una proteína asociada a DRM, el colesterol y la extracción posterior tratamiento de las células con TX GM1 dispersas-100 y A-MLV Env manchas en la membrana plasmática. En cambio, cav-1-positivas manchas aún detectable, incluso cuando estos se agotaron de colesterol (datos no presentados). Esto está de acuerdo con una investigación anterior que demuestra que sólo una cantidad insignificante de cav-1 podría ser liberado a través de MBCD tratamiento [22]. Probablemente, la resistencia MBCD de caveolin-spots se debe al hecho de que las proteínas caveolin construir una red de cerca de la cara luminal de la membrana plasmática [25]. Además, la A-MLV Env co-localiza con el DRM marcadores de colesterol, cav-1 y GM1 de confirmar que A-MLV Env a un alto grado se asocia con la gestión de los derechos digitales.

Retrovirus de reunión y de libertad es el único impulsado por el Gag poliproteínas virales [28], así como partículas de virus se forman en ausencia de otras proteínas virales o genoma. Dado que, el barrio espacial de las proteínas Gag y Env es un requisito previo para la liberación de las partículas virales funcional, la localización de la A-MLV Env dentro gestión de los derechos digitales puede ser indicativo de gemación viral de esas regiones. Este modelo está respaldado por el hecho de que un aumento de 1,4 veces el contenido de colesterol de la membrana plasmática de las células NIH3T3 traducido en una más de 3 veces mayor de colesterol de la membrana viral amphotropic MLV (A-MLV) que dejaron de estas células [14 ].

Nuestro hallazgo puede tener consecuencias para la comprensión de la A-MLV reunión y en ciernes, que es conocido por ser un proceso específico y coordinado. En el caso de A-MLV, datos anteriores indicaron que los componentes virales reunirse y yema en la membrana plasmática celular (revisado en [8]]. Recientes investigaciones de Sandrin et al., Sin embargo, demuestran intracelulares co-localización de la A-MLV Env MoMLV básico y proteínas en la vía endocítica a fines endosomes incluidos cuerpos multivesiculares (MVBs). Ellos sugieren que la interacción de MLV Env y básico en estas proteínas podrían influir en los compartimentos de virus de la formación de partículas [27]. De acuerdo a la creencia general de gestión de derechos digitales como microdomains ya están formados en el Golgi, y por lo tanto, es posible que A-MLV Env y proteínas básicas ya están ordenados intracelularmente en el mismo compartimento y transportado junto a la membrana plasmática.

Co-localización ha sugerido a ser suficiente para la incorporación de las proteínas celulares en viriones [26]. Desde cav-1 y A-MLV Env co-localizar en las células de ratón NIH3T3 putativo de la presencia de cav-1 en A-MLV viriones indicaría que A-MLV yemas de cav-1 que contiene gestión de los derechos digitales. Curiosamente, hemos encontrado que cav-1 está incorporado en A-MLV viriones, que no pudieron ser detectados CD71 (Beer y Wirth, datos no publicados). Sin embargo, si cav-1 juega un papel específico en la proteína viral clasificación a la membrana plasmática y virales de montaje está actualmente no se conoce, pero este tema es objeto de investigaciones en curso.

No obstante, sobre la base de las propiedades específicas de cada gestión de los derechos digitales, como balsas o caveolae, balsas parecen ser los más adecuados para el virus de reunión y de gemación. La invaginación de caveolae dentro de la membrana plasmática de las células, su participación en los procesos de endocítica y, además, su compacto escudo de caveolin-oligomeres [25] presumiblemente excluir caveolae como adecuados para las regiones virales en ciernes y sugerir balsas en ciernes como plataformas para la A-MLV .

Conclusiones

En conjunto, nuestros resultados proporcionan pruebas de que la A-MLV Env está localizado en gestión de los derechos digitales, de forma similar a la de la Env estrechamente relacionadas E-MLV [2, 26] y lentiviral VIH-1 Env [6] Estos resultados sugieren que son balsas en ciernes plataformas Para la A-MLV en células NIH3T3 y 293T.

Métodos
Células

NIH3T3 (ATCC CRL-1658) y 293T (ATCC CRL-11268) células fueron propagadas en MEDM complementada con glutamina y 10% de FCS. Hibridoma de células productoras de anticuerpos fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con glutamina 1% y ultra bajos de IgG FCS (Gibco). Todas las células fueron cultivadas a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad.

Plásmidos, transfección y ayudante virus enfoque

PMLVampho contiene el genoma completo de la A-MLV clonado en pBluescript (Genethon, Francia recibió a través de Páginas J.-C.). A-MLV producir células NIH3T3 resultado de transfección de pMLVampho [29] y una posterior infección de las células NIH3T3 con replicación competente-MLV-A.

Anticuerpos y la producción de anticuerpos

Hibridoma líneas celulares se utilizaron para la producción de rata monoclonal inmunoglobulina G (IgG) de anticuerpos contra MLV SU (83A25, amablemente prestada por LHEvans [21]]. Para concentrar los anticuerpos, la suspensión celular fue centrifugada a 2000 × g durante 10 minutos. 29,1 g por cada 100 ml ammoniumsulfat se añadieron el sobrenadante y agitados durante 1 hora a 4 ° C. Después de la centrifugación (27000 × g, 4 ° C, 1 h), el pellet se resuspendió en PBS y la solución de anticuerpos contra dializados PBS. Por Western blot y dot rata conejo anti IgG acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) (Sigma) se utilizó. Anticuerpo CD71 para ratón se adquirió de ebioscience y caveolin de BD Bioscience. Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugado de cabra anti IgG de rata se obtuvo de Sigma y Texas Red etiquetados de cabra anti IgG de conejo se adquirió de Calbiochem. Texas Red conjugado de cabra anti IgG de rata y FITC-conjugado de cabra anti IgG de conejo se obtuvieron de Jackson Immunoresearch.

Triton X-100 y la extracción de sacarosa gradiente

Para investigar la asociación de la A-MLV dotación de proteínas ricas en colesterol con microdomains, 293T células fueron transfectadas con cualquiera de las dos pEGFP-N1 (Clontech) o A-MLV Env codificación de los plásmidos [15] utilizando el método de precipitación de fosfato de calcio. 48 horas después de transfección, las células fueron lavadas con PBS × 1, 1 × superponerse con PBS y lavado de la superficie de cultivo de células matraz. Las células fueron pildoradas con 300 × g a 4 ° C y resuspendido en icecold 1 × PBS con 1% TritonX-100 y 1 mM Pefabloc (Sigma). Las células fueron incubadas 30 min en hielo y ajustado a un 40% de sacarosa o OptiPrep y cargados en SW60Ti-tubos. Las muestras fueron recubiertas con una discontinua o OptiPrep gradiente de sacarosa (35% - 5%). El gradiente se centrifuga a 4 ° C con 40000 rpm durante 20 h en un SW60Ti rotor. Seis fracciones se obtuvieron de la parte superior del tubo.

Un volumen igual de acetona se añadió a la fracción y se incuba a -20 ° C. Las proteínas se precipitaron pildoradas por centrifugación y secado a temperatura ambiente. El pellet se resuspendió en 1 × SDS gel de carga de amortiguación. Las fracciones fueron analizadas por sus egfp-N1 o A-MLV Env contenido de proteínas utilizando un 12% de gel de SDS y Western Blot. Gfp de anticuerpos Anti-se obtuvo de Abcam (AB290). A-MLV Env fue con los anticuerpos producidos por la línea celular de hibridoma 83A25.

Dot inmunoensayo

Para investigar la asociación de proteínas con los ricos en colesterol microdomains a través de Western Blot Dot o la extracción de TX-100 proteínas solubles se realizó como se describió anteriormente [6], con las modificaciones siguientes. NIH3T3 células fueron lavadas con PBS, superpuestos a 4 ° C en frío 0,5% Tritón X-100 en presencia de un cóctel de inhibidores de la proteasa (Pefabloc, Sigma) y suavemente sacudió a 4 ° C por 1 min. El sobrenadante fue removido y almacenado en hielo. El resto de las células se suspendieron en PBS y homogeneizado en un tubo de RiboLayser a 6000 rpm. La proteína soluble almacenados fracción se ajustó a 40% de sacarosa en TKM buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 25 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA) y cargados en SW40Ti-tubos. La muestra se superpone con el 35% al 5% de sacarosa (5% pasos). El gradiente se superpone con el homogeneizado de células de pellets. El gradiente se centrifuga a 4 ° C con 38000 rpm durante 20 h. Seis fracciones se obtuvieron de la parte superior del tubo. 100 μ l de cada fracción se diluye con 400 μ l de PBS, en los pozos llenos de un aparato Bio Dot (BioRad) y suavemente suctioned en membranas de nitrocelulosa (MilliPore). La membrana tiras fueron bloqueados durante 1 h con Tris-salina tamponada con 10% de suero de caballo y un 3% de la albúmina sérica bovina. Para detectar A-MLV dotación cav-1 y proteínas de la membrana se incubó durante la noche con anticuerpos contra las proteínas en el amortiguador de bloqueo en una 1:200 (Env) y 1:5000 (cav-1) dilución. La secundaria de anticuerpos, anti rata y conejo cabra anti conejo junto a la HRP, se utilizaron en una dilución 1:1000. El dot blots fueron desarrollados con TMB estabilizado sustrato para la HRP (Promega). El anuncio intensidades se cuantificaron utilizando Easy Win 32 (Herolab).

MBCD tratamiento

Para extraer el colesterol de la membrana plasmática celular células NIH3T3 se superpone con 5 mM metil-β-ciclodextrina (MBCD, Sigma). Después de sacudir ligeramente a 37 ° C durante 30 min, las células se utilizan para seguir el tratamiento con Triton X-100.

Immunofluorescent tinción

NIH3T3 células fueron sembradas en cámara de diapositivas (Nunc), y aumentó a 80% confluency. Después de lavar una vez con PBS, las células fueron recubiertas con 200 μ l de PBS o el 0,5% Tritón X-100 (4 ° C) y se incubaron durante 1 minuto a 4 ° C (agitando suavemente a las 8 rpm). Posteriormente, las células fueron inmediatamente superponerse con paraformaldehído al 4% y se incubaron durante 15 min a TA. Después de un lavado con PBS y bloqueando con Tris-salina tamponada con 10% de suero de caballo y un 3% de la albúmina sérica bovina anticuerpos contra A-MLV Env, y cav-1 se añadieron. Las células fueron recubiertas con anticuerpos secundarios después de un lavado con PBS. Después de un último paso de lavado con PBS las diapositivas fueron montadas con inmunofluorescencia medio de montaje (Dako).

Para los estudios de co-localización de las células fueron bloqueadas por segunda vez después de la incubación con el anticuerpo secundario y teñidas para GM1 FITC-conjugado con la toxina del cólera (Calbiochem, 8 μ g / ml), por el colesterol con filipin (Sigma, 50 μ g / ml) o Cav-1 como se ha descrito anteriormente.

Un microscopio de fluorescencia (Axiovert TV135, Zeiss; filtro establece: filipin - XF113, 387/450 nm (Em / Ex), FITC - 495/520 nm, Texas Red - 595/615 nm; Omega filtros) en el 1000 × magnificación se utilizó Para la detección de las proteínas teñidas. Las imágenes fueron tomadas usando una cámara CCD refrigerado (PXL 1400, Photometrics), digitalizadas, pseudo-color y fusionado (IPLab del espectro). El brillo y el contraste se ajustaron.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

CB concebido del estudio, llevado a cabo el trabajo experimental y ayudó a redactar el manuscrito. MW participado en el diseño del estudio, la supervisión de la conducción de los experimentos y redactó el manuscrito. LP ayudado con la coordinación y el diseño de los gradientes de densidad. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Parte de los trabajos presentados en este artículo se financiarán con cargo a la Academia Alemana de Científicos Leopoldina Naturales (BMBF LPD-9901/8-81) (CB) y la Fundación Lundbeck, la Fundación Novo Nordisk, el Consejo Danés de Investigaciones Médicas (Grant 22 -- 03-0254) (LP).