Virology Journal, 2005; 2: 38-38 (más artículos en esta revista)

El caveolae mediada sv40 vía de entrada salta el complejo de golgi en ruta hacia el retículo endoplasmático

BioMed Central
Leonard C Norkin (lnorkin@microbio.umass.edu) [1], Dmitry Kuksin (dkuksin@microbio.umass.edu) [1]
[1] Departamento de Microbiología de la Universidad de Massachusetts - Amherst, MA 01003, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Simian Virus 40 (SV40) entra en las células a través de un atípico caveolae mediada endocítica vía, que ofrece el virus a un nuevo intermediario compartimiento, la caveosome. El virus entonces se cree que vaya directamente desde el caveosome al retículo endoplasmático. La toxina del cólera también entra a través de caveolae y tráficos a caveosomes. Pero, en contraste con SV40, la toxina del cólera se transporta desde la caveosomes a través del retículo endoplasmático Golgi. Por ese motivo, y debido a que la caveosome y Golgi puede tener algunos marcadores comunes, que volvió a examinar la cuestión de si el SV40 podría tener acceso a través del retículo endoplasmático Golgi.

Resultados

Confirmamos nuestra anterior conclusión de que SV40 co se localizan con el marcador Golgi β-CP. Sin embargo, nos muestran que el virus no co localizar la más discriminante con marcadores de Golgi, golgin 97 y BODIPY-ceramida.

Conclusión

El caveolae mediada SV40 entrada vía no se entrecruzan el Golgi. SV40 es co visto a localizar con β-CP, ya que la proteína es un marcador para caveosomes así como el Golgi. Además, estos resultados son consistentes con la probabilidad de que la clasificación caveosome es un orgánulo. Además, hay por lo menos dos rutas distintas, pero relacionadas entre sí por el cual un ligando podría tráfico de la caveosome a la sala de emergencia, una de las rutas de transporte a través de la participación de Golgi, y otra vía que no implique la Golgi.

Antecedentes

Los virus comúnmente entrar en las células por endocitosis mediada por receptores, una vía de entrada de clathrin revestida de piscinas y vesículas derivados de los mismos. Estas vesículas de transporte en general, el virus de la endosomal / lisosomales compartimiento, en donde las condiciones ácidas de activación del genoma del virus de desmontaje y liberación [1].

A principios de los resultados experimentales demuestran que la vía de entrada para virus simiesco 40 (SV40) puede diferir de manera importante en el más común de la vía de entrada de virus. En primer lugar, SV40 infección resultó ser independiente de la baja del pH endosomal / lisosomales compartimento [2]. En segundo lugar, el microscopio electrónico de los estudios mostró que trafique SV40 entrar a la del retículo endoplasmático (ER), en lugar de a endosomes [3]. Más recientemente, SV40 fue mostrado para entrar en las células a través de caveolae, en lugar de fosos revestidos clathrin-[4, 5]. En efecto, estos fueron los primeros informes de un virus entrar en las células por medio de caveolae. Además, el SV40 es señal de entrada dependen de los productos básicos, en contraste con la endocitosis constitutivos de los virus que entran a través de clathrin revestida de las piscinas [6 - 8]. Por último, SV40 partículas desmontar en la sala de emergencia, en lugar de en la endosomal / lisosomales compartimento [9].

Caveolae son pequeños (70 a 100 nm) invaginaciones de la membrana plasmática, que se distinguen de clathrin revestida de las piscinas por su tamaño, distintivo frasco-como la forma, y la falta de una capa visible en las secciones delgadas. Expresión de la proteína caveolin-1 desencadena la formación de caveolae en microdomains de la membrana plasmática que se enriquecen en sphingolipids y colesterol, y que son conocidos como balsas de lípidos [10, 11]. El celular de caveolae funciones aún no están del todo claras, pero que han sido implicados en la organización de vías de transducción de señales, y en la clasificación y el tráfico a través de las vías endocítica y secretoras [12 - 14].

El tráfico de cualquier endocítica ligando de la membrana plasmática a la sala de emergencia es más excepcionales. Por lo tanto, es importante determinar la vía adoptada por SV40. La toxina del cólera (CT), siempre un precedente para una posible vía de entrada SV40, ya que anteriormente se había mostrado a través de caveolae entrar en las células, y también para el tráfico a la sala de emergencia [15].

Curiosamente, CT también puede entrar en las células a través de clathrin revestida de piscinas. Sin embargo, alterar farmacológicamente la clathrin mediada por vía de entrada tuvo poco efecto sobre los efectos tóxicos de la CT. En contraste, la inhibición selectiva de caveolae mediada por absorción impedido CT toxicidad [15]. Es importante destacar que la infección productiva SV40 también fue impedida por alterar farmacológicamente caveolae endocitosis mediada, pero no mediante el bloqueo de clathrin mediada entrada [4]. Estos resultados experimentales demuestran que un caveolae mediada vía de entrada, en lugar de un clathrin mediada vía, es la fisiológicamente relevante tanto para la toxina y SV40. Por otra parte, estos resultados también implican que la clathrin-revestidos a cielo mediada por la vía y caveolae mediada vía no se mezclan o se entrecruzan en cualquier momento.

Es importante destacar que, a través de la CT trafique Golgi en ruta a la sala de emergencia [16]. Transporte de la toxina desde el Golgi a la sala de emergencia está mediada por el Golgi-ER vía de la recuperación, que normalmente se recupera residentes ER proteínas que han escapado a la Golgi con el flujo anterógrado. En cambio, en lugar de la trata a la Golgi, SV40 fue visto al tráfico de un nuevo orgánulos, la caveosome. SV40 es luego transportado directamente de la caveosome a la sala de emergencia [17].

Poco se sabe sobre caveosomes. Contienen caveolin-1, pero no son ácidos, y que no contienen marcadores para endosomes, lisosomas, o la sala de emergencia. Es importante destacar que también caveosomes no contienen los marcadores de Golgi TGN46 o manosidasa II, lo que implica que son distintos de la Golgi [17].

Antes de que el informe SV40 tráfico a través de la ER caveosomes [17], que se lanzó a preguntar si SV40, al igual que la TC, tal vez el tráfico a la sala de emergencia a través del Golgi. Hemos seleccionado β-CP como nuestro Golgi marcador ya que esta proteína es más conocido como un componente de la COPI coatamer complejos que mediar en la recuperación de la vía retrógrada desde el Golgi a la sala de emergencia [18 - 21]. Se encontró que el SV40 de hecho co se localizan con β-CP antes de que entre la sala de emergencia. Sin embargo, a la luz del informe que SV40 tráfico a través de caveosomes, en lugar de a través de la Golgi [17], que interpreta nuestras conclusiones y reorientado nuestros experimentos posteriores de la siguiente manera.

En primer lugar, señalar que el reciclaje de la vía de Golgi a la sala de emergencia está mediado por la COPI coatamers que montamos en las membranas de Golgi [22 - 24]. Así, desde SV40, al igual que la TC, se transporta desde un compartimento a la sala de emergencia (de caveosomes en el caso del SV40, y desde el Golgi, en el caso de la TC), la hipótesis de que el SV40 vía de caveosomes a la sala de emergencia también podría Ser mediada por COPI coatamers. Esta premisa de cuentas tanto para la localización de co SV40 con β-CP [9], y los ataques del virus a la sala de emergencia.

Teniendo en cuenta lo anterior, nos pregunta si β-CP de hecho podría estar presente en caveosomes, y si podría mediar en el tráfico de caveosomes a la sala de emergencia. En primer lugar, hemos demostrado que la β-CP, de hecho, hace co localizar con caveolin-1 en un organelo que contiene entrada SV40. En segundo lugar, la localización de la cooperación simultánea con ambos SV40 β-CP y caveolin-1 es visto antes de que el virus aparece en la sala de emergencia [9]. Por lo tanto, la β-CP-intermedio que contiene orgánulos parece ser el caveosome [17]. En tercer lugar, y otros informaron que el transporte de SV40 de los orgánulos intermedia a la sala de emergencia está bloqueada por la droga brefeldin A, que inhibe específicamente el barrio de Ras-al igual que GTPasa ARF-1 que regula la asamblea de COPI escudo complejos [9, 25]. Tenga en cuenta que la TC transporte a la sala de emergencia también está bloqueada por brefeldin A, así como por microinjected anticuerpos contra β-CP [23, 26, 27]. Estos resultados experimentales confirman que de hecho SV40 tráficos a través de una caveolin-1-compartimiento que contiene, que es la más probable caveosome, en ruta a la sala de emergencia. Además, demuestran que la caveosome, al igual que el Golgi, está marcada por β-CP. Por último, la vía de la caveosome a la sala de emergencia, al igual que la vía retrógrada desde el Golgi a la sala de emergencia, depende de la asamblea de COPI escudo complejos [9].

Ahora, por varias razones, creemos que es importante volver a examinar la cuestión de si SV40 es transportado a la sala de emergencia a través del Golgi. Lo que es más importante, existe el precedente proporcionada por la TC para un caveolae mediada endocítica vía que accede a la sala de emergencia a través del Golgi. Este precedente se hace más apremiante en vista de la más reciente descubrimiento de que el tráfico a través de un CT caveolin-1-containing "endosomal" compartimento en su camino a la Golgi [16]. Además, el compartimento que puede muy bien ser idéntica a caveosomes, como lo demuestra el hecho de que cuando las células se les permite simultáneamente endocytose CT y SV40, estos ligandos se observan a co localizar en caveolin-1-positivas endosomes [16]. Sin embargo, la TC entonces tráficos a la Golgi en ruta a la sala de emergencia, mientras que SV40 se dice que el tráfico de caveosomes directamente a la sala de emergencia. Por último, en la mayoría de las células cultivadas caveolin-1 es visto en el Golgi, así como en la superficie de la célula.

En el presente estudio, tratamos de confirmar nuestra anterior conclusión de que SV40 co se localizan con β-CP [9]. Además, nos preguntamos si se localizan SV40 co estándar con dos marcadores de Golgi: golgin 97 y BODIPY-ceramida.

Resultados y Discusión

De acuerdo con nuestro informe anterior [9], de hecho, co SV40 localizados con β-CP en los tres puntos explorados (3, 5, y 10 horas), aunque co localización fue disminuida por 10 horas (Figura 1A, B, y 1C , 3 horas de la muestra se muestra). En cuanto a esta última observación, hemos demostrado anteriormente que SV40 aparece en la sala de emergencia entre cinco y diez horas, y la mayoría de los virus se encuentra en la sala de emergencia por 10 horas [9].

En contraste con la pronta localización de co SV40 con β-CP, en ningún momento se han visto SV40 localizar a los compañeros con marcadores de Golgi golgin 97 (Figura 1D, E, y 1F, 5 horas de la muestra se muestra) y BODIPY-ceramida (Figura 1G , H, y 1I, 3 horas muestra muestra).

El golgins en general están localizados Golgi las proteínas, que se caracteriza por una amplia estructura en espiral de la bobina en toda la molécula. El anti-humano golgin 97 anticuerpos monoclonales utilizados aquí reconocer una proteína de 97 kD denominada golgin 97, una proteína de membrana periférica que parece estar localizado exclusivamente en la cara citoplásmica de la Golgi [28]. La función exacta de golgin 97 no se conoce, aunque hay pruebas de que es posible actuar para regular el transporte entre endosomes y el Golgi [29]. Fluorescente análogos de la ceramida, como BODIPY-ceramida, se usan ampliamente como manchas selectivo para el Golgi [por ejemplo, [30]]. Se acumulan en este orgánulo, presumiblemente a causa de su papel en la biosíntesis de lípidos y de la trata de personas.

En efecto β-CP también se utiliza como marcador de Golgi. Se asocia preferentemente con los bordes laterales de la cis y medial Golgi cisternas, y las yemas y las vesículas se derivan de ellas. Sin embargo, β-CP no es totalmente específico para el Golgi, ya que también se asocia con endosomal vesículas dispersas por todo el citoplasma [31, 32]. Nuestra propia enérgicamente los últimos resultados experimentales implica que β-CP también se asocia con caveolin-1 que contienen caveosomes [9]. Basándose en el diferencial co localización de SV40 con β-CP, pero no con los marcadores de Golgi menos promiscuos, golgin 97 y BODIPY-ceramida, llegamos a la conclusión de que no SV40 tráfico a través del Golgi en ruta a la sala de emergencia.

Ambos SV40 y CT tráfico de la membrana plasmática a un compartimiento intermedio común, que parece ser el caveosome [16]. Desde entonces SV40 trafique directamente a la sala de emergencia, mientras que la TC es transportado a la primera Golgi, el compartimento caveosome parece tener la capacidad para ordenar sus diferentes cargas para el transporte a los diferentes destinos. ¿Cómo esta clasificación podría lograrse que queda por descubrir. Caveolin-1 no es probable que jueguen un papel en esta clasificación diferencial de SV40 y la TC, ya que las proteínas no de tráfico, ya sea con ligando a su próximo destino [16, 17]. Además, en las células que carecen de caveolin-1 de expresión y, por lo tanto, caveolae, SV40 entra a través de balsas de lípidos, y todavía tráficos a través de la ER neutral orgánulos que se asemejan a caveosomes, excepto que no contienen caveolin-1 [33].

La comprensión de los factores determinantes de estas vías atípicas tráfico es fundamentalmente importante, ya que prácticamente todos los ligandos de acogida que no son internalizados a través de clathrin revestida de las piscinas (por ejemplo, sphingolipids, GPI-vinculada proteínas) entre vía sphingolipid colesterol y enriquecida de dominios de la membrana, y por lo menos algunas de tráfico A un caveosome-como compartimiento, de las que luego se ordenan. Este clathrin de modo independiente de endocitosis probable estos ligandos permite el acceso a sitios que no se puede acceder a partir de la clathrin dependientes de la vía endocítica.

SV40 se une al complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I moléculas en la superficie celular [34, 35]. Sin embargo, las moléculas MHC de clase I no interiorizar con el virus [36]. Una interacción con el SV40 de gangliósido GM1 en la membrana plasmática recientemente se demostró que mejorará en gran medida la infectividad del virus [37]. Quizás SV40 usos GM1 como un co-receptor para entregar el virus en la célula. Curiosamente, varias toxinas bacterianas también para su uso gangliósidos receptores de la superficie celular. En particular, CT GM1 se une a través de su subunidad B, y que la interacción es necesaria para el transporte retrógrado a través de la CT de Golgi a la sala de emergencia [38]. Será interesante identificar los factores que determinan que SV40 toma una ruta directa de la caveosome a la sala de emergencia.

Conclusión

SV40 no de tráfico a través del Golgi en ruta desde la superficie de la célula a la sala de emergencia. Basándose en el informe actual y el anterior trabajo de los demás en relación con SV40 y la toxina del cólera [16], la caveosome parece ser un orgánulo poder clasificar sus diferentes cargas para el transporte a los diferentes destinos dentro de la célula. Además, hay por lo menos dos rutas distintas, pero relacionadas entre sí por el cual un ligando podría tráfico de la membrana plasmática al retículo endoplasmático, un transporte a través de la participación de Golgi, y los otros que no impliquen el Golgi.

Métodos
Los cultivos de células y de las infecciones

CV-1 células (de la American Type Culture Collection) Se sembró el 8 y Lab-Tek cámara de diapositivas (Nalge Nunc). SV40 fue adsorbido a las células durante 1 h a 4 ° C, a una multiplicidad de infección de 50 a 100 unidades formadoras de placa por célula. Culturas luego fueron incubadas a 37 ° C en medio Dulbecco modificado Eagle más el 10% de suero de ternera recién nacido (Atlanta Biológicos). A los 3, 5, y 10 horas después de la infección, las muestras se lavaron cinco veces en buffer fosfato salino-y fija con 70% de metanol a -20 ° C durante 10 min.

Inmunofluorescencia microscopía confocal

Inmunofluorescencia microscopía confocal se llevó a cabo utilizando un microscopio epifluorescence Nikon E600light. Un ORCA-ER refrigerado por cámara CCD (Hamamatsu) y OPENLAB software (Improvisación) se utilizaron para todos los de adquisición de imágenes y procesamiento. Primaria anticuerpos monoclonales anti-β-CP antisueros (Sigma), monoclonal anti-golgin 97 antisueros (Molecular Probes), y nuestro conejo anti-SV40 antisueros [9]. BODIPY (TR)-ceramida era de sondas moleculares. Secundaria anticuerpos fueron fluoresceína conjugado de cabra anti-conejo de inmunoglobulina G (IgG), Texas Red (TR)-conjugado de cabra anti-IgG de conejo, conjugado con fluoresceína burro IgG anti-ratón, y TR-burro conjugado anti-ratón IgG (Jackson Laboratories , West Grove, PA). Todos los antisueros se diluyeron 1:100.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

LN concebido y supervisado el estudio y redactó el manuscrito. DK llevado a cabo todos los trabajos experimentales y de adquisición de datos, tomando iniciativas importantes hacia esos fines. Ambos autores aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Servicio de Salud Pública de la subvención CA100479 del Instituto Nacional del Cáncer para LN.