Genome Biology, 2005; 6(3): R24-R24 (más artículos en esta revista)

Novela proteína G-junto-al igual que los receptores de proteínas en el hongo patógeno de plantas Magnaporthe grisea

BioMed Central
Resham D Kulkarni (resham@rti.org) [1], Michael R Thon (mthon@tamu.edu) [1], Huaqin Pan (hpan@unity.ncsu.edu) [1], Ralph A Dean (radean2 @ unidad . Ncsu.edu) [1]
[1] Fungal Genomics Laboratory, Center for Integrated Fungal Research, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695, USA
[2] Dirección actual: Programa de Bioinformática, Investigación División de Computación, RTI International, 3040 Cornwallis Road, Research Triangle Park, NC 27707, EE.UU.
[3] Programa de Biología de Filamentous Hongos, Departamento de Microbiología y Patología Vegetal, Texas A & M University, College Station, TX 77843, EE.UU.

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Resumen

Un análisis de la Magnaporthe grisea genoma y la comparación con otros hongos identificado homólogos de la proteína G-conocido junto-al igual que los receptores de las proteínas y una nueva clase de receptores GPCR-como en M. Grisea que son específicos de ascomycete hongos filamentosos.

Antecedentes

De células de la superficie del G-receptores acoplados a proteínas (GPCRs) obligar exógenos, así como ligandos endógenos, tales como los fotones, olores, lípidos, los nucleótidos, hormonas, feromonas, péptidos y proteínas. La interacción con estos ligandos unidades diversos procesos como photoreception, sabor y sensaciones olfativas en animales, hongos en el apareamiento y las comunicaciones célula-célula en el limo moldes [1 - 3]. Estos receptores se caracterizan por siete transmembrana α-hélices que al ligando vinculante relé de la señal por el logro de cambios conformacionales de las proteínas G obligado. El extracelular amino terminal en la mayoría de los casos interactúa con el ligando y el carboxilo terminal con las proteínas G. Las proteínas G, a su vez, activar diferentes vías de señalización, como las activadas por ciclasa adenylate y fosfolipasa C. Estos GPCRs son de enorme importancia ya que son los principales objetivos para el descubrimiento de medicamentos [4].

Un esquema de clasificación que abarca todos los GPCRs es el agrupamiento en clases AE [5]. AC son las principales clases presente en los animales: la clase A es la más grande y comprende la rhodopsin similares a los receptores, la clase B se compone de la secretina-al igual que los receptores de la clase C y metabotrópicos de glutamato / receptores de feromonas. Clase D es exclusiva para los hongos y los hongos se compone de receptores de feromonas. Clase E contiene cAMP receptores, como los receptores de la cAMP Dictyostelium. Otras clases incluyen frizzled / smoothened, adherencia y receptores de los insectos específicos de los receptores chemosensory [6, 7]. Secuencia GPCR conservación entre las clases es limitado, sin embargo, con cada uno de los receptores específicos de la clase que exhiben características identificables [6, 8]. La secretina y la adhesión de los receptores se caracterizan por residuos conservados de cisteína por conocidos o cisteína ricos dominios parecido a la del factor de crecimiento epidérmico (EGF) en su dominio amino termini.

GPCRs forman la familia más grande de los receptores de los animales, con más de 600 miembros en el genoma humano [9, 10]. Sólo un puñado de GPCRs han sido identificados en los genomas de hongos, sin embargo. En Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe sólo tres y cuatro receptores, respectivamente, están bien caracterizados [1, 11 - 16]. En la Neurospora crassa genoma de un total de 10 receptores se predice [17]. Un reciente informe de Aspergillus nidulans identificado GPCRs similar a la levadura de receptores de feromonas, la glucosa-sensing receptor GPR1, el hambre de detección de nitrógeno-STM1, y la Dictyostelium discoideum cAMP receptores [18]. Dada la prevalencia y la importancia de los GPCRs en eucariotas superiores, su relativa escasez en el reino Hongos justifican una investigación más a fondo. Para ver si podíamos encontrar familias adicionales, se realizaron búsquedas en el predicho proteoma de la piricularia hongo Magnaporthe grisea.

Los hongos patógenos de plantas M. Grisea es un poderoso sistema modelo para estudiar los determinantes de patogenicidad requeridos por las plantas para el reconocimiento de células de la superficie y la producción de un appressorium, requiere una estructura especializada para penetrar en la planta de superficie [19, 20]. El hongo provoca la enfermedad piricularia, la enfermedad más destructiva del arroz en todo el mundo. M. Grisea se presta a la manipulación genética molecular y objeto de gran escala en todo el genoma funcional de los estudios tras la reciente finalización de un proyecto de secuencia del genoma [21]. La infección comienza cuando un conidium, adjunto a la superficie de la planta, envía sucesivamente un germen tubo que diferencia a formar un gran melanized appressorium. Turgor presión en el interior de la appressorium resultados en una penetración hypha la violación de la pared celular y la invasión de los tejidos vegetales. Este programa de desarrollo, que va acompañado de una serie de cambios bioquímicos y de desarrollo, es el resultado de la percepción por el hongo ambiental adecuada y de la planta de células de la superficie y de señales de inducción de una cascada de señalización de las vías.

Receptores de la superficie celular que perciben señales en momentos críticos en el ciclo de vida de M. Grisea y otros hongos patógenos están fuertemente implicados como factores determinantes de patogenicidad. Señalización desempeña un papel fundamental en la formación y appressorium infección en M. Grisea. El AMPc dependiente de la respuesta y de feromonas, así como otros mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) -, y la fosfolipasa-calmodulina dependiente de las vías, son esenciales para la patogenicidad y pueden implicar la percepción de las señales a través de GPCRs [22 - 24]. Los tres identificaron la proteína G-alfa subunidades, que requieren los diferentes aspectos del desarrollo y la patogenicidad, tal percepción de las señales de transducción de las mencionadas vías [25]. El M. Grisea proteínas G, probablemente, recibir señales de los receptores como PTH11, una proteína de membrana integral necesaria para patogenicidad [26]. Como animal GPCRs son importantes objetivos para el descubrimiento de medicamentos, la identificación de los receptores de hongos sería igualmente importante para la comprensión y el control de M. Grisea y otros hongos patógenos.

La identificación de nuevas clases de GPCR es difícil debido a la escasa similitud de secuencias; incluso dentro de las categorías conexas, la secuencia de conservación se limita a la membrana-que abarca regiones [8]. También hay grandes variaciones en el tipo y el número de receptores en las clases que no muestran ninguna secuencia o semejanzas estructurales entre sí. Por lo tanto, lleva a cabo un análisis exhaustivo de la mina proteoma de la secuencia del genoma del arroz explosión hongo M. Grisea para GPCR-como las proteínas. Homólogos de los hongos conocidos GPCRs se encontraron en el M. Grisea proteoma, incluidos los receptores de feromonas STE2 y STE3 y de la glucosa-sensing receptor GPR1. En total, 76 GPCR-al igual que las proteínas son identificadas en el presente estudio, de los cuales 61 representan una gran novela clase relacionados con PTH11, un receptor implicado en el desarrollo de hongos y de la patogenicidad y la propuesta de actuar aguas arriba de la vía cAMP-dependiente. Muchas de estas nuevas funciones de los receptores se han conocido en las vías o pueden definir nuevas vías implicadas en el desarrollo de hongos.

Resultados
Identificación de nuevas clases de GPCR-al igual que en las proteínas M. Grisea

Se realizaron búsquedas en la M. Grisea proteoma de GPCR-como las proteínas en función de su similitud con los receptores conocidos. GPCR incluidas todas las secuencias presentes en la base de datos de GPCR (GPCRDB [5]] se utiliza como una consulta de búsqueda en un BLASTP en contra de la M. Grisea predijo proteína conjunto [21]. Las proteínas recuperadas en esta búsqueda se utilizaron para la BLAST M. Grisea proteínas de nuevo para encontrar las secuencias relacionadas con todos (Cuadro 1]. Un total de 14 GPCR-al igual que las proteínas se encontraron. Entre ellas figuraban homólogos de los GPCRs caracteriza por hongos (GPR1, STM1, y la STE2-y STE3-como receptores de feromonas). Otras proteínas identificadas eran similares a los receptores de AMPc y mPR, un receptor de esteroides. No homólogos de los animales rhodopsin-, la secretina-y metabotrópicos-como receptor de las clases, que constituyen la mayoría de las proteínas en GPCRDB, se podían encontrar. Todas las proteínas que aparecen en la tabla se revisaron para asegurarse de que tenía siete regiones transmembrana (archivo de datos adicional 1). El M. Grisea proteínas se realizaron búsquedas con InterProScan [27] y el 16 de las proteínas asociadas con InterPro entradas que contengan los términos' GPCR 'o' G-proteína unida receptores "fueron identificados. Cuatro ya habían sido señalados en el anterior BLAST búsquedas. De los 12 restantes, sólo uno (MG00532.4) tenía siete regiones transmembrana y fue añadido a la Tabla 1. Esta proteína ha débil similitud con ratas liberador de la hormona de crecimiento y el receptor del factor de otros GPCRs. Un PfamA HMM búsqueda reveló que algunas de las proteínas identificadas anteriormente había característica GPCR dominios (Tabla 1, y ver [28]].

El receptor PTH11 en M. Grisea se requiere para el desarrollo de la appressorium [26]. Se trata de una proteína de membrana integral y ha sido localizado en la membrana celular. Se propone actuar aguas arriba de la vía cAMP, que se requiere para la patogenicidad. El PTH11 amino-terminal contiene un dominio EGF-cisteína como rico dominio CFEM, predijo que se extracelular, seguido por siete transmembrana regiones [29]. Sobre la base de la topología transmembrana, con el amino-terminal y fuera de la carboxi-terminal dentro, PTH11 es una novela GPCR-como proteína. PTH11 se ha notificado a nueve regiones transmembrana, pero las dos regiones putativo transmembrana en el extremo amino-terminal se predijo la secuencia de señales y de la región hidrofóbica en el dominio extracelular CFEM, respectivamente, y, por consiguiente, no abarcan la membrana [26, 29 ]. La CFEM dominio es un dominio EGF-like, característica presente en la región extracelular de proteínas de membrana; PTH11 por lo tanto, se caracteriza por lo general un extracelular amino-terminal CFEM de dominio, seguido por siete regiones transmembrana. Una búsqueda usando BLASTP PTH11 consulta contra la conocida como M. Grisea proteínas recuperado una serie de proteínas con siete regiones transmembrana (E-valor de corte de 1e-09). A través de esta búsqueda BLASTP PTH11 relacionados con las proteínas contra M. Grisea predijo proteínas regresó miembros adicionales dentro de esta clase (total 61, Tabla 1]. Sólo un subconjunto de las proteínas contenidas recuperado el dominio CFEM, como se indica en el cuadro 1 (12 CFEM que contengan proteínas).

En total se identificaron 76 receptores, incluidos los miembros de las clases conocidas así como nuevas clases. Sesenta y un representaba una nueva clase que incluía PTH11. Todos los demás receptores identificados fueron asignados a diferentes clases sobre la base de su similitud con los receptores conocidos mediante BLASTP contra el GenBank (nonredundant) y Swiss-Prot bases de datos, y conserva sus características de dominio. Encontramos tres miembros de la clase y uno mPR (MG0532.4) con una débil similitud con los animales GPCRs. N los miembros de estas clases se ha informado anteriormente en hongos. Dentro de cada clase, los miembros fueron asignados a paralogous familias (Tabla 1]. Muchos de los genes en la Tabla 1 se expresan, como sugiere la representación en las etiquetas de secuencias expresadas o experimentos de microarrays. Una búsqueda BLAST en contra de la bases de datos GenBank EST reveló que algunos de los marcos de lectura abierta predijo (ORFs) había coincidencias en el M. Grisea EST (Tabla 1, y ver [30]]. Los resultados de los experimentos con microarrays de expresión génica en la germinación de conidios y appressorium formación también puso de manifiesto que muchos de estos ORFs se expresan (CT Mitchell y RAD, trabajo no publicado).

GPCR compartida y única-como en las clases de proteínas M. Grisea

M. grisea GPCRs se publicó en comparación con bases de datos de secuencia del genoma de hongos para identificar las proteínas que pertenecen a las mismas clases de GPCR. Un BLASTP de búsqueda contra el genoma de los hongos filamentosos estrechamente relacionados N. Crassa [17], utilizando todos los M. Grisea GPCR-como las proteínas, como la consulta, reveló la presencia de proteínas similares en N. Crassa, incluyendo PTH11 homólogos (Tabla 2 y adicional archivo de datos 2). No PTH11 homólogos se encuentran en S. Y S. cerevisiae Pombe. Además los análisis revelaron putativo homólogos de la clase mPR-1 en ambas levaduras, en la que no habían sido previamente identificados. Además, no se encontraron pruebas de cAMP receptor-ya sea como GPCRs en la levadura, a diferencia de las dos M. Grisea y N. Crassa. El cAMP, STM1, y mPR receptores son compartidos entre los hongos y otras especies eucariotas. Sin embargo, los receptores de feromonas por hongos (clase D) y GPR1 similares a los receptores parecen ser específicos de hongo.

Los miembros de la gran clase de PTH11 relacionados con los receptores se limita a un hongo subphylum. BLASTP PTH11 de todos los miembros de la clase, y PSI-BLAST utilizando regiones conservadas, contra el GenBank (nonredundant) y Swiss-Prot bases de datos a disposición del público y de los genomas de hongos recuperados en partidos miembros de la subphylum Pezizomycotina dentro de los Ascomycota, incluyendo Podospora anserina, Blumeria graminis , Fusarium graminearum y especies de Aspergillus. Otros hongos pertenecientes a la Ascomycota pero no a este subphylum, como S. Cerevisiae, S. Pombe, Candida albicans y Pneumocystis carinii carecían de PTH11 relacionados con las secuencias. Además, no PTH11 relacionados con secuencias fueron encontrados en los genomas de los Basidiomycetes Cryptococcus neoformans, Ustilago maydis y Phanerochaete chrysosporium. No se han encontrado coincidencias en vegetales, animales o procariótico genomas.

El análisis filogenético de PTH11 relacionados con GPCR-al igual que en las proteínas M. Grisea y N. Crassa

PTH11 relacionadas con los receptores de M. Grisea y N. Crassa se clasificaron en paralogous familias (adicional archivo de datos 2). También alguna que se orthologs entre estas dos especies. PTH11 relacionados con los receptores en M. Grisea y N. Crassa y otras secuencias de p. Anserina y B. Graminis fueron alineados para determinar las relaciones. La región contiene el conservadas PTH11-dominio se utilizó para construir un árbol filogenético (Figuras 1, 2a]. Nuestro análisis indica que PTH11 relacionados con las proteínas forman una gran familia de proteínas y divergentes que se desarrolló antes de la divergencia de M. Grisea y N. Crassa. M. Grisea y N. Crassa orthologs ocurrieron en el mismo clados (Figura 1]. Muchos diferentes clados en el árbol puede representar paralogous secuencias. El árbol apoya la putativo orthologs y paralogs hemos identificado (véase el archivo de datos adicionales 2). Aunque sólo el PTH11 de dominio se utilizó para construir el árbol (el amino-terminal de dominio CFEM visto en pocas proteínas no se incluyó), el 13 CFEM de dominio que contienen las proteínas se produjeron en un mismo clado, lo que indica que las secuencias están estrechamente relacionados. La filogenia también reveló que dentro de ciertos clados había una notable expansión de la PTH11 relacionados con las proteínas en M. Grisea en comparación con N. Crassa. Esto es particularmente notable para la CFEM de dominio que contienen proteínas. Hubo seis M. Grisea miembros que contiene el dominio CFEM en un paralogous familia (Tabla 1 y Figura 1, un total de 12 relacionadas con el CFEM y siete span proteínas), pero sólo uno de los N. Crassa. Hemos encontrado 38 PTH11 relacionados con las proteínas en A. Nidulans con un E-valor inferior a 1e-09. Además de la caracterización de estas proteínas será necesaria para definir el número de siete span PTH11 relacionados con las proteínas en este genoma. El análisis preliminar muestra que sólo dos de siete span proteínas contienen el dominio CFEM en A. Nidulans. Estas observaciones representan la expansión, ya sea desde la especiación de la CFEM contienen PTH11 familiares en M. Grisea, o la pérdida de estas proteínas en las otras especies de hongos.

Nuevo dominio de las firmas según la definición de regiones conservadas homóloga en clases de receptores identificados

Los miembros de cada clase de M. Grisea GPCR proteínas-como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, cAMP-, STM1-como, PTH11 relacionados con los receptores, los dominios que se han conservado dentro de cada clase. Secuencia alineaciones de la BLASTP búsquedas específicas de las regiones reveló que contengan residuos compartida para cada uno de estos tipos de receptores. La Figura 2 muestra una alineación de algunas de las secuencias que pertenecen a clases distintas de las mejor estudiadas de feromonas y los receptores sensibles a la glucosa. En todos los PTH11 relacionados con miembros de la región hacia el amino terminal se conserva (Figura 2a, PTH11_dom). El extremo amino-terminal y la carboxi-terminal de las secuencias de acompañamiento esta región fueron divergentes. Residuos conservados que se produjo en el lapso de siete para todas las regiones de estas proteínas. Esto está en consonancia con otras observaciones que la secuencia de conservación se limita normalmente a las regiones transmembrana en GPCRs. El M. Grisea MG06738.4 proteína, que tiene similitud con los receptores de cAMP, compartido conservan residuos de aminoácidos entre las posiciones 81-179 con MG06797.4, MG00326.4, MG06257.4, relacionados N. Crassa proteínas y otros receptores de cAMP (cAMP_dom, Figura 2b]. Otras proteínas - MG00258.4 y MG10544.4 - con una débil similitud con los receptores de cAMP también comparte residuos dentro de este dominio (datos no presentados). MG04698.4 compartida entre dos dominios residuos de aminoácidos 22-101 y 244-327 con STM1, MG02855.4 y de las proteínas relacionadas con diferentes especies eucariotas (stm1_dom, la figura 2c]. MG05072.4 compartida residuos en la región de 56-277 con MG09091.4 (residuos 18-228), MG04679.4 (residuos 260-497) y otras proteínas que se recuperaron en la búsqueda BLAST, incluidos los receptores mPR (mPR_dom, la figura 2d].

Las proteínas que contienen la PFAM GPCR dominios se indica en la Tabla 1. Cabe señalar que los bajos puntajes de la PFAM dominios que hemos observado puede deberse a la necesidad de actualizar estas alineaciones de dominio añadiendo muchas nuevas proteínas, incluidas las que hemos descubierto. Por ejemplo, contiene una MG06452.4 putativo STE3 dominio, la alineación Resultado (E-valor) es bajo, sin embargo. Con el nuevo ser secuenciado los genomas de hongos, más STE3 homólogo secuencias están disponibles y la inclusión de estos en la definición de la alineación de semillas STE3 dominio hará que el dominio más representativo de hongos STE3 dominios.

Cada clase de los receptores de contenidos específicos regiones conservadas dentro de la membrana de la topología que abarca. Un ejemplo representativo de cada clase, que muestra la ubicación de la región conservada en la topología de la membrana se ilustra en la Figura 3. Por hongo de receptores específicos, la conserva de dominio abarcó casi toda la longitud de las siete regiones transmembrana. Cuando otros eucariotas receptores fueron incluidos en la clase, sin embargo, sólo se conserva más corto dominios fueron discernir. Estos residuos conservados que puede reflejar las limitaciones funcionales y pueden ser de gran valor para el estudio de las relaciones estructura-función de estas proteínas.

Discusión
Distintas clases de GPCR-como las proteínas identificadas en M. Grisea

Hongos responder a una variedad de señales desde el medio ambiente que regulan el metabolismo celular y el desarrollo, así como la interacción huésped-patógeno. Receptores de la superficie celular percibir estas señales y relés a las vías de señalización intracelular. Se realizaron búsquedas en el proteoma de M. Grisea para GPCR-como las proteínas y se determinaron un total de 76 secuencias (Tabla 1]. Este es el mayor número de GPCR candidatos identificados para cualquier especie de hongos. Las proteínas identificadas en M. Grisea incluir homólogos de los receptores conocidos de hongos y algunos otros receptores eucarióticas. Orthologs putativo de hongos-STE2 y STE3-como receptores de feromonas necesarias para el apareamiento respuestas en la levadura se identificaron. Un homólogo de GPR1, que participa en la diferenciación en S. pseudohyphal Cerevisiae, y dos proteínas que comparten similitudes con STM1 de S. Pombe También se encontraron [11, 13, 16]. Seis proteínas comparte similitudes con los receptores de cAMP Dictyostelium. En la Dictyostelium cAMP receptores están implicados en el establecimiento de polaridad durante la quimiotaxis [3]. Todo lo anterior M. Grisea proteínas puede ser anotada como putativo GPCRs sobre la base de la homología de conocer a los receptores. Es probable que respondan a ligandos similares, tales como feromonas, los nutrientes y cAMP (Tabla 1]. Respuesta a hongos apareamiento feromonas y la existencia de receptores de feromonas en M. Grisea fue sugerida por la observación de que M. Grisea respondió a S. Cerevisiae feromonas en un apareamiento de tipo manera específica [22]. AMPc intracelular, producida por adenylate ciclasa, es un factor crítico de desarrollo en la regulación de appressorium M. Grisea. Lee y Dean han encontrado que el hongo responderá a cAMP exógena añadido por el desarrollo de appressoria, aunque las concentraciones requeridas son altas [31]. Señalaron que la pared celular y la membrana celular es relativamente impermeable a AMPc, y por lo tanto cualquier respuesta a cAMP extracelular se debe a los receptores de cAMP. Investigación adicional será necesario para obtener más información sobre el mecanismo de percepción de AMPc exógeno y otros ligandos y sus objetivos dentro de la célula.

PTH11 relacionados con las proteínas comparten una serie de características de diagnóstico de los GPCRs y definir una nueva clase de GPCR-como las proteínas. La topología de la membrana predijo sugiere un lapso de siete proteínas con un amino terminal fuera de la célula, que podría responder a señales extracelulares, y una citoplásmica dominio carboxi-terminal que puedan interactuar con las proteínas G. Todos los relacionados con las proteínas PTH11 compartida residuos conservados dentro de la membrana que se extiende, como se observa en otros GPCRs clases [8]. Una subclase de los receptores PTH11 mostró otra característica que se observa en algunas clases de GPCRs humanos: tienen un amino-terminal rica en cisteína EGF-like CFEM dominio. El animal secretina receptores se caracterizan por seis cysteines conservadas en el amino terminal, con cisteína implicados en los puentes ligando vinculante. Algunos de los receptores de adherencia han cisteína ricos-EGF-como en sus dominios amino termini [6, 8]. CFEM de dominio que contienen proteínas, que son más pequeños en tamaño y carecen de las siete regiones transmembrana, pueden interaccionar con la CFEM que contienen proteínas similares a GPCR (archivo de datos adicionales 3 y [29]]. La CFEM que contienen proteínas con un péptido de señal y / o un glycosylphosphatidylinositol (GPI) de anclaje. Por lo tanto los mismos son secretados de la célula o anclados a la membrana celular. Ellos pueden ser similares a las proteínas que unen olor, que también han cisteína-ricos y los dominios que se han propuesto para interactuar con olor-GPCRs [32].

Unique clases de hongos proteína G-junto con los receptores antiguos orígenes

Habiendo divergencia de aproximadamente 1460 millones de años (Mya) [33], es evidente que los hongos tienen clases de GPCRs que son distintos de los de los animales. La clase D de hongos receptores de feromonas definir un hongo-clase específica de los receptores. Hemos encontrado la GPR1 similares a los receptores a ser también de hongos específicos. Clases de receptores específicos de un grupo de especies también se producen en los animales. Por ejemplo, algunos de los GPCRs en Anopheles gambiae insectos constituyen una clase específica de los receptores chemosensory [7]. Los insectos se estima que se han ido distanciando de los otros animales cerca de 1000 Mya. Por lo tanto, podríamos esperar encontrar nuevos hongos GPCRs con similitudes a los no presentes en otros reinos eucarióticos. El más grande de la clase M. Grisea GPCR-al igual que las proteínas que hemos identificado es la novela PTH11 relacionados con la clase. Es interesante que sólo encontramos en PTH11 homólogos de los hongos pertenecientes a subphylum Pezizomycotina dentro de la Ascomycota (este subphylum tiene un estimado de divergencia Mya fecha de 1140). Ninguno se encuentra en los hongos pertenecientes a otros o subphyla en Ascomycota Basidiomycota, estima que se han ido distanciando el uno del otro Mya 1210. Esto indica que estas proteínas son de origen muy antiguo, posiblemente de haber evolucionado para servir a funciones especializadas en un subgrupo específico de los hongos. Ellos son únicas para este grupo de hongos o han evolucionado lo suficiente como para ser irreconocible.

Relaciones entre la PTH11 relacionadas con proteínas

El PTH11 relacionados con las proteínas forman una gran familia de proteínas y divergentes, como lo sugiere la similitud entre las proteínas y el árbol filogenético (Tabla 1, Figura 1]. Esta familia de genes pueden haber evolucionado antes de la divergencia de M. Grisea y N. Crassa. Hay algunos orthologs entre estas especies, sin embargo, es evidente que esta familia ha experimentado una considerable expansión en M. Grisea en comparación con N. Crassa, con el mayor subclase en M. Grisea ser el CFEM que contienen proteínas. Muchos de los genes relacionados con el PTH11 se encuentran cerca unos de otros sobre el genoma (datos no presentados), mientras que ninguno de los otros GPCR-como las proteínas, con excepción de un par de AMPc de las proteínas relacionadas con el receptor, se produce en las proximidades. Un par paralogous, MG07553.4 y MG07565.4, se produce una estrecha vinculación juntos en el grupo III, lo que indica que estos genes pueden haber surgido como resultado de la duplicación. Nos atacó a estas secuencias de unos contra otros y observó que muestran un 30% de identidad con un valor de E-7e-54. Esto sugiere que, incluso si estos genes son el resultado de la duplicación, que se han ido distanciando y no están suficientemente incorrecta duplicación de las predicciones de la misma debido a la secuenciación de genes o errores de montaje. Ambos genes contienen la CFEM dominio y también se producen en el mismo clado en el árbol filogenético (Figura 1]. Otro par de CFEM que contienen proteínas se encuentra en las proximidades (LGI, grupo 1). Los ejemplos anteriores de relativa expansión en el PTH11 relacionados con las proteínas, en comparación con N. Crassa, son una indicación de que la duplicación de genes aún puede estar ocurriendo en M. Grisea. En N. Crassa se cree que a causa del fenómeno de la repetición inducida por mutaciones puntuales (RIP), las duplicaciones de genes no se mantiene [17]. Hay pruebas de RIP en M. Grisea, pero el presente estudio es un ejemplo de que el PRI ha escapado proceso [34]. Otras posibilidades son que estos genes duplicados antes de la evolución de RIP o han escapado porque RIP M. Grisea rara vez se someten a la meiosis en la naturaleza.

Reglamento de la actividad de los GPCR-como la expresión diferencial de proteínas y la interacción con diferentes señal transductores

Expresión diferencial y la interacción con diferentes transductores de la señal podría ser una forma de regular las vías de señalización específica. Los resultados de todo el genoma microarrays experimentos sugieren diferentes patrones de expresión de los receptores GPCR-como durante el crecimiento y el desarrollo (CT Mitchell y RAD, trabajo no publicado). Representación de algunos de los GPCR similares a los receptores de los hongos en las tecnologías ecológicamente racionales y experimentos de microarrays sugiere que la mayoría de estos genes se expresan (Tabla 1]. Además de la regulación diferencial de los GPCR-como las proteínas, su interacción con las proteínas G diferentes canal podría diversas señales a los diferentes itinerarios. Así como el bien estudiado las interacciones con las proteínas G, se ha propuesto que el lapso de siete receptores pueden también interactuar con otros transductores de la señal del receptor y la interacción de las proteínas de transmitir la señal a las diferentes vías celulares.

Conclusión

El número de clases de GPCR-como las proteínas identificadas en el presente estudio es el más grande en los hongos. Adicional a la investigación sobre estos receptores ayudará a delinear posibles vías de señalización novela con la que interactúan. La nueva clase de PTH11 relacionados con receptores específicos a un Ascomycota subphylum y relativamente numerosos en M. Grisea, es particularmente interesante. PTH11 es una proteína de membrana localizado en la membrana celular y es necesario para la patogenicidad [26]. Se propone actuar aguas arriba de la vía cAMP como un receptor de señales de los canales que a esta vía. PTH11 no tiene una ortholog en N. Crassa. También, como se ha discutido anteriormente, sólo uno CFEM contienen siete span proteína está presente en N. Crassa en comparación con el 12, incluyendo PTH11, en M. Grisea. Queda por determinar si otros miembros de esta clase de PTH11 ampliado relacionados con las proteínas están involucradas en los diferentes aspectos de patogenicidad. El subphylum Pezizomycotina incluye a la mayoría de las especies conocidas ascomycete, e incluye a los agentes patógenos y mutualistas. Porque PTH11 relacionados con GPCR-al igual que las proteínas están presentes en la no patógenos, muchos de los miembros de esta clase es probable que participen en las funciones no relacionadas con patogénesis. Todos los siete span receptores y su carácter de dominio firmas descubrimos (Figuras 2, 3] será importante en la identificación y estudios comparativos de los nuevos receptores en la que muchos hongos genomas secuenciados.

Materiales y métodos
GPCR-Identificación de las proteínas como en Magnaporthe grisea

GPCR secuencias conocidas, entre ellos los presentes en el GPCRDB [5], se prevé la BLASTed contra M. Grisea proteoma para identificar homólogos en M. Grisea [21]. La base de datos que contiene las secuencias de 7900 GPCR (actualizado 28 de mayo de 2003) se utilizó como una consulta de búsqueda en un BLASTP en contra de la M. Grisea predijo proteínas con un E-valor límite de 1e-09. Los resultados de una exploración de la InterPro M. Grisea proteínas en busca de dominios que contengan los siguientes términos: «GPCR" y "G-proteína-los receptores acoplados" [27]. M. Grisea PTH11, un GPCR-como las proteínas (ver resultados), se utilizó también en una búsqueda contra el BLASTP M. Grisea proteoma. BLAST y PfamA búsquedas relacionadas con el análisis de secuencias y se hace usando Genomax (Informax (ahora Invitrogen)).

Caracterización de los GPCR-como las proteínas y la identificación de los miembros adicionales en M. Grisea y otros hongos

GPCR-al igual que las secuencias fueron evaluados durante siete regiones transmembrana por TMPRED, Phobius y TMHMM [35 - 37]. Los ajustes predeterminados se utilizaron. En casi todos los casos al menos dos de los algoritmos de predecir el lapso de siete hélice topología (archivo de datos adicional 1). Un BLASTP búsqueda usando el lapso de siete secuencias del polipéptido como la consulta contra la M. Grisea conjunto de proteínas también se hace para identificar los miembros de cualquier otro similar. El conjunto de siete span identificado proteínas fue entonces objeto de análisis BLASTP contra GenBank y Swiss-Prot para confirmar secuencia similar a GPCRs. Este ejercicio también permitió la identificación de otros miembros que eran similares a esas secuencias. El M. Grisea siete span proteínas identificadas como anteriormente se utilizaron como una consulta en una búsqueda BLAST en contra de la N. Crassa predijo proteínas [17] para identificar homólogos. El M. Grisea y N. Crassa proteínas fueron colocados en grupos utilizando el programa blastclust [38]. Todos M. Grisea y N. Crassa proteínas de los que había al menos un 30% de identidad y un 80% se superponen a lo largo de las proteínas se agrupan. Los miembros de la misma especie dentro de un grupo se consideraron paralogs. Orthologs se definieron como las proteínas que había bidireccional mejor BLAST hits. TBLASTN Una búsqueda usando las siete span contiene secuencias como la consulta contra la base de datos GenBank EST se realizó para identificar cualquier idénticos partidos en el M. Grisea EST (u otras estrechamente relacionadas con las secuencias de los hongos). El GPCR-al igual que las secuencias identificadas en M. Grisea fueron utilizados como consulta en BLASTP búsquedas (punto de corte <1e-09) en contra de la S. Y S. cerevisiae Pombe genomas y otros completamente secuenciado los genomas de hongos para identificar putativo homólogos en estas especies.

Alineaciones y relaciones filogenéticas entre las secuencias predijo GPCR

La alineación de secuencias relacionadas dentro de las clases en la Figura 2 se hizo utilizando T_Coffee y de los menores de edición como por el resultado de la BLAST alineaciones se hizo utilizando GenDoc [39]. Para el análisis filogenético, la conserva-PTH11 dominio que se extiende por la membrana-que abarca las regiones se utilizó. Secuencias fueron alineadas usando ClustalW versión 1,81 [40]. El árbol filogenético fue construido usando PAUP por tanto vecino de unirse y parsimonia seguido de los métodos de análisis de arranque (100 repeticiones de arranque). Un árbol también fue construido con el vecino a participar en el método aplicado en el paquete de software MEGA 2,1 [41]. Todos los métodos muestran relaciones similares entre las proteínas.

Adicional de los archivos de datos

Los siguientes datos adicionales está disponible con la versión en línea de este trabajo: archivo de datos adicionales 1 es un cuadro sinóptico con M. Grisea-GPCR-como las proteínas y los números de la adhesión de siete span predicciones; adicional archivo de datos 2 es un cuadro sinóptico con M. Grisea-GPCR-como clases de proteínas y N. crassa homólogos; adicional archivo de datos 3 es una tabla M. Grisea CFEM que contienen proteínas de membrana que pueden ser asociados o secretada.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
M. grisea
- GPCR-como las proteínas y los números de la adhesión de siete span predicción.
Archivo Adicional 2
M. grisea
- GPCR-como las clases y de la proteína N.
Crassa
Homólogos.
Archivo Adicional 3
M. grisea
CFEM que contienen proteínas de membrana que pueden ser asociados o secretada.
Agradecimientos

Damos las gracias a Hemant Kelkar, Centro de Bioinformática de la Universidad de Carolina del Norte, de proporcionar comentarios útiles, y los miembros del Laboratorio de Genómica de hongos valiosas discusiones. La investigación recibió el apoyo de los fondos procedentes de los Estados Unidos Departamento de Agricultura (premio 2001-52100-11317) y la Fundación Nacional para la Ciencia (premio 0.136.064). Agradecemos a otras comunidades de investigación de hongos, especialmente Aspergillus nidulans investigadores, por darnos acceso a la secuencia del genoma de datos no publicados.