Genome Biology, 2005; 6(3): R26-R26 (más artículos en esta revista)

El 'permeome' del parásito de la malaria: una visión general de las proteínas de transporte de membrana Plasmodium falciparum

BioMed Central
Rowena E Martin (Rowena.Martin @ anu.edu.au) [1], I Roselani Henry (Lani.Henry @ anu.edu.au) [1], Janice L Abbey (Janice.Abbey @ anu.edu.au) [1], John Clements D (John.Clements @ anu.edu.au) [1], Kiaran Kirk (Kiaran.Kirk @ anu.edu.au) [1]
[1] School of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science, The Australian National University, Canberra, ACT 0200, Australia
[2] Division of Neuroscience, The John Curtin School of Medical Research, The Australian National University, Canberra, ACT 0200, Australia

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Resumen

Análisis bioinformáticas y de expresión atributo putativo funciones a los transportistas y los canales codificados por el genoma de Plasmodium falciparum. El parásito de la malaria ha más proteínas de transporte de membrana que se había pensado anteriormente.

Antecedentes

El parásito de la malaria (Plasmodium género) es un eukaryote unicelulares que, en el curso de su complejo ciclo de vida, invade los eritrocitos de los vertebrados su anfitrión. Es intraeritrocitaria esta fase del ciclo de vida del parásito que da lugar a todos los síntomas de la malaria, una enfermedad que se estima que se dé lugar a casi 5 millones de episodios de la enfermedad clínica y de hasta 3 millones de muertes por año [1]. Plasmodium falciparum, La más virulenta de los parásitos de la malaria que infectan a los seres humanos, ha desarrollado resistencia a la mayoría de los medicamentos antimaláricos actualmente disponibles. Existe una necesidad urgente para el desarrollo de nuevas estrategias de los medicamentos antimaláricos, y para una mejor comprensión de los mecanismos que sustentan el parásito de la capacidad de desarrollar resistencia a los antimaláricos.

Proteínas de transporte de membrana son proteínas integrales de membrana que median la translocación de iones y moléculas a través de membranas biológicas. Además, presta servicios a una amplia gama de importantes funciones fisiológicas, incluyendo la absorción de nutrientes a las células, la eliminación de productos de desecho metabólico no deseados y xenobióticos (incluidos los medicamentos), y la generación y mantenimiento de los gradientes transmembrana electroquímica. Estas proteínas juegan un papel clave en el crecimiento y la reproducción del parásito, así como en el fenómeno de la resistencia a los medicamentos antimaláricos. Pero a pesar de esto, y pese a que las proteínas de transporte de membrana han demostrado ser sumamente eficaces objetivos farmacológicos en otros sistemas [2], pero todos algunas de las proteínas de transporte de membrana del parásito de la malaria siguen siendo muy mal entendido, y su potencial como antipalúdicos Metas de drogas sigue siendo en gran parte inexplorado [2].

El 'permeome' es un término que se usa aquí para describir el total de proteínas implicadas en la permeabilidad de la membrana en un determinado organismo. Abarca toda la gama de canales codificados y de los transportistas en el genoma. La anotación original de la p. Falciparum genoma, publicado a finales de 2002, determinaron "un repertorio muy limitado de transportadores de membrana, en particular para la absorción de nutrientes orgánicos" y "no claro homólogos de los eucarióticos sodio, el potasio o cloruro de canales de iones" [3]. Es discutible, sin embargo, si esto corresponde a una verdadera escasez de esas proteínas en este organismo, o simplemente deficiencias en la anotación.

A pesar de las mejoras en la anotación automática de genes, es ampliamente aceptado que las rutinas involucradas proporcionar una primera fase de anotación y que el logro de una anotación de alta calidad requiere de la intervención manual de curación (revisado en [4]]. Errores que son difíciles de evitar en los sistemas automatizados para la anotación del genoma incluye la incorrecta predicción de intrón / exón fronteras y la posición de inicio / parada codones, que puede dar lugar a proteínas incompletas o truncadas, o la fusión de las proteínas vecinos [5, 6 ]. La asignación funcional de las anotaciones a las proteínas se ve obstaculizado por varios factores [7], incluida la no utilización de las anotaciones críticas de las actuales entradas de la base de datos, haciendo caso omiso de multidominio organización de la consulta de proteínas y / o de la base de datos de visitas, y, en el caso de P . Falciparum, la gran divergencia que existe en general entre el parásito y de los organismos para los que la secuencia de datos está disponible en las bases de datos [3]. Manual de curación ofrece una mayor flexibilidad en el manejo de estos problemas.

Para muchas de las proteínas codificadas por predijo p. Falciparum a la similitud de sus más cercanos Plasmodium homólogos no es suficiente para permitir la anotación sobre la base de búsquedas BLAST solo. Como se destaca en una reciente revisión de la situación actual del proyecto del genoma del parásito del paludismo [8], la anotación de estas proteínas requiere de una evaluación en profundidad por un curador manual usando una variedad de enfoques bioinformáticas [7], incluida la posición específica reiteró BLAST (PSI-BLAST), la detección de los dominios se conserva, la construcción de múltiples secuencia de alineaciones y comparaciones de predecir la estructura secundaria. Este proceso es laborioso y de mucho tiempo, sino por la combinación de la información obtenida de estos análisis, es posible llegar a las anotaciones y fiable para obtener una idea de la importante función de las proteínas de interés.

En el presente trabajo se informe de los resultados de un análisis detallado de la permeome de p. Falciparum. El estudio hace uso de un programa informático que registre a una base de datos del genoma sobre la base de la hydropathy parcelas de las correspondientes proteínas [9]. El enfoque se basa en la observación de que los polipéptidos compuesto transportador proteínas hidrofóbicas suelen poseer múltiples dominios transmembrana (TMDs) y la conexión de hidrófilo, extra-membrana bucles que se detectan como puntos máximos y mínimos, respectivamente, en una parcela de la hidrofobicidad índice del polipéptido . Muchos transportistas han caracterizado hasta la fecha entre ocho y 14 TMDs [10]. En la búsqueda de nuevos candidatos transportistas, la p. Falciparum genoma, por lo tanto, se analizan en busca de las proteínas con siete o más TMDs. Proteínas recuperado por esta búsqueda fueron sometidos a un análisis detallado, con la participación de la aplicación de diferentes métodos de bioinformática.

El análisis que aquí se presenta se ha duplicado el número de proteínas de transporte de membrana candidato identificado en el genoma, así como la atribución de putativo sustrato especificidades y / o mecanismos de transporte a todos los "transportista, putativo" carece de las proteínas previamente esta información. El recién designado candidato incluir proteínas transportadores de nutrientes, como azúcares, aminoácidos, vitaminas y nucleósidos. También hay proteínas de transporte prevé que participen en el mantenimiento de la composición iónica de la célula y en la extrusión de desechos metabólicos como el lactato. Para el candidato 34 de las proteínas de transporte de especial interés que han investigado el momento-curso de la expresión de mRNA de sangre en toda la etapa asexual del parásito.

El enriquecimiento en el repertorio de p. Falciparum a codificar las proteínas de transporte informó aquí indica que el parásito del permeome no es tan pobre como se pensó originalmente.

Resultados
Proteínas del parásito con siete o más putativo TMDs

Una búsqueda exhaustiva de la p. Falciparum genoma de genes que codifican proteínas predijo, sobre la base de un análisis hydropathy parcela, de tener siete o más putativo TMDs recuperados 167 candidatos proteínas. Estas proteínas se clasifican en tres grandes categorías según sus funciones putativo (el transporte, no de transporte, o de no putativo función) predicho por los análisis bioinformáticas. Conocido o putativo de las funciones de transporte fueron asignados a 89 (53%) de las proteínas recuperadas. Otro 50 (30%) se catalogaron como proteínas haber funciones que no están relacionadas con el transporte, que incluyen diversos transferasas, receptores, y de las proteínas implicadas en el tráfico y la secreción (como la proteína translocases), muchos de los cuales han escapado de anotación. Las restantes 28 (17%) no tiene proteínas no Plasmodium secuencia homólogos o semejanzas a los dominios conservados, y no se parecen a los transportistas en su estructura (véase la figura 1], que, por lo tanto, no podía ser atribuida una función putativo.

La expansión de los inventarios de p. Falciparum transporte de las proteínas

La mayoría de los p. Falciparum putativo transporte proteínas recuperado por el hydropathy parcela análisis utilizados aquí pertenecen a familias conocidas y de transporte se describen en el archivo de datos adicional 1. Incluyen las nuevas adiciones a la gran superfamilia facilitador, de las drogas / superfamilia metabolito transportador, y el P-ATPasa tipo superfamilia, así como muchos otros. Varias familias no identificadas previamente en el genoma, como el voltaje superfamilia de canales de iones, el péptido-acetil-coenzima A transportador de la familia, la de zinc-hierro permease familia y de la extrusión de múltiples antimicrobianos familia, también se han encontrado a la p. Falciparum codificada miembros.

Una serie de proteínas a la que hemos asignado un putativo de transporte no tienen ninguna función importante para cualquier secuencia similitud funcional caracterizado proteínas (transportistas o de otro tipo) en las actuales bases de datos. Sin embargo, ellos tienen hydropathy parcelas que se parecen a las de conocidas proteínas de transporte, en consonancia con la hipótesis de que ellos también son transportistas. Estas proteínas son de dos tipos: las proteínas que están relacionados con los hipotéticos proteínas' de otros organismos (archivo de datos adicionales 2), y la novela, Plasmodium-proteínas específicas (archivo de datos adicional 3).

Transporte proteínas que poseen un número menor de seis o TMDs no fueron recuperados por nuestros criterios de búsqueda y en su mayor parte, se han omitido de la tabla en el archivo de datos adicional 1. Un número limitado de candidatos de transporte tales proteínas se identificaron en la anotación del genoma original y son los siguientes: nueve miembros de la familia mitocondrial porteador; un catión difusión facilitador; cinco miembros de la ATP vinculante cassette (ABC) superfamilia, un V-tipo ATPasa, un aquaglyceroporin (PfAQP [11]], y un arsenito-antimonite (ArsAB) effluxer. Dos subunidades están obligadas a formar un funcional ArsAB bomba de salida - un componente de ATP hidrolizado (ArsA) y un canal de la formación integral de membrana de proteínas (ArsB). Hasta la fecha, sólo la ArsA proteína se ha identificado en la p. Falciparum genoma y la ausencia de un parásito ArsB homólogo puede indicar que o bien el ArsA proteína no funciona como parte de un ArsAB bomba de salida o, en su defecto, la ArsB proteína está presente, pero aún no se ha descubierto. Asimismo, el parásito ha genes que codifican la α, β, δ, ε γ y subunidades catalíticas de la F 1 de un complejo tipo F-ATPasa, así como la subunidad c de la membrana que abarca F-0 componente, pero los genes de la F 0 a y b subunidades aún no han sido identificados en el genoma. Clasificación de las mencionadas proteínas se puede encontrar en Ian Paulsen TransportDB sitio [12]. La lista de las proteínas del parásito de transporte que poseen seis o menos TMDs recientemente se ha extendido en la descripción de una p. Falciparum homólogo de una inusual bifuncional proteína que contiene un amino-terminal de K + y un canal de carboxi-terminal ciclasa adenylate [13].

Sólo 54 se identificaron las proteínas de transporte en la anotación del genoma original, y muchos de ellos son designados con descripciones genéricas como "transportista, putativo", de la que no hay información puede ser obtenida acerca de la probable mecanismo de transporte o de la especificidad por el sustrato. Nuestro análisis ha recuperado otras 55 putativo de las proteínas de transporte, así como la atribución de putativo sustrato especificidades y / o mecanismos de transporte a todos aquellos sin previamente (véase el archivo de datos adicional 1). Esto hace que el número total de putativo / demostrado p. Falciparum a codificar las proteínas de transporte a 109. De éstos, 61 son "cargadores" (es decir, uniporters, antiporters o symporters [10]], el 29 de los transportistas son los principales activos (es decir, si se utilizan bioquímica de la energía a la bomba de solutos en contra de un gradiente electroquímico), cinco son los canales, y 14 Putativo novela son proteínas de transporte desconocido clasificación. Candidato transporte proteínas con siete o más TMDs (que fueron objeto de nuestros criterios de búsqueda) se muestran en la Figura 2a, mientras que los que tienen seis o menos TMDs (en su mayor parte provienen de la anotada genoma) se muestra en la Figura 2b.

Predicción de la localización celular de P. Falciparum transporte de las proteínas

Muchas proteínas de transporte se encuentran en la superficie del parásito, en el que mediar en el flujo de solutos a través de la membrana plasmática. Otras proteínas de transporte se encuentran en las membranas de los compartimentos intracelulares como los de la apicoplast, mitocondria, vacuola digestiva y orgánulos de la vía secretora. El probable destino (s) dentro de la célula de un determinado transportista a menudo pueden ser inferidos por señales presentes en su secuencia del polipéptido y / o por su estrecha homología a un transporte de una proteína conocida localización celular. Por ejemplo, el péptido señal necesaria para los objetivos de los poseedores de las proteínas codificadas a la apicoplast el parásito se ha dilucidado [14] y varios p. Falciparum transporte proteínas contienen este tipo de señal (ver archivos de datos adicionales 1, 2 y 3). Estos putativo apicoplast transportistas incluyen el parásito homólogo de la planta cloroplasto phosphoenolpyruvate: P i antiporters (PFE1510c [3]], así como un putativo aminoácidos transportista (PFL1515c), varios transportadores ABC (PFC0125w, PF11_0466 y PF13_0271), P-ATPases (PFE0805w y PF07_0115) y de otras proteínas de transporte putativo de función desconocida (PFL2410w, PF13_0172 y PFE1525w). Asimismo, los nueve parásito mitocondrial de transporte de las señales contienen putativo de orientación para estos transportistas a la mitocondria. Una de ellas, la proteína transportadora de fosfato putativo (MPC, PFL0110c), ha sido clonado y demostrado experimentalmente que poseen las señales de orientación mitocondrial [15].

Dos putativo de los transportistas involucrados en la resistencia a la cloroquina - la P-glicoproteína homólogo 1 (Pgh1 [16]] y la 'resistencia a la cloroquina transportador' (PfCRT [17]] - están localizados en el aparato digestivo del parásito vacuola. PfCRT Recientemente se ha demostrado que un miembro de la droga / metabolito transportador superfamilia [18 - 20], y posee varios putativo endosomal-lisosomales señales de orientación (REM y KK, trabajo no publicado). El parásito tipo V-H +-ATPasa también se encuentra en la membrana vacuola digestiva [21] y desempeña la función principal en la acidificación de la luz [22]. Hay evidencia experimental de la presencia de otra bomba de protones en la membrana vacuolar, un dependiente de K +, H +-translocating pirofosfatasa (H +-PPasa) [22], aunque no está claro cuál de los dos parásito codificada H + - PPases [23] es el responsable de esta actividad. Desde su fuerte homología de Niemann-Pick tipo C-proteínas (implicados en el flujo de salida de los lípidos y el colesterol de lisosomas [24, 25]] PFA0375c la proteína se prevé para mediar en la H +-junto extrusión de los lípidos y esteroles de la vacuola digestiva . Asimismo, la proteína PFE1185w se prevé que residir en la vacuola digestiva, sobre la base de su estrecha homología a la endosomal Fe 2 + 'NRAMP2 de los transportistas (que participan en el ciclo de transferrina [26]], y muy probablemente cataliza la H +-impulsada eflujo De Fe 2 + en el citoplasma.

Varias proteínas de transporte están dedicadas a la realización de tareas especializadas en la vía secretora y específica 'retención' motivos participar en la selección de estas proteínas de las membranas entre el retículo endoplasmático (ER) y de los diversos compartimentos de Golgi [27, 28]. Los nucleósidos de azúcar transportistas se encuentran exclusivamente en las membranas de las ER y aparato de Golgi de los eucariotas, en el que median la absorción de nucleótidos derivados (por ejemplo, UDP-galactosa, UDP-glucosa y el PIB-fucose) de la citosol a cambio de La correspondiente nucleósido monofosfato (revisado en [29, 30]]. Los nucleótidos azúcares son luego utilizados por la glicosil-transferasas específicas para añadir azúcar a fracciones (glycosylate), proteínas y lípidos que se transportan a través de la vía secretora. El parásito de la UDP-galactosa: UMP antiporter homólogo (que contiene un motivo de la retención) y otros putativo de nucleótidos de azúcar transportistas (como PFB0535w y PFE0260w) se predice que ser residentes de la vía secretora orgánulos.

A falta de señales de orientación o de los motivos de clasificación, proteínas de membrana suelen ser destinados a seguir el 'default' y el itinerario de viaje a través de la vía secretora a la membrana plasmática [31].

Misannotation transporte de las proteínas

Gardner et al. [3] indebidamente asignado un putativo función de transporte a varios p. Falciparum proteínas. La proteína codificada por el locus PFL0620c se designa como putativo colina transportista, sin embargo, comparte fuertes similitudes con la secuencia conocida y putativo de glicerol-3-fosfato acyltransferases de una variedad de organismos, incluyendo la proteína SCT1 de Saccharomyces cerevisiae. De hecho, la proteína PFL0620c Recientemente se ha demostrado experimentalmente ser un glicerol-3-fosfato acyltransferase [32]. La anotación de PFL0620c como un transportador de la mayoría probablemente surgió de una mala interpretación de la función de SCT1 (Suppressor de una colina Transporte Mutant). Como el nombre lo implica, la SCT1 proteína se identificó por primera vez en la levadura por su capacidad para complementar un crecimiento de defectos causados por una deficiencia de colina en el transporte [33]. SCT1 posteriormente fue encontrado para catalizar la acilación de glicerol 3-fosfato en el primer paso de la biosíntesis de fosfolípidos, por lo SCT1 restaurado crecimiento de la mutante al estimular la síntesis de fosfatidilcolina, y no mediante el aumento de la captación de colina [34].

Las proteínas codificadas por los genes PF08_0098, PF11_0225, PF14_0133 y PF14_0321 son todos anotado como putativo ABC transportistas, pero ninguna de estas proteínas contiene más de un solo putativo TTM. Bioinformáticas análisis indican que la PF11_0225, PF14_0133 y PF14_0321 polipéptidos putativo soluble son proteínas que unen ATP. PF11_0225 codifica una homólogo de la S. Cerevisiae GCN20 ATPasa, que funciona en asociación con la proteína GCN1 para activar el inicio de traducción factor alfa-2-quinasa (GCN2) en el amino-ácido-las células privadas [35]. El Plasmodium GCN20 ATPasa ha sido clonado [36] y se muestra como complemento de la función de la ATPasa de levadura GCN20 participando en la traducción de levadura vía de reglamentación [37]. El PF14_0133 proteína tiene fuertes similitudes con la secuencia de las proteínas encontradas en SufC arqueas, bacterias, cryptomonads, diatomeas, dinoflagelados, algas rojas y plantas. SufC se piensa que es un versátil subunidad ATPasa que puede interactuar tanto con el Suf (ABDSE) las proteínas para formar un complejo citosólico en el montaje de Fe-S, el grupo-que contiene proteínas, o (desconocido) con proteínas de membrana para formar una Fe-S ABC exportador [38]. PF14_0321 codifica para un polipéptido corto (171 residuos), que muestra una débil homología a otras soluble ATPases de función desconocida de una amplia gama de organismos. Por último, la proteína PF08_0098 es miembro de la familia ABC1, que es distinto de, y no guarda relación con la ATP vinculante proteínas de la superfamilia ABC. ABC1 novela chaperonins proteínas son esenciales para la transferencia de electrones en el bc 1 segmento de la cadena respiratoria (S. cerevisiae ABC1 [39]] y para la producción de ubiquinona (Escherichia coli AarF [40]].

Gardner et al. [3] informaron de la presencia de 16 de tipo P-ATPases (P-ATPases) en la p. Falciparum genoma, aunque sólo 15 se encuentran en TransportDB [41]. Cuatro de ellos - PFI1205c, PF10_0096, PF13_0137 y MAL13P1.352 - no tienen similitudes con la secuencia conocida o putativo P-ATPases, o conservados a los dominios de la superfamilia P-ATPasa. Además, PF10_0096, PF13_0137 y MAL13P1.352 no poseen ningún putativo TMDs. El PF13_0137 y mostrar la debilidad de las proteínas MAL13P1.352 secuencia conserva similitudes con los dominios de la asparagine sintasa (AsnB) y la nuclear de la proteína de unión de tope familias, respectivamente, mientras que la proteína PF10_0096 no guarda relación con ninguna de proteínas o dominios conservados en las bases de datos actuales. PFI1205c codifica una gran proteína (1249 residuos) que poseen 12-13 putativo TMDs, y mientras que esta proteína también carece de cualquier similitud con los dominios conservado, parece ser un miembro de una familia específica putativo transportista a apicomplexans (véase el archivo de datos adicional 2) .

Expresión de p. Falciparum genes de las proteínas de transporte

La expresión de 34 genes putativo de transporte se analizó la sangre en toda la fase asexual del parásito. En estudios anteriores, la comparación entre los niveles de transcripción presentes en diferentes etapas de desarrollo del parásito han sido obtenidos a partir de muestras de RNA total normalizada (ver, por ejemplo [42 - 44]]. En este estudio se ha cuantificado la cantidad de RNA total producida por el parásito, ya que avanzaba a través del ciclo de vida intraeritrocitaria. Como se muestra en la figura 3, la cantidad de RNA en el aumento de eritrocitos infectados por el parásito significativa como creció de anillo a trophozoite etapa. Hubo 136 ± 19 (n = 2; gama ± / 2) veces más RNA total a fines de trofozoítos / esquizontes (alrededor de 40 horas de edad) que en la etapa de anillo parásitos (alrededor de 8 horas) y 161 ± 21 (n = 2 ; Gama ± / 2) veces más que en los anillos de jóvenes (alrededor de 4 horas). Por lo tanto, medirse y compararse los niveles de transcripción en diferentes estados de desarrollo del parásito a partir de muestras de células uniformes y no al número total de ARN (ver más abajo para más discusión).

En las siguientes secciones se considera, a su vez, una serie de diferentes familias de las proteínas de transporte, de las cuales han sido identificadas y su etapa dependiente de la expresión mRNA caracterizado en este estudio.

Los miembros de la superfamilia importante facilitador

El principal facilitador superfamilia (MFS) es una de las mayores clases de los transportistas; sus miembros son prevalentes en los organismos de todos los reinos de la vida y son diversos en ambos secuencia y función [45]. MFS transportistas de la misma subfamilia tienden a sustratos relacionadas con el transporte, y solutos transportados por proteínas MFS incluyen los azúcares, los metabolitos, los aminoácidos, péptidos, nucleósidos, polioles, de drogas y de aniones orgánicos e inorgánicos. El mecanismo de transporte también varía dentro de la superfamilia (ya veces incluso dentro de una subfamilia) con ejemplos de uniport, soluto: intercambio soluto, soluto: H + antiport, así como Na + o H +: soluto symport. Nuestro análisis se ha duplicado el parásito del complemento de MFS transportistas de seis a 12, y aunque esto todavía se comparan muy mal con otros eucariotas como S. Cerevisiae (85 MFS proteínas) y Caenorhabditis elegans (137 proteínas MFS), que supera a la que se encuentra hasta la fecha en la parasitarias eukaryote Encephalitozoon cuniculi (dos proteínas MFS) [41]. El p. Falciparum proteínas son de azúcar, ya sea el cargador, de drogas: H + antiporter-1, monocarboxylate cargador o péptido-acetil-coenzima A transportador de las familias, aunque una proteína muestra sólo una débil relación con el MFS y no puede ser colocado dentro de una familia con fiabilidad ( PFL0170w, véase el archivo de datos adicional 4).

El p. Falciparum miembros de la familia incluyen cargador de azúcar en la hexosa transportista (PfHT1/PFB0210c [46]], y los transportistas PFI0785c putativo y PFI0955w. De estas proteínas, PfHT1 (que funciona principalmente para el transporte de la glucosa) muestra la mayor similitud a la glucosa transportistas de otros organismos, incluyendo los mamíferos (archivo de datos adicional 4). En nuestro análisis de la expresión PfHT1 transcripción fue detectado casos relativamente temprano en el ciclo de vida intraeritrocitaria (alrededor de 8 horas después de la invasión, la figura 4] y para aumentar la rapidez en la abundancia de entre 16 y 24 horas, después de lo cual el nivel de transcripción estabilizado temporalmente antes Aumentar de nuevo a alcanzar un máximo aproximadamente a las 36 horas. Es significativa homología de secuencia entre PFI0955w y PfHT1 (archivo de datos adicional 4), sin embargo, ha PFI0955w algo divergentes de los transportadores de glucosa y, por lo tanto catalizar el transporte de azúcares o de otras sustancias relacionadas con el azúcar. La transcripción de PFI0955w no se encontró a comenzar hasta que el parásito ha gastado alrededor de 24 horas en el interior de la célula huésped (Figura 4], el nivel de transcripción entonces muy rápidamente alcanzó un máximo de alrededor de 32 horas y posteriormente disminuyó de manera constante. PFI0785c tiene cierta similitud con ambas PfHT1 y PFI0955w, sino más bien muestra una a dos putativo MFS transportistas de Cryptosporidium parvum y un putativo plastidio hexosa transportador de Olea europaea (archivo de datos adicional 4). El PFI0785c transcripción fue casi indetectable hasta muy tarde en el ciclo, con el mayor aumento de la transcripción nivel se producen entre 32 y 40 horas.

Cinco de los p. Falciparum codificada MFS transportistas (el PFB0275w, PFE0825w, PF11_0059, PF14_0260 y PF14_0387 proteínas) muestran una débil relación con los miembros de las' drogas-H + antiporter-1 'familia. PFB0275w y PF14_0260 comparten extensos aminoácidos de homología de secuencia entre sí y se relacionan con los supuestos transportistas de las plantas (ver archivo de datos adicionales 1 y 4). Los perfiles de expresión de estos dos genes son asombrosamente diferentes: la transcripción PF14_0260 estuvo presente en un bajo nivel muy temprana en el desarrollo de parásitos y alcanzó un máximo de más de las 36-42 horas, mientras que la transcripción de PFB0275w ocurrió bastante tarde en el ciclo (Figura 5]. La proteína es PF11_0059 débilmente relacionadas putativo multirresistencia a los transportistas, sino también tiene cierta similitud con los transportistas de la otra subfamilia de MFS, el anión: catión symporter familia (archivo de datos adicional 4). Por lo tanto, es posible que la proteína PF11_0059 medie el transporte de aniones orgánicos, como glucarate, biotina, ftalato o pantothenate (sustratos del anión: catión symporter familia), y no el flujo de drogas o metabolitos como poliaminas, la lactosa o arabinosa (Sustratos de la droga-H + antiporter-1 familia). El nivel de transcripción PF11_0059 aumentó rápidamente de 16 a 24 horas y llegó a un máximo entre 32 y 36 horas, después de lo cual disminuyó drásticamente (Figura 5]. El más cercano BLASTP homólogo de PFE0825w es una proteína de ratón designado como 'putativo catión orgánico transportista ". Sin embargo, la proteína de ratón no es miembro de la familia de transportadores de cationes orgánicos de la MFS, pero muestra buena homología a la supresión de un tumor STF-como proteína de la C. Elegans y una débil similitud a una supuesta resistencia a la tetraciclina en proteínas de Gloeobacter violaceus (véase el archivo de datos adicional 4; secuencias de varios transportistas catión orgánico se prestan para la comparación). La proteína PF14_0387 también muestra una débil similitud con la G. Violaceus proteínas, así como a una Escherichia coli putativo effluxer arabinosa, y en la secuencia se muestra en la alineación archivo de datos adicional 4, la PFE0825w y PF14_0387 proteínas se colocan dentro de la misma categoría. La transcripción de PF14_0387 aumenta rápidamente entre 16 y 24 horas, después de lo cual el nivel de transcripción plateaued y, a continuación, comenzó a disminuir después de 36 horas (Figura 5]. PFE0825w expresión de los genes no fue estudiado.

El PFB0465c y PFI1295c secuencia de las proteínas comparten similitudes importantes y están relacionados con miembros de la monocarboxylate cargador y oxalato: formato antiporter familias. A partir de la alineación se muestra en el archivo de datos adicional 4, parece que la proteína se parece a PFB0465c oxalato: antiporters formato, como el OxlT-2 de Archaeoglobus fulgidus, mientras que la proteína PFI1295c es quizá más similares a los miembros de la familia monocarboxylate cargador como el T-rata tipo amino-ácidos y el transportador humano MCT-8 proteína. El PFB0465c y PFI1295c genes similares perfiles de expresión (Figura 6], en tanto, el nivel máximo de transcripción se produjo aproximadamente a las 36 horas después de la invasión. Sin embargo, la transcripción de PFI1295c comenzó antes en el desarrollo de la intraeritrocitaria parásito.

El locus PF10_0360 parece contener marcos de lectura abierta (ORFs) para tres diferentes proteínas. Una de ellas (aminoácidos residuos 1644-2222) muestra fuerte homología a la acetil-CoA: CoA antiporters de las ER (archivo de datos adicional 4). PF10_0360 expresión de los genes no fue estudiado.

MFS relacionadas con las familias

El parásito de la malaria miembros de la codifica-glucósido pentoside-hexuronide: catión symporter (GPH), órgano transportador de aniones (EAB) y el folato-biopterin transportista (FBT) familias, que son todos parientes de los principales superfamilia facilitador [45]. La proteína es un PFE1455w putativo Na + - H + o impulsados azúcar symporter GPH de la familia y de la transcripción de mRNA de este gen se encontró que era más abundante entre 32 y 40 horas después de la invasión (Figura 7]. El MAL6P1.283 proteína pertenece a una familia de transportistas putativo de las bacterias, las plantas y los animales, los miembros de la debilidad que presentan similitudes con las proteínas y de los dos dominios se conserva el MFS y la familia TAO (archivo de datos adicionales 1 y 5). Los miembros de la familia TAO catalizar el transporte de aniones y cationes orgánicos y sólo se encuentran en el reino animal. Si bien el MAL6P1.383 proteínas y sus familiares son sólo débilmente similar a la OAT proteínas, en ausencia de una clasificación más apropiada que hemos colocado provisionalmente estas proteínas dentro de la familia TAO. MAL6P1.383 expresión de los genes no fue estudiado.

Los genes MAL8P1.13, PF11_0172 y PF10_0215 codificar FBT miembros de la familia. Las proteínas de esta familia sólo se encuentran en las cianobacterias, los protozoos y plantas, y se cree que funcionan como H + symporters. Hasta el momento, sólo los transportistas protozoario se han caracterizado y son conocidos por mediar en la absorción de las vitaminas ácido fólico y / o biopterin (por ejemplo, FT1 [47] y BT1 [48] de Leishmania y FT1 de Trypanosoma brucei [49]]. El MAL8P1.13 y PF11_0172 proteínas comparten importantes similitudes y secuencias, ya que están estrechamente relacionadas con conocidos o putativo FBT proteínas (véase el archivo de datos adicionales 1 y 5), es probable que ellos también catalizar la absorción de ácido fólico y / o biopterin. Ambos compuestos contienen la pteridine grupo, y los miembros de esta familia pueden también pteridine transporte (no en sí misma una vitamina), aunque esto no ha sido demostrado directamente. Es importante divergencia entre las secuencias de proteínas y PF10_0215 miembros de la FBT y de la familia es muy factible que esta proteína transporta otros metabolitos y / o vitaminas. Los perfiles de expresión de la MAL8P1.13, PF11_0172 y PF10_0215 genes se comparan en la Figura 7.

Una familia de novela putativo transportistas

Hemos asignado un putativo función de transporte a 19 p. Falciparum proteínas que no tienen ninguna secuencia importantes similitudes con conocidos o putativo de transporte de proteínas, pero que han hydropathy parcelas que son similares a las de conocidos transportistas. Dentro de este grupo es un conjunto de cinco proteínas (PFA0240w, PFA0245w, PFC0530w, PFI0720w y PF11_0310) que comparten ambos secuencia y homología estructural, pero que carecen de cualquier secuencia similar a otras proteínas en las actuales bases de datos. Varias líneas de evidencia sugieren que estas proteínas pueden compartir un ancestro común con los transportistas de la MFS, y por esta razón se han incluido en el cuadro del archivo de datos adicionales 1, en el que se designan como p. Falciparum novela putativo transportistas (PfNPTs). El PfNPTs comparten una topología, que consta de 12 TMDs separados por un bucle hidrófilo en dos series de seis TMDs poco espaciados (archivo de datos adicional 6). Esta topología se asemeja la que se encuentra entre los transportistas del MFS y, en consonancia con esta observación, uno de los PfNPTs (PFA0245w) tiene un putativo a un partido conserva el dominio de MFS. Además, en dos o más repeticiones de un PSI-BLAST búsqueda de la National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando una base de datos como la consulta PfNPT secuencia recupera, con buen significado, varios putativo MFS proteínas. Una característica de la mayoría de los miembros de la familia MFS es la presencia de una conserva secuencia de aminoácidos TMDs entre 2 y 3 y el correspondiente motivo, pero menos conservadas en el bucle correspondiente en la segunda mitad de la proteína (TMDs entre 8 y 9). Como se muestra en el archivo de datos adicional 6, cada PfNPT contiene una proteína específica putativo MFS TMDs motivo entre 2 y 3 y entre TMDs 8 y 9, en consonancia con la hipótesis de que estas proteínas están alejadas a la MFS. El PFC0530w y PFI0720w genes se encontraron para compartir un patrón similar de expresión de la sangre fase asexual del parásito, mientras que el resto de genes PfNPT exhibió muy diferentes perfiles de expresión (Figura 8].

Amino-ácido transportistas

Nos han designado seis p. Falciparum-proteínas codificadas como putativo aminoácidos transportistas. Tres (MAL6P1.133, PFL0420w y PFL1515c) son miembros de los aminoácidos / auxina permease (AAAP) familia. Los otros tres (PFB0435c, PFE0775c y PF11_0334) son miembros de la neurotransmisor: Na + symporter (SNA) familia. Proteínas de la AAAP familia se sabe que mediar en el transporte de un aminoácido específico (por ejemplo, la prolina permease de Arabidopsis thaliana [50]], o de un grupo similar de aminoácidos (por ejemplo, el neutral amino-ácido de permease Neurospora crassa [51]], mientras que varios miembros exposición muy amplia peculiaridades, el transporte de todos los aminoácidos de origen natural (por ejemplo, el general aminoácidos transportador de A. thaliana [52]]. AAAP proteínas se encuentran en la levadura, protozoos, plantas y animales, y el transporte es por lo general bien H + - y / o Na +-dependientes [53 - 55]. El MAL6P1.133 proteína parece compartir el mayor nivel de similitud con la secuencia de aminoácidos transportistas de otros protozoos, levaduras y mamíferos (archivo de datos adicionales 7). El PFL0420w y PFL1515c proteínas están estrechamente relacionados (archivo de datos adicional 1), y parecen ser más similares en la secuencia de aminoácidos de transporte de las plantas y los insectos (archivo de datos adicionales 7). La proteína contiene un PFL1515c putativo de señal para la orientación a la apicoplast membrana.

Sustratos de NSS transportistas incluyen aminoácidos, neurotransmisores y otros compuestos nitrogenados, como la taurina (un aminoácido sulfónico) y creatina. NSS proteínas sólo se encuentran en arqueas, bacterias y animales, y la mayoría de los transportistas se caracteriza hasta el momento funcionan a través de un soluto: Na + symport mecanismo (por ejemplo, el triptófano: Na + symporter de Symbiobacterium thermophilum [56] y la de mamíferos neutral amino Ácido: Na + symporter [57]]. La mayoría son también Cl - dependen de los productos básicos, por ejemplo, el neutro y catiónico de aminoácidos: Na +: Cl - symporter de los seres humanos [58]. Dos excepciones son la absorción de los amino-ácidos transportistas - CAATCH1 [59] y KAAT1 [60] - desde el epitelio intestinal de los insectos Manduca sexta. Estos transportistas catalizar la Na +-dependientes (K m (Na +) ≈ 6 mM) o K + - dependiente (m K (K +) ≈ 32 mM), el transporte de aminoácidos cuando se expresa en ovocitos de Xenopus, pero la baja Na + (Menos de 5 mM) y alto K + (unos 200 mM) en la prevalencia de las concentraciones de insectos gut lumen garantizar que estos transportistas operan principalmente a través de K + symport in vivo [60]. El Plasmodium NSS proteínas, conservando al mismo tiempo varias de las secuencias conservadas NSS motivos, se han ido distanciando considerablemente de los otros miembros de la familia (archivo de datos adicionales 1 y 8), lo que hace difícil determinar un sustrato putativo (s) para cada transportista. No obstante, parece que las proteínas que el parásito puede llevar más similitudes a los miembros de la SNA que el transporte de aminoácidos, que hacen que el transporte a los otros neurotransmisores o osmolytes.

Figura 9 muestra la fase dependiente de la expresión de genes de cada uno de los seis Plasmodium putativo aminoácidos transportistas. Los importantes niveles de PFB0435c, PF11_0334 o PFL0420w transcripción estaban presentes sólo en el segundo período de 24 horas de parásito desarrollo y la expresión de los genes PFL1515c y PFE0775c comenzó en serio sólo ligeramente antes (en torno a 20 horas). Por el contrario, existe un nivel relativamente alto de MAL6P1.133 transcripción temprana del parásito en el desarrollo y la expresión de este gen continuó a lo largo de la etapa intraeritrocitaria.

El transportador de nucleósidos equilibrative familia

Miembros de la equilibrative transportador de nucleósidos (ENT) la familia mediar la asimilación de los nucleósidos y / o nucleobases y están presentes en la levadura, los protozoos y animales. ENT a través de las proteínas de transporte no suele ser acoplado a la conducción de un movimiento de iones (de ahí el nombre 'equilibrative'); las excepciones son tres electrogenic nucleósidos: H + symporters de Leishmania donovani [61]. A P. Falciparum codificada ENT, la PF13_0252 proteína, se ha caracterizado en los ovocitos de Xenopus y demostrado que el transporte de purina y pirimidina y nucleobases nucleósidos (PfENT1 [62, 63]] y una segunda proteína (MAL8P1.32) está anotado en el genoma como un putativo Transportador de nucleósidos. Hemos identificado dos nuevas p. Falciparum putativo de nucleósidos / nucleobase transportistas, PFA0160c y PF14_0662. Cada parásito ENT proteína predice muestra una estructura secundaria que es característico de los miembros de la familia ENT - 11 TMDs con un gran lazo intracelular entre los dominios 6 y 7. Sin embargo, a pesar de esta conservación en la estructura, las cuatro proteínas de la malaria cuota limitada secuencia similitudes entre sí y son sólo muy débilmente relacionadas con ENT proteínas procedentes de otros organismos (archivo de datos adicional 1). Los perfiles de expresión de la PFA0160c, MAL8P1.32 y PF13_0252 genes fueron similares en cada uno había un importante nivel de transcripción presentes principios en el desarrollo de parásitos y un rápido aumento de la transcripción abundancia se produjeron entre 16 y 24 horas, después de lo cual el nivel de transcripción Alcanzó un máximo (en torno a 32 horas) y luego se redujo lentamente (Figura 10]. Por el contrario, la transcripción PF14_0662 aumento en la abundancia rápidamente entre 8-20 horas y culminó aproximadamente a las 36 h.

Anión inorgánico transportistas

MAL13P1.206 y PF14_0679 son candidatos inorgánicos de aniones transportistas. La proteína tiene PF14_0679 fuerte similitud con la secuencia bacteriana miembros de la gran y omnipresente sulfato permease (SulP) familia (archivo de datos adicional 1). Ninguna de las proteínas bacterianas SulP se ha caracterizado funcionalmente, pero varios miembros de la planta se sabe que SO 4 2 -: H + symporters y diferentes proteínas de mamíferos SulP llevar a cabo los siguientes tipos de actividades de transporte: SO 4 2 -: HCO 3 -- Antiport; HCO 3 -: Cl - antiport, y el transporte de SO 4 2 -, el formato, oxalato, Cl - o HCO 3 - a cambio de cualquiera de estos aniones. Como se muestra en la figura 11, el nivel de transcripción PF14_0679 es baja en las primeras 16 horas de desarrollo del parásito, pero aumentó constantemente en adelante, en horas pico en aproximadamente 40 horas.

El MAL13P1.306 proteína pertenece a la familia de transportadores de fosfato inorgánico (PiT), que los miembros de catalizar la Na + - H + o dependientes de la captación de fosfato inorgánico (P i). En los oficiales de la anotación del genoma, la p. Falciparum PiT proteína (PfPiT) ha sido designada como un putativo P i: H + symporter. Sin embargo, en un BLASTP búsqueda de la base de datos NCBI PfPiT recupera la Na +-junto P i transportistas de animales y levaduras con mucho mayor significación que la H +-junto P i transportistas de las bacterias y los cloroplastos de plantas. Esta observación ha sido el apoyo de un detallado análisis filogenético en el que el Plasmodium PiT proteína se encontró al grupo dentro de la rama de la Na +-dependiente PiT proteínas (REM, K. Saliba, A. Bröer, C. McCarthy, M. Downie, RIH , R. Allen, S. Bröer y KK, trabajo no publicado). Con posterioridad flujo experimentos realizados con trophozoite etapas parásitos reveló la presencia de un dependiente de Na + P i transportador en la membrana plasmática del parásito, y la expresión de la proteína en PfPiT Xenopus ovocitos ha verificado su función como P i: Na + symporter (REM , K. Saliba, A. Bröer, C. McCarthy, M. Downie, RIH, R. Allen, S. Bröer y KK, trabajo no publicado). Como se muestra en la figura 11, la PfPiT (MAL13P1.206) gen se expresó en las primeras fases de desarrollo del parásito y la transcripción se hizo cada vez más abundante después de 16 horas, alcanzando un máximo de alrededor de 36-40 horas.

El voltaje de iones canal superfamilia

Los miembros del voltaje canal de iones (CIV) superfamilia se encuentran en todos los ámbitos de la vida. Los canales caracterizado hasta el momento son específicos para el K +, Na + o Ca 2 + bajo condiciones fisiológicas. Los canales de potasio de esta superfamilia se suelen homotetrameric estructuras, montado de una subunidad del polipéptido que poseen seis TMDs, y contienen una central de la conducción de iones de poro (revisado en [64, 65]]. Cada subunidad contiene una muy conservadas' selectividad secuencia 'en el bucle TMDs entre 5 y 6, y en la estructura de estos bucles tetrameric se coloca junto a la creación de un «filtro de la selectividad", que determina la especificidad de cationes del canal. También hay un "sensor de tensión 'en TTM 4, que consta de tres a nueve regularmente espaciados, de carga positiva residuos de aminoácidos. Hay tres miembros de la familia de canales de K + en el genoma de la malaria (PFL1315w, PF14_0342 y PF14_0622), uno de los cuales recientemente se ha clonado (PFL1315w [66]]. A diferencia de la mayoría de los miembros de la familia, la p. Falciparum polipéptidos se predice que poseen más de seis TMDs, por lo que fueron recuperados por nuestros criterios de búsqueda (que especifica las proteínas con siete o más TMDs). El PFL1315w y PF14_0622 limitada secuencia de las proteínas mostrar similitudes a conocidos o putativo de los canales de K + y de otros organismos también son sólo muy débilmente relacionados entre sí (véase el archivo de datos adicionales 1 y 9), pero ambos poseen la firma de la secuencia de selectividad K + Canal de la familia (Figura 12 y archivo de datos adicionales 9). Un estudio más amplio de la bioinformática PFL1315w y PF14_0622 proteínas se presentará en otros lugares (R. Allen y KK, trabajo no publicado).

El PF14_0342 proteína está estrechamente relacionado con el PFL1315w proteína y una secuencia de alineación de estos dos polipéptidos revela que esta similitud se extiende sobre la mayor parte de las longitudes de las proteínas (archivo de datos adicionales 1 y 9). Sin embargo, el polipéptido PF14_0342 ha sufrido algunos cambios notables en la región de la secuencia de selectividad de iones. La más notable de estas son las siguientes: la inserción de dos alanines, la presencia de threonine en una posición que, en casi todos los otros miembros de la familia, está ocupada por ácido aspártico, y la sustitución de un Estado neutral por un aminoácido lisina Dos residuos, a la izquierda de esta posición (Figura 12].

La figura 13 muestra los perfiles de la expresión de la PFL1315w, PF14_0342 y PF14_0622 genes. El PFL1315w y PF14_0342 transcripciones estuvieron presentes en las primeras etapas de desarrollo de parásitos y un aumento de forma significativa en la abundancia entre 16-24 horas, después de lo cual el nivel de transcripción alcanzó un máximo (en torno a 36 horas) y luego se redujo. El PF14_0622 gen tiene un patrón de expresión de que fue sorprendentemente distinta de la de cualquier otro se presentan en este estudio, como el parásito intraeritrocitaria madurado el nivel de transcripción parecía sube y baja en olas sucesivas de la creciente amplitud.

Discusión
Enriquecimiento de la p. Falciparum permeome

En la anotación original de la p. Genoma falciparum, el parásito que se describió como la posesión de un muy limitado complemento de las proteínas de transporte [3]. El detallado análisis bioinformático que aquí se presenta pone de manifiesto que el parásito permeome es al menos dos veces más grande que por primera vez, y predice la presencia de una gama de capacidades de transporte que se supone previamente se dan en el parásito. El recién designado candidato incluir proteínas transportadores de membrana plasmática de nutrientes, como azúcares, aminoácidos, vitaminas y nucleósidos. También hay proteínas de transporte prevé que participen en el mantenimiento de la composición iónica de la célula y en la extrusión de desechos metabólicos como el lactato. Varios de los nuevos transportistas son, muy probablemente, situado en las membranas intracelulares. Algunas de ellas se prevé para catalizar el flujo de solutos, ya sea dentro o fuera de un compartimiento intracelular (por ejemplo, el hierro effluxer putativo de la vacuola digestiva, PFE1185w), mientras que otros se predice para mediar en el intercambio de metabólicas intermedias entre el citosol y Un orgánulo lumen (por ejemplo, el PIB putativo-fucose: GMP antiporter de la Golgi, PFB0535w). Varios de los p. Falciparum proteínas que recuperó con siete o más importantes TMDs no tienen ninguna similitud con cualquier secuencia de las proteínas de otros (transportistas o de otro tipo) caracterizado previamente. Sin embargo, han hydropathy parcelas que son similares a los de conocidas proteínas de transporte, en consonancia con la hipótesis de que ellos también son transportistas. Dentro de este grupo es un subconjunto de proteínas relacionadas que forman una novela familiar de los transportistas putativo, que pueden estar muy alejadas de la MFS. Estos nuevos putativo transportistas parecen ser específicas de los plasmodios y, por lo tanto, son de interés potencial como nuevos medicamentos antimaláricos objetivos.

Este enriquecimiento en el repertorio de p. Falciparum a codificar las proteínas de transporte indica que el parásito permeome no es tan empobrecido como originalmente se pensaba (aunque todavía el parásito no puede considerarse que tengan un transportista-repleta genoma, véase más abajo). Por ejemplo, en el estudio original de los datos del genoma se propuso, sobre la base de la aparente ausencia de un claro aminoácidos transportista, que el parásito intraeritrocitaria debe depender casi por completo de la ingestión y la digestión de la hemoglobina para la acogida de su oferta Aminoácidos [3]. Sin embargo, aquí la identificación de varios aminoácidos putativo los transportistas, junto con observaciones anteriores de que el parásito es capaz tanto de la importación [67] y [68] de exportación de aminoácidos, indica que este no es el caso. Los seis putativo aminoácidos transportistas identificamos mostrar distintos patrones de expresión mRNA, lo que sugiere que cumplen diferentes funciones en el rápido desarrollo de la intraeritrocitaria parásito. Por ejemplo, la proteína MAL6P1.133 es más relacionados con los transportadores de aminoácidos de otros protozoos, levaduras y mamíferos, y la expresión de este gen en todo el intraeritrocitaria fase (Figura 9] sugiere que el transportista tiene un papel importante en el crecimiento del parásito , Tal vez como una amplia especificidad permease membrana plasmática de aminoácidos. Por otro lado, la proteína PFL1515c es más similar a la planta de ácido amino-transportistas, el gen se expresa un poco más adelante en el desarrollo del parásito (Figura 9], y la presencia de una señal de orientación putativo apicoplast indica que probablemente las proteínas de transporte de la media En aminoácidos y / o fuera de este orgánulo.

P. falciparum-canales codificados

En su histórico papel de Gardner et al. [3] informaron de "no claro homólogos de los eucarióticos sodio, el potasio o cloruro de canales de iones pueden ser identificados". Sin embargo, dos de los canales de K + putativo Desde entonces, se han clonado [13, 66], y hemos identificado un nuevo canal de K + putativo (PF14_0622), así como una novela de proteínas de la familia de canales de K + (PF14_0342). Nuestro análisis de la p. Falciparum genoma no reveló ninguna putativo Cl - canales, y, en este sentido, nuestros resultados de acuerdo con la anotación original. La mayoría de los organismos, incluidos los de muchos otros eucariotas inferiores (por ejemplo, Dictyostelium discoideum, Entamoeba histolytica y diversas especies de hongos), se sabe que codifican, al menos, un miembro de la familia de canales de cloruro ClC. ClC proteínas poseen 18 hélices alfa [69], 10-12 de los cuales suelen ser detectados como putativo TMDs por un programa de predicción de TTM, pero nuestros criterios de búsqueda, que especifica siete o más TMDs, no recuperar un p. Falciparum ClC proteína codificada. Para verificar este resultado, que realizó cuatro repeticiones de un PSI-BLAST búsqueda de la base de datos NCBI utilizando el E. Coli proteína ClC (gi: 26106498) como secuencia de la consulta. La búsqueda recuperó 695 ClC proteínas de 226 diferentes organismos, entre ellos muchos procariotas, eucariotas unicelulares, plantas, y una amplia gama de animales, pero una Plasmodium ClC homólogo no fue recuperado entre los proteínas. También ausente de la lista de los organismos fueron recuperados otros dos menores eucariotas, el protozoario apicomplexan C. Parvum y la microsporidian E. Cuniculi, que se han notificado su falta de la proteína ClC [70, 71]. P. Falciparum, C. Parvum y E. Cuniculi se obliga a todos, parásitos intracelulares que residen en el citoplasma de la célula huésped, y hasta la fecha son los únicos que parecen eucariotas carecen de una proteína ClC. Es tentador, por lo tanto, a especular que la pérdida de proteínas en ClC estos organismos se relaciona con sus parásitos, el estilo de vida intracelular.

Una de las funciones principales de la membrana plasmática Cl - canales en células no excitables es en el volumen de regulación del volumen celular respuesta a la perturbación [72, 73]. Es probable que en el entorno relativamente protegido de la acogida citoplasma, el parásito no está expuesto a importantes permutaciones en osmolaridad y que por lo tanto no requiere Cl - canales para este fin. Además, Cl - canales en la membrana plasmática del parásito facilitaría la distribución de Cl - iones de acuerdo con el potencial de membrana. El potencial de membrana a través de la membrana de la etapa madura trophozoite-parásito se ha estimado en -95 mV [74]. El [Cl -] eritrocitos en el citosol es del orden de 95 mM [75] y si Cl - fueron autorizados a distribuir entre los eritrocitos y parásito cytosols sobre la base del potencial de la membrana [Cl -] en el citoplasma se parásito Ser del orden de 3 mM (calculado a través de la ecuación de Nernst). Sobre la base de microanálisis de rayos X de datos [76] es probable que el [Cl -] en el citoplasma del parásito es un orden de magnitud mayor que esta, de conformidad con Cl - activamente acumulado por el parásito, en lugar de que se les permita Equilibrar a través de Cl - canales. La acumulación de Cl - por el parásito puede ser mediado por un Cl -: H + symporter (como se encuentra en plantas y hongos [77, 78]] o tal vez un Cl -: intercambiador de aniones (como la proteína que hemos anotado Como un intercambiador de aniones inorgánicos putativo, PF14_0679).

El único papel en el que Cl - canales han estado implicados en la fisiología del parásito intraeritrocitaria es en la formación de la 'nueva permeabilidad de las vías' (CN) que median el aumento del tráfico a través de la membrana de los eritrocitos huésped una amplia gama de bajo peso molecular Solutos, incluidos los polialcoholes, aminoácidos, azúcares, vitaminas, y tanto orgánicos e inorgánicos (monovalente), aniones y cationes [79]. El CN muestran una marcada preferencia por los aniones más de cationes, y por más de Na + K + [80]. Sus propiedades de transporte son las que se esperan de anión selectivo de los canales [81], y los estudios electrofisiológicos han confirmado la presencia de estos canales en la membrana de los eritrocitos infectados [82 - 84]. Se ha propuesto que estos canales son proteínas endógenas, destaca o activadas por estímulos relacionados con el parásito de la invasión de la célula huésped [83, 84]. Sin embargo, el reciente informe de la cepa específica de las variaciones en las propiedades de una novela dentro de la rectificación de anión selectivo canal inducida por el parásito en la membrana de la célula huésped es consistente con la hipótesis de que este canal (denominado Plasmodium PESAC de eritrocitos superficie canal de aniones [85 ]) Es, en cambio, la estirpe de parásitos [86]. Si este es el caso, la falta de un claro Cl - canal en la p. Falciparum genoma indica que es probable que sea un nuevo tipo de canal.

Una proteína que merece mayor consideración en este contexto es PF14_0342, una muy inusual miembro de la familia de canales de K +, que se distingue de todos los demás K +-canal de la familia de proteínas por la presencia de varios importantes mutaciones en la región de la selectividad de iones Secuencia. Estas incluyen la sustitución de una muy conservadas por threonine ácido aspártico, la mutación de un aminoácido neutro a una lisina dos residuos de aminoácidos a la estación terminal de esta posición, y la inserción de dos alanines (Figura 12]. En los canales de K +, la conserva aspártico de residuos se encuentra en el borde de la extracelular poro [64], donde se puede crear un campo electrostático que 'embudos' K + en el canal de iones de apertura. La sustitución de este ácido por un neutro de residuos de aminoácidos, junto con la aparición de una carga positiva de residuos cerca de lisina, plantea la posibilidad de que la selectividad de los iones PF14_0342 canal ya no es estrictamente catiónico, y puede incluso ser aniónico. La importancia de la insertará alanines es difícil de predecir, pero pueden servir para ampliar el diámetro del filtro de selectividad y, por tanto, permitir el transporte de solutos más grandes. El canal de iones PF14_0342 putativo, por lo tanto, podría ser considerado como un candidato para el parásito inducida por la CN, y la localización de la proteína dentro de la célula infectada, y de sus características fisiológicas, se está investigando. Si la proteína PF14_0342 es, en efecto, un componente de la CN, cabe prever que la cepa específica de las diferencias en las características electrofisiológicas de los eritrocitos parasitados [86] se correlaciona con una diferencia (s) en la secuencia de aminoácidos de PF14_0342.

Na + dependientes de los transportistas y el papel fisiológico de la CN

Poco después de la invasión por el parásito de la malaria, la concentración de Na + en el citosol de acogida eritrocitos es similar a la que en los eritrocitos no infectados, y para que en el citosol del parásito en sí [76]. Existe, por lo tanto, poco o ningún gradiente de concentración de Na + a través de la membrana plasmática del parásito. Con la inducción de la CN en alrededor de 12-15 horas, sin embargo, hay una progresiva de las fugas en Na +, K + y de los eritrocitos infectados [80], lo que resulta en un notable aumento de la [Na +] El citosol y eritrocitos, por lo tanto, un considerable perfeccionamiento activo Na + gradiente de concentración a través de la membrana plasmática del parásito [76]. Nuestra identificación de varios putativo Na +-junto transportistas en el parásito de la malaria genoma sugiere que un componente importante del metabolismo del parásito podría depender de Na + impulsado procesos de transporte, la entrada de Na + a través de la CN, y el consiguiente aumento de [Na +] Eritrocitos infectados en el citosol puede ser importante por esta razón. El Na + dependiente de P i transportador (PfPiT; REM, K. Saliba, A. Bröer, C. McCarthy, M. Downie, R.IH., R. Allen, S. Bröer y KK, trabajo no publicado) proporciona un ejemplo De cómo este gradiente de Na + se puede utilizar para dirigir la acumulación de un nutriente esencial. Otros posibles candidatos para los transportistas pueden utilizar el gradiente de Na + a través de la membrana plasmática del parásito para dinamizar soluto de transporte incluyen los tres putativo de aminoácidos: Na + symporters familia de la SNA, el putativo Na + - H + o impulsados por el azúcar de la symporter GPH familia, el MATE antiporter putativo, y uno o varios de los p. Falciparum MFS transportistas.

Normalización de los niveles de expresión de genes de etapa y los cambios específicos en el contenido de ARN total intraeritrocitaria p. Falciparum

El nivel de la meta del mRNA en una muestra suele ser normalizada a una referencia interna, como la expresión de una "limpieza de genes", rRNA total o ARN, a fin de comparar la abundancia relativa de la transcripción celular entre las distintas muestras. Housekeeping genes, como el de glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), originalmente se pensó que se expresó en niveles constantes, con independencia del tipo de células, etapa de desarrollo o de manipulación experimental. Sin embargo, se ha hecho cada vez más evidente que la transcripción de los genes del hogar no siempre son mantiene constante en los niveles en la célula [44, 87, 88], ni tampoco es probable que haya especies que se ARNm. Asimismo, el nivel de rRNA en la celda se conoce también a variar en relación a factores como el tipo de células y de la edad [88, 89]. Por lo tanto, el uso de ya sea un hogar o rRNA gen mRNA como patrón interno ha perdido mérito [88], y, a la normalización total de RNA se ha convertido en el método de elección para la comparación entre los diferentes niveles de mRNA de células muestras [90, 91].

A la normalización total de ARN podría ser una estrategia apropiada cuando el (promedio) de la cantidad total de células por ARN es similar en cada una de las muestras. Es menos apropiado para cuantificar los niveles de expresión de genes entre células de actividades sumamente diferentes transcripcional [88, 90, 91]. En las células que son muy transcriptionally activa (y, por tanto, contienen un alto contenido de ARN total) un objetivo transcripción parece estar a un nivel, desproporcionadamente bajo, en comparación con el que se cuantifica en el transcriptionally células quiescente (con menor contenido total de RNA) en la que el número de copias Transcripción de la meta es la misma. En este estudio se midió el ARN total contenido de los parásitos de la malaria a medida que avanzaba a través del ciclo de vida intraeritrocitaria y encontró allí a ser alrededor de 160 veces más RNA a fines de trofozoítos / esquizontes (alrededor de 40 horas de edad) que en los jóvenes de anillo etapa parásitos (alrededor de 4 Horas de edad) (Figura 3]. Esto está de acuerdo con resultados anteriores de una considerable elevación de la tasa de transcripción en trofozoítos en comparación con el anillo de parásitos etapa [92, 93].

El cambio sustancial en el contenido de ARN del parásito no se produce como una constante, el aumento lineal de la invasión a través de la madurez. Más bien, el nivel de ARN sigue siendo muy baja a principios del parásito de la ocupación de los eritrocitos (aumentando sólo ligeramente en las primeras 16 horas), y luego aumentó rápidamente de 20 a 40 horas y se redujo a 42 horas (Figura 3]. Este patrón se correlaciona bien con la aparición en 20-30 horas de una amplia gama de actividades metabólicas en el parásito [92, 94 - 96] y de la eventual downregulation de muchas de estas actividades en las últimas fases (schizont / segmenter) del parásito Maduración [97 - 99].

Dos recientes estudios a gran escala han analizado la transcriptome del parásito de la malaria a medida que avanza a través del ciclo de intraeritrocitaria [42, 43]. El Le Roch et al. [43] estudio examinó los niveles de mRNA de aproximadamente el 95% del predicho p. Falciparum genes a los seis puntos en el intraeritrocitaria ciclo, mientras que Bozdech y colegas [42] midieron la expresión de genes en intervalos de 1 hora durante todo el ciclo de 48 horas, proporcionando así una impresionante y amplia investigación de la transcriptome de sangre-fase asexual p. Falciparum. Ambos estudios de normalización de los niveles de mRNA total de ARN, lo que impide las comparaciones entre genes y prudente con el presente trabajo.

No obstante, cabe señalar que el grado de similitud entre los perfiles de expresión mRNA obtenidos cuando a la normalización de número de células (como en este estudio) y los obtenidos cuando a la normalización de ARN total (como en los estudios anteriores) depende en gran medida de la Cantidad de transcripción presentes en el anillo etapas (la primera 16-20 horas de la fase intraeritrocitaria). Por ejemplo, para los genes para los que existe una cantidad considerable de transcripción presentes en el anillo etapa, y que se someten a un nuevo aumento durante la segunda mitad del ciclo intraeritrocitaria (por ejemplo, PFC0530w, PF11_0310 y MAL6P1.133), la normalización de las Transcripción nivel en relación con el total de ARN tienden a mostrar el nivel que se mRNA inicialmente elevada en relación a la observada en adultos parásitos y entonces se someten a una disminución en el parásito alcanza la madurez, mientras que la normalización de la celda número mostrará un aumento progresivo en el nivel de la transcripción Madura parásito (por ejemplo, las figuras 8 y 9], es decir, los dos tipos de perfiles se verá muy diferente. Por el contrario, para los genes de transcripción que es rara o ausente en la etapa de anillo parásitos, pero aumenta a medida que madura el parásito (por ejemplo, PFB0435c, PFL0170w y PFA0245w), entonces los perfiles obtenidos mediante los dos métodos diferentes normalización puedan compartir algunas Semejanzas, en particular en la segunda mitad del ciclo intraeritrocitaria, donde ambos modos de normalización se muestran los aumentos en los niveles de transcripción. En resumen, la relación entre los dos conjuntos de datos es muy compleja, y las aparentes diferencias o similitudes observadas entre los perfiles producidos utilizando estos métodos diferentes dependerá de factores tales como la etapa en que la transcripción de un determinado gen comienza, el ritmo al que El nivel de transcripción aumenta, y el punto en el que el nivel de transcripción alcanza un máximo.

Normalización de los niveles de mRNA número de células, como en el presente estudio, permite que el nivel de un determinado transcripción que se medirán independientemente de la expresión de otros genes, rRNA total o ARN, que son los parámetros que es probable, o se sabe, a Cambiar drásticamente durante el ciclo intraeritrocitaria. Los perfiles de expresión que presentamos refleja el número de copias de la transcripción dentro de la célula y de ilustrar de qué manera este cambio como la cantidad de parásitos que avanza desde la primera etapa a través de anillo a schizont etapas. A partir de esto, es evidente de inmediato la manera en que la expresión del gen se está regulado - independiente de cualquier otra variable.

Normalización de los niveles de transcripción al número de células también puede proporcionar más información sobre el posible papel biológico de la proteína codificada, que a la normalización del RNA. Esto se ilustra mejor con un ejemplo concreto. El parásito hexosa transportista, PfHT1, proporciona la principal vía para la entrada de la glucosa [46, 100, 101], un nutriente esencial requerido por el parásito de la malaria intraeritrocitaria la producción de ATP (a través de glicolisis). La tasa de glicolisis etapa es muy específicas; anillo-en la etapa de parásitos a nivel de metabolismo de la glucosa no se diferenciaba mucho de la medida en los eritrocitos no infectados, pero como el joven parásito madura como trophozoite hay un aumento espectacular de la tasa de glicolisis y El nivel máximo de consumo de glucosa se produce en la etapa schizont [94, 102, 103]. Dado el papel central de PfHT1 en la captación de glucosa [46, 100, 101], cabría esperar que el perfil de expresión PfHT1 reflejará el aumento significativo de la demanda de la captación de glucosa por el parásito de maduración. De hecho, cuando es la expresión de los genes a las células normalizado número, el mayor incremento en el nivel de PfHT1 ARNm se produce en la transición entre el anillo y trophozoite etapas del parásito (16-24 horas) y el nivel máximo se alcanzó a comienzos de la etapa schizont (Figura 4]. Sin embargo, cuando a la total normalización de ARN (véase [104]], el nivel de PfHT1 transcripción parece ser más abundante en el ring-parásito etapa (cuando relativamente poco glicolisis está ocurriendo) y disminuye rápidamente como el parásito se desarrolla en un trophozoite, quedando en Un bajo nivel en todo el parásito más intenso período de crecimiento.

Tendencias de los perfiles de expresión de P. Falciparum transporte de los genes

Todos los genes para el que se analizó la expresión mRNA transcriptionally se activa durante la fase asexual intraeritrocitaria de p. Falciparum, aunque por diferentes duraciones. Para el 13 de los 34 genes investigados había una cantidad detectable fácilmente de transcripción presentes desde las 8 horas a través de a 42 horas; estos incluyen genes que codifican las proteínas conocidas para el transporte de fosfato inorgánico (PfPiT), la glucosa (PfHT1) y nucleósidos (PfENT1) y para putativo Transportadores de nucleósidos / nucleobases (PFA0160c y MAL8P1.32), aminoácidos (MAL6P1.133), monocarboxylates (PFI1295c), así como un canal de K + putativo (PFL1315w) y novedoso canal de iones (PF14_0342). Tres de los 13 genes que codifican para los miembros de la novela putativo transportador de la familia (PFC0530w, PFI0720w y PF11_0310) y mientras que la probabilidad de sustrato (s) de cada uno de estos transportistas se desconocen, la expresión de los genes de los principios de anillo etapas a través de los parásitos Fines de esquizontes sugiere que cada uno de estas proteínas juegan un papel importante en la bioquímica de la intraeritrocitaria parásito, es de suponer que por mediación del transporte de un importante soluto (s). Por 16 horas después de la invasión, el número de genes de transcripción que podrían ser detectados aumentó de 13 a 25, aunque en muchos casos el nivel de ARNm es todavía muy bajo (por ejemplo, el intercambiador de aniones putativo (PF14_0679) y tres amino - Ácido transportistas (PFE0775c, PF11_0334 y PFL1515c) entre otros). Las transcripciones de algunos genes (PF14_0387, PF14_0342, PF14_0662 y PFL1315w) experimentó un rápido incremento en la abundancia de entre 16 y 20 horas, pero para la mayoría de los genes de transporte de la tasa de aumento de la transcripción nivel fue más alto, ya sea entre 20 a 24 horas ( 17 genes) o de 24 a 32 horas (siete genes).

Hay un pequeño subconjunto de los genes de transporte que tienen los perfiles de expresión que se apartan de esta tendencia. Transcripción de transporte de tres genes (PFB0275w, PFB0435c y PFI0785c) no se detectaron hasta muy tarde en el ciclo de intraeritrocitaria (en 32 horas) y alcanzó la máxima abundancia en 40-42 horas. Estos genes codifican para putativo transportistas de la droga y sus metabolitos, los aminoácidos y los azúcares, respectivamente, y su expresión selectiva en la tarde trophozoite y schizont etapas sugiere que las proteínas son necesarias para el desarrollo de fines de esquizontes y / o merozoite morfogénesis. Tal vez el más intrigante patrón de la expresión génica en el presente estudio es el de los canales de K + putativo PF14_0622. La mayoría de los genes de transporte en este estudio muestran una expresión monofásicos perfil, con un único máximo y un mínimo único, que indica que el gen se activa la transcripción de una sola vez durante la etapa intraeritrocitaria. Esto ha sido informado de que el caso de la mayoría de p. Falciparum genes expresados en el ciclo asexual de sangre [42]. Sin embargo, la expresión de los genes PF14_0622 es sorprendentemente distinta, en que el nivel de transcripción se elevó y cayó en oleadas sucesivas de aumento de la amplitud como el parásito. La importancia fisiológica de este patrón de expresión no está claro. Trabajos anteriores ha puesto de manifiesto que el momento de la expresión génica puede determinar la localización celular de la proteína resultante, cuando el antígeno de membrana apical gen-1 (AMA-1) se expresa en la tarde schizont / segmenter etapa, la proteína AMA-1 se dirige A la rhoptries (su destino normal), pero la expresión de la AMA-1 en trofozoítos de maduración y en los primeros meses de schizogony (rhoptries cuando están ausentes) en resultados AMA-1 está dirigida a la membrana plasmática del parásito, así como a una localización citoplasmática [105 ]. Por lo tanto, una posibilidad podría ser que el canal se está PF14_0622 orientados a diferentes dentro de las membranas de células parasitadas, en función del calendario de expresión.

Comparación de la p. Falciparum permeome con la de otros organismos

El 54 de transporte de proteínas que fueron originalmente identificados en el genoma de la malaria cuenta sólo aproximadamente el 1% de los genes codificados por P. Falciparum, y si bien nuestro análisis se ha incrementado en torno a ese 2,1% (109 proteínas), esta todavía es baja, incluso en comparación con otros aparentemente transportista con déficit microorganismos. Por ejemplo, el archeon Methanococcus jannaschii es en la actualidad la prokaryote con el porcentaje más bajo de las proteínas de transporte en su genoma [106], pero en el 2,4% este es aún mayor que la que se encuentra hasta la fecha en la p. Falciparum. El parásito intracelular E. Cuniculi tiene un genoma muy reducido (alrededor de 2,9 Mb [71]] y sólo el 43 codifica las proteínas de transporte [12]. Sin embargo, estas representan el 2,2% de sus genes, lo unicelulares eukaryote es también, por tanto, ligeramente más ricos que los transportistas-el parásito de la malaria. Otros genomas eucariotas tienen una mayor proporción de proteínas de transporte, por ejemplo, S. Cerevisiae (4,2%), A. Thaliana (3,2%), Drosophila melanogaster (4,6%) y Homo sapiens (alrededor de 3,4%). En el extremo superior de la gama es el E. Coli genoma, con un impresionante repertorio de los transportistas que representan el 7,1% del número total de genes [12].

La abundancia relativa de las proteínas de transporte también puede medirse en términos de la cantidad de transporte de los genes por Mb de ADN. Por el P. Falciparum este genoma es de 4,7 (frente al 2,3 estimado original de la anotación) genes por megabase de transporte, en comparación con E. Cuniculi (17,2 por Mb), S. Cerevisiae (22 por Mb) y un promedio de 36 Mb de transporte por los genes, repartidos en 18 especies de procariotas [107]. El Plasmodium catálogo de las proteínas de transporte es aún más por su escaso si se compara con el transportista ricos en genomas de E. Coli, Bacillus subtilis y el Hemophilus influenzae, que tienen 66, 63 y 52 Mb por genes de transporte, respectivamente [12]. Sin embargo, a pesar de los genomas de eucariotas superiores típicamente cientos de codificar las proteínas de transporte, ellos también tienen un bajo número de genes de transporte en relación con el tamaño del genoma (por ejemplo, A. thaliana, el 6,7 por megabase y D. melanogaster, el 5,3 por Mb). El genoma humano, que tiene el mayor número de proteínas de transporte (alrededor de 1200), tiene la menor abundancia relativa de los genes hasta la fecha el transporte (0,37 por Mb [12]].

La conclusión de que el parásito es «minimalista» con respecto a los transportistas implica que puede haber relativamente poca redundancia (es decir, el parásito tiende a no tener varios transportistas para determinados papeles). Compuestos que inhiben un solo transportista tanto, puede ser muy eficaz como contra la malaria, como el parásito es poco probable que los transportistas han alternativa que es capaz de utilizar con el mismo fin.

El trabajo futuro

Si bien el análisis del presente informe se ha incrementado significativamente el número de proteínas de transporte previsto que se presente en P. Falciparum es muy probable que más parásito de las proteínas codificadas de transporte aún no se han descubierto. Nuestros criterios de búsqueda estaban orientadas a la identificación de los transportistas con siete o más TMDs; sin embargo, muchos de los polipéptidos que forman canales poseen menos de seis TMDs y varios tipos de transportistas también contienen menos de seis TMDs. El hecho de que el parásito tiene tres canales putativo (PFL1315w, PF14_0342 y PF14_0622) indica que este tipo de transporte son las proteínas presentes en la p. Falciparum genoma. La aplicación de la metodología utilizada aquí para proteínas que poseen un número menor de seis o TMDs es probable que identificar otras proteínas de transporte.

La identificación de los genes y la predicción de las estructuras de exón-intrón en la p. Falciparum genoma todavía se están perfeccionando. Por una serie de proteínas de transporte sido objeto anteriormente había inapropiado predicciones para el 5 '/ 3' extremos y / o fronteras exón-intrón (por ejemplo, PF14_0387, PFI1295c, PF10_0360, PF10_0215), y lo más probable es que esto dio lugar a su Que se pasaran por alto en el proceso de anotación original. Posteriores revisiones de los datos del genoma, utilizando las últimas herramientas de investigación genética, la genómica comparativa y la integración de larga duración y la proteómica cDNA secuencias de datos, se mejorará en gran medida la actual anotación del genoma y esto, a su vez, es probable que lleve a Nuevas adiciones a la p. Permeome falciparum.

Materiales y métodos
La identificación de las proteínas de transporte de membrana putativo

Un archivo que contiene las secuencias de aminoácidos de las proteínas de todos predijo el genoma se obtuvo de la base de datos del genoma oficial Plasmodium, PlasmoDB [108, 109]. Polipéptidos con siete o más TMDs fueron recuperados de este conjunto de datos utilizando un programa informático descrito anteriormente [9]. En pocas palabras, en un proceso automatizado, cada polipéptido secuencia se convierte en una hydropathy parcela y el número de picos, correspondientes a TMDs putativo, que se detectó. Las proteínas que cumplen los criterios de búsqueda (los que tienen entre 250 y 5000 los residuos de largo y con siete o más TMDs; véase el archivo de datos adicional 10 para más detalles) fueron recuperados, y duplicar las secuencias fueron retirados.

TTM-La herramienta de búsqueda basada en PlasmoDB se utilizó para la búsqueda de nuevas proteínas de membrana putativo. En estos análisis, ya sea la TMHMM2 o TMpred algoritmos fueron utilizados para una búsqueda de proteínas que poseen 7-25 TMDs. La lista de las proteínas recuperado por el TMHMM2 y TMpred se comparó con los programas que ya se recuperan con el programa original, y si bien hay algunas proteínas que el programa original había recuperado y había PlasmoDB no, y viceversa, los resultados fueron en su mayoría en el acuerdo . Las proteínas adicionales identificados en PlasmoDB se incluyeron en los posteriores estudios de anotación.

Anotación de las proteínas

Una combinación de herramientas de la bioinformática se utiliza para asignar funciones a la putativo (probable) proteínas de membrana recuperados de la parcela hydropathy análisis. Cada secuencia se preguntó en contra de la base de datos NCBI nonredundant proteína (utilizando BLASTP [110]] y el dominio de la base de datos Entrez Conservadas (utilizando invertir posición específica BLAST [111]] con el fin de determinar su relación con otras proteínas. Los valores presentados en el archivo de datos adicional 1 son de los análisis llevados a cabo en el segundo semestre de 2003. En algunos casos, sólo existe una débil similitud entre la p. Falciparum Conservadas proteína y un dominio de la base de datos de entrada y / o el más cercano (no Plasmodium yoelii) BLASTP homólogo. Para estos casos, la posibilidad de un ancestro común entre el Plasmodium proteína y de las proteínas de otros organismos se estudiarse más a fondo por la realización de varias repeticiones de un PSI-BLAST [112] búsqueda de la base de datos NCBI. La comparación de ambos secuencia de la proteína y predecir la estructura secundaria (véase más adelante) se utilizaron para evaluar los modelos de suplentes para cada gen, en varios casos se llegó a la conclusión de que un gen de predicción que no sea el "oficial" de un modelo más probable candidato proteína. Cuando proceda, P. Falciparum proteínas se colocaron en el transporte de proteínas conocidas familias de acuerdo con el sistema de clasificación oficial de transporte [10].

Estructura secundaria predicciones

Relacionado transportistas (que comprende una familia de proteínas) muestran marcadas similitudes en sus estructuras secundarias predicho, aun cuando comparten un nivel relativamente bajo de homología de secuencia [113]. El hydropathy parcela de cada p. Falciparum proteína se comparó con la de sus homólogos BLAST para investigar si la secuencia homologías observadas correspondieron a la similitud en las estructuras pronosticado de las proteínas. Este análisis es de especial ayuda cuando la secuencia similitud compartida por dos proteínas es débil; un buen acuerdo entre sus respectivas estructuras secundarias añade soporte a la hipótesis de que estas proteínas comparten una función similar. También sirve para identificar a los p. Falciparum putativo de los transportistas que están trucados o fusionados a proteínas de los genes adyacentes como resultado de errores en la predicción de genes de las estructuras. El número y la disposición espacial de la membrana putativo-que abarca los dominios en un polipéptido se predijo usando TMpred [114] y TMMHM v2.0 [115].

Construcción de alineamientos

El programa ClustalW [116] en MacVector 7,1 se utilizan para generar y editar todos los alineamientos. Alineaciones se convirtieron a formato PDF y compilado en Adobe Photoshop 6.0.1. De longitud completa de las versiones alineaciones presentadas o mencionadas en este documento están disponibles en los autores que lo soliciten.

Preparación de p. Falciparum-glóbulos rojos de la sangre infectados

Humanos de los glóbulos rojos (tipo O +) infectados con P. Falciparum (cepa FAF6) se cultivaron tal y como se describe anteriormente [74] utilizando un método aprobado de Trager y Jensen [117]. El hematocrito se mantuvo en el 4% y la parasitemia en 13-16%. Perfectamente sincronizado culturas fueron alcanzados por las reiteradas solicitudes de sorbitol lisis [118] durante un período de 9 días de duración inmediatamente antes de comenzar la extracción de RNA. Células se hicieron utilizando una cámara de recuento Neubauer mejorado tanto la cultura y la parasitemia y el parásito etapa de crecimiento fueron evaluadas por metanol-fijo, Giemsa de frotis teñidos de sangre. Fotografías de los frotis de sangre se tomaron con una cámara SPOT RT color conectada a un microscopio Leica LMD y las imágenes de parásito de los glóbulos rojos infectados fueron compilados en Adobe Photoshop 6.0.1.

Aislamiento de RNA total

Se recogieron muestras de la cultura en nueve etapas a lo largo de un solo ciclo de crecimiento intraeritrocitaria del parásito y ARN total fue extraído utilizando el kit NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel), de conformidad con el "protocolo de alto rendimiento de los suministrados por el fabricante. Este procedimiento se informó a la recuperación de 90-100% de la ARN vinculado a la columna y en el control de los experimentos en los que tan poco como 200 ng de ARN se cargaron en una columna nos confirmó que éste sea el caso (datos no presentados). NucleoSpin Una columna puede obligar a un máximo de 100 μ g de ácido nucleico y de los fabricantes recomiendan que no más de 10 9 células deberían cargarse por columna; exceda de esta cantidad puede causar obstrucción de la columna, dando lugar a ARN pobres rendimientos. Sin embargo, aproximadamente el 85% de las células en un parásito cultura son maduros glóbulos rojos humanos, que carecen de un núcleo o de otros orgánulos y no producen los ácidos nucleicos. Por ello, investigó qué cantidades de parásitos infectados por el cultivo de las células rojas de la sangre podría ser cargada en una columna sin comprometer el rendimiento del ARN. Los primeros experimentos reveló que trophozoite etapas contener parásitos considerablemente mayores cantidades de ARN y ADN de las menos maduras anillo etapas parásitos. Se determinó que la etapa de anillo-parásitos, los aumentos en la muestra de células del 9 × 10 6 (6 × 10 7 incluidos los glóbulos rojos de la sangre no infectada) a 9 × 10 7 (6 × 10 8), e incluso hasta 2,7 × 10 8 (1,8 × 10 9), todavía dio proporcionadas aumentos en el rendimiento de RNA, lo que indica que la capacidad de unión de la columna no es superado dentro de este rango. Por trofozoítos maduros, sin embargo, la relación entre el tamaño de la muestra de células y la cantidad de ARN extraído no lineal cuando se convirtió en más de 6 × 10 7 (4 × 10 8) se aplicaron a células de la columna. Las cantidades de parásitos a partir de la cual se extrajo el RNA (por columna) son los siguientes: ring-etapa, 1,3 × 10 8 parásitos (8,7 × 10 8 células no infectadas incluidos en el total de glóbulos rojos); anillo etapa tardía o principios de trophozoite, 8,8 × 10 7 parásitos (5,86 × 10 8 celdas en total) y maduro trophozoite / schizont, 4,4 × 10 7 parásitos (2,93 × 10 8 celdas en total). La cantidad de ARN extraído de la primera vez, el punto (~ 4 h después de la invasión) fue extremadamente baja (<0,3 μ g/10 8 parásitos) y la insuficiente para justificar la inclusión de esta muestra en el posterior análisis de la expresión génica.

Transcripción reversa

CDNA fue sintetizado de 2 μ g de ARN total (sin ADN) a través de SuperScript II RNasa H - la transcriptasa reversa (Invitrogen). Primer capítulo de síntesis se cebados con Oligo-dT (Invitrogen) y la relativa dNTP concentraciones fueron ajustados para reflejar el AT-sesgo de p. Falciparum ADN (40% dATP, dTTP 40%, 10% dCTP, dGTP 10%). El disacárido trehalosa se añadió a la reacción (0,6 M) para mejorar la eficiencia de la transcripción reversa. La acción de la trehalosa es doble: se estabiliza, e incluso se activa, la proteína de la transcriptasa inversa en inusualmente altas temperaturas, y las regiones de estructura secundaria en la transcripción (que, de otra causa la disociación prematura de la enzima) son reducidos o eliminados por ambas trehalosa y El aumento de la temperatura de la reacción [119]. Condiciones de reacción fueron las siguientes: 42 ° C durante 30 min, 60 º C durante 1,5 horas, y luego de 70 ° C durante 15 min para inactivar la transcriptasa inversa.

PCR

Los cambios en los niveles de mRNA de sangre en toda la fase asexual del parásito de 34 demostrado / putativo de transporte semi-genes fueron cuantificados por dos fases de RT-PCR utilizando los principios desarrollados por Halford y colegas [120, 121] y Fuster et al. [122 ]. Como se ha descrito anteriormente, el importe total de ARN en la célula aumenta significativamente a medida que el parásito alcanza la madurez (véase la figura 3 para el análisis cuantitativo). Por este motivo, para cada punto del tiempo, la cantidad de cDNA añadido a la normalización de la PCR fue a la celda y no al número total de ARN (ver Discusión).

PCR se realizó a través de Platinum Taq ADN polimerasa PCRx Kit (Invitrogen). Cada reacción tiene un volumen final de 50 μ l y consistió en: 1x PCRx amplificación de amortiguación, 1x PCR potenciador solución, 1,5 mM MgSO 4, dNTPs (320 μ M dATP, 320 μ M dTTP, 80 μ M dCTP y 80 μ M dGTP), 1,25 U Platinum Taq ADN polimerasa, 2 μ M de cada primer y 5 μ l cDNA de la plantilla (a una dilución adecuada). Las muestras fueron amplificadas en un MJ Research PTC-200 Peltier termociclador y 20 μ l de cada reacción fue cargado en un 1% (w / v) gel de agarosa al 0,5 μ g de bromuro de etidio / ml. Electroforesis se llevó a cabo a 70 V de exactamente 90 minutos en un sistema de separación Owl B2. En otro de gel, un duplicado alícuota de 20 μ l de cada reacción fue cargado (en orden inverso) electrophoresed y de la misma manera. Productos de la PCR se visualizaron con un Transiluminador con luz UV y los geles fueron fotografiados utilizando un Gel Doc Sistema de cámara de televisión conectada a un ordenador que funciona con el software Image NIH. Densitométrica análisis de las imágenes de gel se realizó mediante ImageQuant V3.3 software (Molecular Dynamics).

Halford et al. [120] han demostrado que en una PCR, donde la concentración de la plantilla es la limitación de la amplificación y de los dímeros-primer ocurre, el rendimiento del producto depende de que el logaritmo de la plantilla de cDNA de entrada, incluso después de 35 ciclos de amplificación . Además, esta relación es válida a partir de la más baja concentración de la plantilla que da un rendimiento detectables, a sumas que no a por lo menos 100 veces (y hasta 1000 veces) mayor que esta concentración. Un PCR preliminar reveló que la cantidad de producto sintetizado de trophozoite etapas cDNA varió entre los 34 genes - un reflejo, tal vez, de las diferencias entre los niveles de transcripción de estos genes, las diferencias en el primer eficiencia, o las diferencias en la eficiencia en la que un determinado transcripción Especies se transcribe invertir en cDNA. Un subconjunto de seis genes, representante de esta gama de productos PCR en el rendimiento, se seleccionó para su inclusión en un experimento destinado a establecer un conjunto de condiciones en las que, para cada gen y cDNA muestra, el rendimiento final del producto de PCR fue proporcional a la cantidad CDNA a partir de la plantilla. En resumen, cDNA de anillo (~ 20 h de edad), trophozoite (~ 32 h de edad) y schizont etapas (~ 42 h de edad) los parásitos se diluye en serie y los rendimientos producto de PCR se midieron después de 15, 20, 25 o 30 ciclos de Amplificación. Se constató que la utilización de una elevada dilución de cDNA (equivalente a alrededor de 3,8 × 10 4 parásitos por 50 μ l PCR), y durante 25 ciclos de amplificación, dio lugar a una relación proporcional entre la concentración de entrada de cDNA y el rendimiento del producto de PCR La mayoría de los genes y de cDNA muestras (datos no presentados). Sin embargo, para un pequeño subconjunto de los genes (PFA0245w, PFC0530w, PFE0775c, PFE1455w, PFI0720w, PF11_0334, PFL0420w, PF14_0622), estas condiciones no se han traducido en cantidades de producto que puede ser medido por densitometría y fiable estos genes necesarios otros cinco rondas Antes de la amplificación de los rendimientos podría ser medido con fiabilidad y los resultados fueron reproducibles. Las reacciones en cadena de la polimerasa fueron ciclos térmicos de la siguiente manera: 94 ° C por 2 min, luego 25 o 30 de 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 68 ° C durante 45 segundos.

La ausencia de contaminación de DNA en el RNA de muestras fue verificada por la falta de productos PCR formado en las reacciones (30 ciclos) llevado a cabo por cada primer conjunto utilizando ARN como la plantilla (es decir, "menos RT 'controles).

La extracción de RNA de los parásitos durante el ciclo de crecimiento intraeritrocitaria se realizó dos veces (4 meses de separación) y se analizó la expresión de los genes dentro de un tiempo. PCR rendimientos producto para un determinado gen se presentan como una proporción de la señal para medir el punto de tiempo específico, dividido por el tiempo de que el punto que dio el mayor rendimiento del producto. Ratios de geles replicar de la misma fueron un promedio de PCR y los datos de tiempo 1 y 2 (cada una de ellas de, al menos, n = 2 reacciones en cadena de la polimerasa) se combinaron para dar la media ± error estándar. Cada 50 μ l de PCR contenía una cantidad de cDNA equivalente a alrededor de 3,8 × 10 4 parásitos y se midieron los rendimientos producto de 2 × 20 μ l alícuotas de la reacción. Así, en este estudio, el nivel relativo de transcripción en cada etapa de crecimiento se estima de unos 1,5 × 10 4 células parasitadas.

Primers

Oligonucleótidos que amplifican un producto de aproximadamente 400 bp de cada una transcripción de interés fueron diseñados utilizando Primer3 [123]. Estos fueron sintetizados por Invitrogen y para cada primer par, la identificación de genes, primer secuencias, y el tamaño del producto se ofrecen datos adicionales en el archivo 10.

Adicional de los archivos de datos

Los siguientes datos adicionales están disponibles con la versión en línea de este documento. Archivo de datos adicionales 1, 2 y 3 contienen los cuadros que resumen la conocida putativo y transporte de proteínas p. Falciparum. Datos adicionales archivo 4, 5, 6, 7, 8 y 9 contienen proteína de la secuencia de alineaciones; adicional archivo de datos contiene 10 métodos complementarios.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Secuencia de las proteínas que comparten similitudes con conocidos o putativo de transporte de proteínas y / o dominios conservados de las familias de proteínas de transporte
Archivo Adicional 2
Las proteínas que están relacionados con los hipotéticos proteínas' de otros organismos y se han previsto estructuras secundarias que se asemejan a los de transporte caracterizado proteínas, pero que no comparten similitudes con la secuencia conocida o putativo de transporte de proteínas y / o dominios conservados de las familias de proteínas de transporte
Archivo Adicional 3
Plasmodium
Específicas de las proteínas que tienen la (prevista) características estructurales de un transportista, pero que, además de fuertes similitudes a la hipotética secuencia de las proteínas de otros
Plasmodium
Especies, no muestra ninguna similitud con las proteínas o dominios conservados en las bases de datos actuales
Archivo Adicional 4
La región más TMDs 1-5 de la alineación se muestra. Las secuencias están separadas en grupos de secuencias relacionadas con el bien y se agrupan como subfamilias de la MFS.
P. falciparum
Son secuencias de la proteína en caja y designaciones de relieve. Para las proteínas de otros organismos, la adhesión NCBI (gi) y el número de conocidos o putativo (p), la especificidad por el sustrato de los transportistas se dan. En algunas proteínas, una o varias de las regiones extramembrane bucle se han truncado y esto se indica por una línea sólida negro. Los residuos son la sombra de la siguiente manera: carga positiva, de color azul; carga negativa, de color rojo; hydoxyl, naranja; amido, gris; prolina, verde; cisteína, púrpura; histidina, mitad azul; glicina, la luz azul; tirosina y triptófano, de color verde oliva; restantes Nonpolar, amarillo
Archivo Adicional 5
Ambas familias son transportista alejadas a la MFS. La región más TMDs 2-5 y TTM 8 de la organoclorados transportador de aniones familia alineación se muestra. La región más TMDs 3-5 y TTM 10 de la folato-biopterin transportador de la familia se muestra la alineación. Según la leyenda, tal como se describe más datos para el archivo 4
Archivo Adicional 6
(A) Hydropathy parcelas de dos representantes de la novela putativo transportador de la familia: la PFI0720w y PFC0530w proteínas. Los dos perfiles son muy similares y en cada uno, hay 12 picos en claro hidrofobicidad, correspondiente al 12 de TMDs. Una topología de 12 TMDs separados, por un largo extramembrane bucle, en dos series de 6 espaciados TMDs es característico de los transportistas de la MFS. (B) La alineación de los cinco
P. falciparum
Novela putativo transportistas. La región más TMDs 2-3 y 8-9 de TMDs la alineación se muestra. MFS miembros de la familia suelen poseer un aminoácido conservado TMDs motivo entre 2 y 3 y el correspondiente motivo, pero menos conservadas en el bucle correspondiente en la segunda mitad de la proteína (TMDs entre 8 y 9). La novela putativo transporte proteínas también parecen contener estos motivos específicos de MFS TMDs entre 2 y 3 y, en menor medida, entre TMDs 8 y 9. Por comparación, MFS motivos específicos de una amplia gama de conocidos y putativo MFS proteínas se presentan. Según la leyenda, tal como se describe más datos para el archivo 4
Archivo Adicional 7
La región más TMDs 1-5, TTM TTM 7 y el 10 de la alineación se muestra. Las secuencias están separadas en dos grupos, uno con vegetales y proteínas de los insectos y los otros protozoos, levaduras y proteínas de mamíferos. El PFL0420w y PFL1515c proteínas parecen estar más estrechamente relacionados con el primer grupo de los transportistas, mientras que la MAL6P1.133 es más similar a este último. Según la leyenda, tal como se describe más datos para el archivo 4
Archivo Adicional 8
La región más TMDs 1-3 y TMDs 6-10 de la alineación se muestra. Las secuencias están separadas en dos grupos, uno con proteínas conocidas para el transporte de neurotransmisores, la creatina o taurina, y las otras proteínas conocidas o de la hipótesis para el transporte de aminoácidos. El
P. falciparum
Proteínas han divergido considerablemente de los otros miembros de la familia, pero son tal vez lo más similar a la secuencia de transportadores de aminoácidos. Según la leyenda, tal como se describe más datos para el archivo 4
Archivo Adicional 9
La región más TMDs 2-6 de la alineación se muestra. Las direcciones de la 'tensión de sensor "y" selectividad secuencia' se indican. Según la leyenda, tal como se describe más datos para el archivo 4
Archivo Adicional 10
Métodos adicionales
Agradecimientos

Damos las gracias a Richard Allen y Stefan Bröer útil para los debates y la Subdivisión de Canberra de la Cruz Roja Australiana de Sangre de servicios para el suministro de sangre. Esta labor fue apoyada por el Consejo de Investigación Australiano (DP0344425) y Salud Nacional de Australia y el Consejo de Investigación Médica (Grant ID 179804).