Genome Biology, 2005; 6(4): R36-R36 (más artículos en esta revista)

Genómica cuantitativa de la resistencia a la inanición estrés en Drosophila

BioMed Central
Susan T Harbison (sth@mail.med.upenn.edu) [1], Sherman Chang (schang@diversa.com) [3], Kim P Kamdar (kkamdar@MPMCapital.com) [3], Trudy FC Mackay (trudy_mackay @ Ncsu.edu) [1]
[1] Department of Genetics, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695, USA
[2] WM Keck Center for Behavioral Biology, North Carolina State University, Raleigh, NC 27695, USA
[3] El Instituto de Investigación Torrey Mesa, 3115 Merryfield Row, San Diego, CA 92121, EE.UU.
[4] Current address: Department of Neuroscience, University of Pennsylvania Medical School, Philadelphia, PA 19104, USA

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Resumen

La eficacia de la transcripción de perfiles para la identificación de redes de regulación de genes pleiotrópicos complejo rasgos se evaluó. La respuesta transcripcional a la inanición estrés en hombres y mujeres de la Oregon y R-2b Drosophila cepas, así como cuatro líneas puras recombinante derivado de ellas, se muestra a la diferencia entre los sexos y lograr la participación de aproximadamente el 25% del genoma.

Antecedentes

Los caracteres que afectan a la morfología, fisiología, comportamiento, la susceptibilidad a la enfermedad y la aptitud reproductiva están controladas por la interacción de múltiples genes cuyos efectos están condicionados a la genética, sexual y entornos externos [1]. Los avances en la medicina, la agricultura, y una comprensión de la evolución de adaptación dependerá de descubrimiento de los genes que regulan estos rasgos complejos, y la determinación de la genética molecular y propiedades de los alelos en loci que causan la separación de la variación genética en las poblaciones naturales. La evaluación de los efectos sutiles de mutaciones inducidas por el rasgo cuantitativo fenotipos en organismos modelo es un método sencillo para identificar los genes que regulan los rasgos complejos [1 - 3]. Sin embargo, el gran número de posibles mutaciones para evaluar, la necesidad de inducir mutaciones en un fondo común puras, y el nivel de replicación necesarios para detectar de manera muy sutil, [1] todos límite de la viabilidad de la sistemática de todo el genoma de mutagénesis para pantallas de rasgos complejos en Eucariotas superiores. Cartografía trait loci cuantitativo (QTL) que afectan a la variación en los rasgos complejos a grandes regiones genómicas por vinculación a marcadores moleculares polimórficos es también sencilla. Sin embargo, nuestra capacidad para determinar lo que los genes en las regiones QTL causa de la variación rasgo se ve obstaculizada por el gran número de recombinantes necesarios para la cartografía de alta resolución, y de la pequeña y ecológicamente sensibles efectos de alelos QTL [1, 4].

Se ha producido una gran emoción recientemente acerca de la utilidad de todo el genoma-transcripcional de perfiles para identificar genes que regulan los rasgos complejos, mediante la evaluación de los cambios en la expresión génica en el fondo de las mutaciones que afectan el único rasgo [5, 6], entre las líneas seleccionadas para diferentes fenotípica Valores de la característica [7], y en respuesta a la tensión ambiental y el envejecimiento [8 - 12]. Transcripción abundancia es también un rasgo cuantitativo para los que existe una variación considerable entre las cepas de tipo salvaje [11, 13 - 17], y para los que la expresión QTL (eQTLs) [18] han sido cartografiados [15 - 17, 19]. Por lo tanto, genes que afectan a la variación en los rasgos cuantitativos fenotipos son aquellos para los que el mapa de posiciones rasgo QTL y eQTL coinciden [16, 20].

Transcripción de perfiles típicamente implica cientos de miles de genes en la regulación de los rasgos cuantitativos y de los rasgos asociados con la variación entre las cepas, la mayoría de estos genes son computacionalmente predijo genes que no se han comprobado experimentalmente. ¿En qué medida los cambios en la abundancia de transcripción predicado efectos de mutaciones inducidas y variantes alélicas entre cepas de fenotipos cuantitativos rasgo? Es alentador que varios estudios han confirmado los efectos fenotípicos de las mutaciones en los genes implicados por los cambios en la expresión [5 - 7]. Sin embargo, un número limitado de genes que se pusieron a prueba, y su elección no fue imparcial. Ninguno de los candidatos propuestos por los QTL transcripcional de perfiles ha sido validada de acuerdo con los rigurosos estándares necesarios para probar que alguno de los candidatos corresponde a un gen QTL [1, 4]. Para comenzar a responder esta pregunta, es necesario comparar los datos de expresión génica de los genes conocidos por afectar el carácter independiente de mutagénesis QTL y estudios de cartografía. Esta comparación no ha sido posible hasta la fecha ya que hay sólo unos pocos rasgos complejos en los que la arquitectura genética que se conoce a este nivel de detalle, una de las cuales es la resistencia a la inanición estrés en Drosophila.

Anteriormente, P-elemento utilizado en una mutagénesis isogénicas de antecedentes para identificar 383 genes que afectan a la tolerancia en la inanición D. Melanogaster [21]. Además, estudiamos QTL que afectan a la variación de la resistencia a la inanición entre dos cepas isogénicas Drosophila, Oregon-R (Ore) y 2b [21], seguida por los ensayos de complementación de las mutaciones para identificar los genes que afectan a doce candidatos variación de la resistencia a la inanición entre estas cepas [21] . En este sentido, Affymetrix Drosophila GeneChips utilizado para examinar los perfiles de expresión de dos resistentes a la inanición y dos inanición sensibles recombinantes puras (RI) de líneas, así como las líneas parentales Ore y 2b, bajo condiciones normales de condiciones de estrés y la inanición. Se utilizó un análisis estadístico riguroso para identificar genes cuya expresión se modificó entre los sexos, durante la hambruna de tratamiento de estrés, entre líneas, y las interacciones entre estos efectos principales. En la comparación de perfiles de expresión de la P-elemento mutagénesis realizados anteriormente, se encontraron cerca de 50% de concordancia entre los efectos de la P-160 mutaciones elemento en la resistencia a la inanición el estrés y los cambios en la expresión génica durante la hambruna - 77 mutaciones con efectos significativos también tuvo importantes Cambios en la abundancia de transcripción, mientras que 83 mutaciones no afectaba a la inanición fenotipo de resistencia, pero había cambios significativos en el nivel de transcripción. Se identificaron 153 nuevos genes candidatos para la que hubo variación en la expresión de genes entre líneas y que co-localizado con la resistencia a la inanición QTL. Sin embargo, no detectar la variación genética en la expresión de cualquiera de los genes candidatos identificados por pruebas de complementación. Nuestros esfuerzos para asociar la variación genética en la expresión con la variación en los rasgos cuantitativos fenotipos es confundida por la observación de una amplia regulación de la transcripción por la abundancia de que los genes, la dificultad en la detección de transcripciones poco comunes que pueden ser expresados en sólo unos pocos tipos de células en un determinado período de Desarrollo, y la variación genética entre los alelos QTL que no está regulada a nivel de transcripción.

Resultados
El sexualmente dimorfo transcriptome

Cerca de la mitad del genoma (6569 sonda fija) exhibieron significativamente diferentes niveles de transcripción entre los sexos (P (Sexo) <0,001), con 3965 establece upregulated sonda en el sexo femenino y 2604 la sonda fija upregulated en hombres (la lista completa se da Datos adicionales en el archivo 1). Las mayores diferencias en la abundancia de transcripción entre los sexos para la sonda se establece implicados en el sexo-específicas funciones: corion, membrana vitelino, yema de huevo y las proteínas implicadas en la producción de huevos se upregulated en las mujeres, y las glándulas accesorias péptidos, masculino específicos de ARN, y proteínas ejaculatory Bulbo componentes se upregulated en varones. Sin embargo, la sonda fija exhibir dimorfismo sexual en la expresión se redujo en 28 y 41 procesos biológicos moleculares función Gene Ontología (GO) categorías; para la mayoría de estas categorías, las diferencias de expresión entre los sexos fue inesperada. Se determinó que las categorías que figuran GO significativamente diferentes números de upregulated sonda fija en hombres y mujeres (Tabla 1]. Los genes que participan en el proceso biológico categorías de la comunicación celular, el crecimiento celular y / o mantenimiento, el desarrollo y la muerte celular se upregulated con más frecuencia en mujeres que en hombres. Los genes que participan en la función molecular de las categorías vinculante, la mayoría de las enzimas, la transducción de señales, moléculas estructurales, y la regulación de la transcripción y la traducción se upregulated con más frecuencia en las mujeres que en los varones, sin embargo, genes que codifican enzimas oxidoreductase, transportista transportistas y transportadores de iones se upregulated en Los hombres con más frecuencia que en las mujeres (Tabla 1].

La genómica distribución sesgada de sexo-genes no era aleatoria (Figura 1]. Hay una escasez de hombres sesgada genes en el cromosoma X y cuarto, y un exceso en el cromosoma 2R2 5 = 100,77; P <0,0001). Hubo un déficit de mujeres que son sesgadas genes en el cromosoma 4, y un exceso en el cromosoma 2R2 5 = 29,18; P <0,0001).

Transcripcional respuesta a la inanición estrés

Hemos encontrado 3451 con sonda fija significa transcripción significativamente diferente entre los niveles de hambre y condiciones de control (P (tratamiento) <0,001): 1736 se downregulated (algunos de hasta 40 veces) y 1715 fueron upregulated (en la mayor parte del 7,2 - Veces) durante la hambruna (la lista completa está disponible como archivo de datos adicionales 2). Estos conjuntos de la sonda cayó en 24 procesos biológicos y moleculares función GO 25 categorías. Se determinó que las categorías GO tuvo un número significativamente diferentes de los de arriba y downregulated sonda fija en respuesta a la inanición estrés. Los genes que afectan a los procesos biológicos de proteínas y el metabolismo de los ácidos nucleicos-(biosíntesis de proteínas; catabolismo proteico, plegables, localización, modificación y reparación; biosíntesis de las macromoléculas de ácidos nucleicos y lípidos) se upregulated durante la hambruna (Tabla 2]. La expresión de los genes en tres categorías de función molecular (nucleótidos vinculante, hidrolasas vinculante para anhídridos de ácido, y la estructura de los ribosomas) aumentó durante la inanición, mientras que la defensa y la inmunidad proteínas, peptidasas, cutícula proteínas estructurales, y en el carro de transporte se downregulated proteínas (Cuadro 2].

El tratamiento del sexo × plazo interacción fue significativa (P <0,001) para la sonda de 817 conjuntos, 715 de las cuales tenía una participación importante en los efectos del tratamiento de uno o de ambos sexos en el análisis por separado del sexo (archivo de datos adicional 3). Hemos clasificado estos 715 sonda fija como sexo-específicas en caso de cambios significativos expresión en respuesta a la hambruna se produjo en un solo género, como el sexo-sesgada si los niveles de expresión cambiado en la misma dirección en ambos sexos, pero son de diferente magnitud, o como el sexo - Si los niveles de expresión antagónica cambiado de manera significativa en ambos sexos, pero en direcciones opuestas (figura 2a-c]. La mayoría de conjuntos de sonda exhibido sexo-sexo-específicas o parciales de expresión, con sólo dos genes, CG14095 y Rpd3, reunidos en el sexo-antagonistas criterio. Más sonda fija exhibiendo el sexo-sexo-específicas o parciales expresión se downregulated (454) que upregulated (263) durante la inanición. Inanición estrés fue acompañada por la reducción de la expresión de genes implicados en los procesos de desarrollo de la gametogénesis y el sexo, así como la determinación de transducción de señales en las mujeres, y de los genes que participan en mechanosensory y comportamiento reproductivo en los hombres (Cuadro 2].

Transcripción frente a la abundancia de mutaciones

Los genes representados por sonda fija con un peso significativo en el tratamiento y / o tratamiento de sexo × efectos son genes candidatos para la resistencia a la inanición. Anteriormente, hemos examinado 933 co-P-isogénicas único elemento de inserción de las líneas de su efecto sobre la resistencia a la hambruna [21]. De estas inserciones, 383 tenían efectos significativos sobre la resistencia a la inanición, mientras que los restantes 550 no [21]. De las 933 líneas, sabemos la localización de las 385 de las inserciones de genes etiquetados, y que por estas inserciones están representados en la matriz. Por lo tanto, podemos comparar directamente la medida en que los efectos de la P-elemento mutaciones en el hambre fenotipo corresponden a los cambios en la abundancia de transcripción en respuesta a la inanición. Esta comparación nos permite evaluar la hipótesis de que los cambios en la abundancia de transcripción puede utilizarse para identificar genes candidatos con efectos en el fenotipo, una hipótesis implícita en anteriores estudios de microarrays [5 - 7]. En general, no hubo asociación estadística entre la fenotípica y transcripción de datos (χ 2 1 = 0,0006, p = 1). Para 194 genes, hubo acuerdo entre el fenotipo y el nivel de expresión. Setenta y siete genes había diferencias significativas en ambos transcripción perfil y fenotipos mutantes, y 117 genes afectados ni el fenotipo, ni el nivel de expresión (archivo de datos adicional 4). Hubo desacuerdo entre la expresión fenotípica y análisis de 191 genes (49,6%): 108 de los genes etiquetados por P-elementos afectados hambre resistencia, pero no se ha mostrado diferencias en el nivel de transcripción en respuesta a la inanición estrés, y P-elemento inserciones en 83 genes que mostraron una diferencia significativa en la transcripción en respuesta a la inanición no tenía efectos significativos sobre la hambruna fenotípica tolerancia (archivo de datos adicional 4).

La arquitectura de la transcripción genética

Un total de 706 conjuntos de sonda exhibió variación en la expresión entre los seis líneas de 640 conjuntos de la sonda fueron significativas (P <0,001) para el efecto principal de la línea, 190 × línea de la interacción sexual, 200 de la línea de tratamiento × interacción, y 85 de la interacción de tres vías de la línea sexo × × tratamiento (archivo de datos adicional 5, y Figura 2d-k]. Así, la abundancia de transcripción exposiciones tanto genotipo por sexo y la interacción genotipo x ambiente.

Se utilizó post-hoc de Tukey pruebas de que en el grupo de líneas con niveles similares de la expresión genética, y la expresión en comparación con los grupos de minerales y 2b genotipo de las seis líneas. Hay tres escenarios posibles por los que la variación genética en la abundancia de transcripción pudiera surgir. En primer lugar, la variación genética en las regiones reguladoras de un gen provoca variación en la expresión de un gen (cis-regulador actuando variación). En segundo lugar, la variación genética en la regulación del gen B causas de variación en la expresión de A, que es en sí misma no genéticamente variable (trans-actuando de regulación de variación). En tercer lugar, la variación genética en ambos genes A y B de genes afectan a la abundancia de transcripción de genes A (cis - y trans-actuando de reglamentación variación). Estos dos locus interacciones podría ser aditivo o epistatic. Observamos o no expresión de un gen co-segrega con marcadores de la diferenciación de las dos cepas parentales. Co-segregación siempre será observado en el caso 1. Se observó en los casos 2 y 3 si gen B está estrechamente vinculada a un gen, por ejemplo, que no es separado por la recombinación de genotipos A en la prueba. Sin embargo, co-segregación no se observó si los genes A y B de genes son disociados. La observación más prevalente fue la regulación de expresión de genes disociados. Por ejemplo, hubo la interpretación inequívoca de la sonda 246 establece que son significativas para el efecto principal de la línea única: 65 (26,4%) fueron regulados por genes ligados y 181 (73,5%) fueron reguladas por los genes disociados (archivo de datos adicional 6, y Figura 2l-o]. También inferir la vinculación de los genes que regulan la expresión bajo control los niveles de hambre y condiciones por separado. Hubo interpretaciones inequívocas Tukey para 277 conjuntos de la sonda bajo control de las condiciones, de los cuales 32 exhibió variación reglamentarias vinculadas (11,6%) y 245 eran regulados por la variación en los genes disociados (88,4%). Por 244 sonda fija en virtud de las condiciones de hambre, 46 se rigen por el polimorfismo en los loci ligados, (18,9%) y 198 eran regulados por la variación en los genes disociados (81,1%) (archivo de datos adicionales 7).

Asociación de diferencia en la transcripción genética con QTL

Probe conjuntos de la ANOVA de tres vías que son significativas para el efecto principal de la línea y / o línea de sexo × (P <0,001), pero no significativo para la línea de tratamiento × términos de interacción, muestran la variación genética en la transcripción de las seis líneas Que es independiente de la inanición tratamiento. Un total de 489 conjuntos de la sonda cumplen estos criterios, y sabemos que la citología de 475 ubicaciones de los genes correspondientes. Anteriormente, RI líneas derivadas de Ore y 2b se han utilizado para levantar mapas QTL que afectan a la variación en el período de vida [22 - 25], sensoriales cerda número [26], ovariole número [27], el cortejo señal [28], el comportamiento olfativo [29] , El metabolismo y la de vuelo [30], así como la resistencia a la hambruna [21]. Los genes que presentan diferencias significativas para el efecto principal de la línea y / o línea × sexo que se encuentran dentro de las regiones QTL se putativo genes candidatos correspondientes a los QTL [16, 20]. Se identificaron varios genes candidatos novela putativo que afectan a estos rasgos (archivo de datos adicional 5). Hemos examinado si la sonda con una importante línea fija y / o línea de sexo × efectos tienden a agruparse dentro de las regiones que contienen el mapa QTL bajo condiciones estándar de la cultura, como sería el caso si QTL regiones fueron enriquecidos transcripcional de genes que muestran variación entre las líneas parentales. No se encontraron pruebas de este tipo de agrupaciones, de hecho, el único rasgo que muestra no aleatoria asociación de sonda fija con QTL que sobrevivió a una corrección de Bonferroni para múltiples pruebas era en la dirección de una deficiencia de la sonda fija en la región QTL (Tabla 3] .

La sonda de 217 juegos con una importante línea × tratamiento y / o línea de tratamiento × × términos sexo (archivo de datos adicional 5) representan las diferencias genéticas entre las líneas en respuesta a la inanición tratamiento. ¿Son estos conjuntos sonda enriquecido en las regiones a las que la resistencia a la inanición QTL mapa? Hemos encontrado que el 47 de la sonda fija cumplan con estos criterios, lo que representa el 45 genes únicos, cayó dentro de la resistencia a la inanición QTL regiones, y los restantes 170 conjuntos de la sonda, lo que representa 169 genes únicos, quedaba fuera de los intervalos de QTL. Estos conjuntos de la sonda no se sobre-representados dentro de la resistencia a la inanición QTL (χ 2 1 = 0,26, P> 0,05).

Hay una variación significativa en la vida media de la inanición entre los seis líneas (P <0,0001; adicional archivo de datos 8). Para los conjuntos de sonda previamente identificados como haber diferencias significativas en la transcripción de las líneas de nivel, que evaluó la medida en que la variación en la abundancia de transcripción se asoció con una variación de la vida media de la inanición. Hemos encontrado 281 sonda fija con correlaciones significativas (P <0,05) entre el hambre y la transcripción fenotipo nivel, de los cuales 273 de la citología ubicación era conocida (adicional archivo de datos 5). Sin embargo, el 66 de la sonda conjuntos relacionados con el hambre de vida media de mapeado QTL de resistencia a la inanición, y 207 no lo hicieron. De nuevo, estos conjuntos de la sonda no se sobre-representados dentro de la resistencia a la inanición QTL (χ 2 1 = 0,45, P> 0,05).

Aunque no existe una tendencia de los genes que muestran la variación de la abundancia entre las líneas de transcripción al grupo dentro de la resistencia a la inanición QTL, las que lo hacen co-localizar con el QTL son genes candidatos que afectan a la variación en el hambre y la tolerancia entre Ore 2b. Hemos encontrado 155 sonda fija, correspondientes a 153 genes candidatos, que se reunió una o más de los criterios anteriores (archivo de datos adicional 5). La mayoría (114, 75%) fueron genes predichos. El resto de los genes (Tabla 4] son razonables candidatos a la resistencia QTL hambre, que afectan a los procesos de metabolismo de las proteínas, defensa y respuesta inmune, y peptidolysis proteólisis, y el transporte.

Complementación pruebas para mutaciones han implicado varios genes candidatos que afectan a la variación entre Ore 2b y en el comportamiento olfativo [29] (Vanaso), la longevidad [31, 32] (Dopa descarboxilasa, la artesanía y la lanzadera ms (2) 35Ci) y la resistencia a la hambruna [21] (Spalt principales, Ryanodine receptor 44F, piernas torcidas, NaCP60E, Phosphoglucose isomerasa, bellwether, entumecido, Punch, l (2) rG270, l (2) k17002, l (2) k00611, y l (2) k03205). Ninguno de estos genes mostraron una diferencia significativa en la abundancia entre las líneas de transcripción.

Discusión
El sexualmente dimorfo transcriptome

De acuerdo con informes anteriores [5, 11, 33, 34], se observó diferencias altamente significativas en la abundancia de transcripción entre hombres y mujeres casi la mitad del genoma. Estas diferencias en los perfiles de transcripción no se limitan a los estereotipos sexo-específicos de los procesos biológicos. Mujeres transcripción se upregulated niveles de genes implicados en la biosíntesis de proteínas, el metabolismo y la regulación de la transcripción, mientras que los varones fueron más altos los niveles de transcripción de conjuntos que participan en la sonda de iones y en el carro de transporte, como en un estudio previo de las diferencias de sexo en Drosophila los jefes de transcripción [5] . Las diferencias en la abundancia de transcripción entre los sexos puede ser un mecanismo para sexo-comúnmente observado efectos específicos de QTL asociados con una variedad de rasgos complejos en Drosophila [21 - 26, 32, 35, 36] y otros organismos [37]. Los varones y las mujeres sean efectivamente diferentes entornos en los que actúan los genes. Los lugares cromosómica de los genes con el sexo que dependen de expresión no eran aleatorios. Se confirmó la aparentemente fenómeno general que el cromosoma X es Drosophila los genes de manera que se upregulated en los hombres [33, 34]; cromosoma X-demasculinization es quizás atribuible a la selección en contra de los genes que son ventajosas en los hombres, pero nocivas para las mujeres [33]. En contraste con estudios previos, se observó que el cromosoma 2R albergaba un exceso, y una deficiencia cromosoma 4, de los genes que se upregulated tanto en hombres como mujeres.

Transcripcional respuesta a la inanición estrés

La respuesta transcripcional a la inanición estrés por aproximadamente el 25% del genoma. El estrés indica upregulation perfil de los genes involucrados en el crecimiento y el mantenimiento y los procesos de biosíntesis de proteínas, con un aumento de la transcripción de genes que codifican la traducción de iniciación y elongación de los factores, el de la mitocondria y citosólica ribosomal proteínas estructurales, y la participación de hidrolasas ácidos anhídridos. Este aumento de la biosíntesis de proteínas y actividad hidrolasa puede interpretarse como un intento de utilizar las proteínas para la alimentación. Un fenómeno similar se ha observado en la respuesta de la levadura [38] y células de mamífero [39] a la inanición, en los que los orgánulos degradación de las proteínas y proporciona sustrato para las células mueren de hambre [40]. Nuestra observación de que las peptidasas, que catalizar la hidrólisis del péptido bonos, fueron significativamente downregulated en respuesta a la inanición, es coherente con la preservación de las nacientes cadenas de proteínas. El downregulation de la actividad aérea y de defensa / inmunidad proteínas indica que el transporte a través de membranas de la célula y frena la respuesta inmunitaria se ve comprometida en las moscas de hambre.

Se han comparado nuestros resultados con los de un estudio anterior, la investigación de los microarrays de expresión génica de los cambios en las larvas de hambre [41]. Encontramos 21 sonda establece que se alteró significativamente en los dos estudios durante la inanición. Muchos de estos genes se han previsto funciones que no se han verificado experimentalmente, pero algunas de las funciones de los genes han conocido. Insulina-like receptor, Serine piruvato aminotransferasa, Amylase distal, y mitocondrial carnitina palmitoyltransferase I, los genes que se sabe están involucrados en el metabolismo , Eran comunes a los dos estudios. Curiosamente, Peroxidasin, un gen involucrado en el oxígeno y el metabolismo de especies reactivas del oxígeno se upregulated cuadruplicado en larvas, aunque es downregulated 1,61 veces en nuestro estudio.

Inanición estrés fue acompañada por la reducción de la expresión de genes que afectan a la gametogénesis, por tanto como 66 veces en las mujeres hambrientas moscas. Egg componentes como corion, yema de huevo, proteínas de membrana y vitelino son de las más severas restricciones transcripciones, que implican la supresión de la función reproductora femenina durante la inanición. Esta depresión de la función reproductora no es exclusivo de las moscas, como los ratones hembra en una dieta restringida en la experiencia calorically un cese en ciclo estral [42] y la amenorrea es una de las características de la anorexia nerviosa en humanos de las mujeres [43]. Varios accesorio masculino glándula proteínas también se downregulated por tanto como 6,5 veces el hambre durante el estrés. Curiosamente, seis genes que afectan la espermatogénesis había diferentes niveles de transcripción entre la abundancia y el hambre de control de las moscas de hombres y mujeres, no se encontraron diferencias específicas de sexo masculino-en la transcripción de la abundancia de genes implicados en la espermatogénesis (archivos de datos adicionales 1 y 2).

Transcripción de Rpd3 y CG14095 se upregulated en las mujeres y en los hombres durante downregulated inanición. Rpd3 es un co-represor transcripcional, mientras que la función de CG14095 es desconocida. Sexo-antagonistas de los patrones de expresión se han observado los estudios en el tejido hepático de las ratas alimentadas con etanol [44], lo que sugiere que estos patrones de expresión no puede ser exclusivo de las moscas.

El gran número de transcripciones alterado durante la hambruna masiva implica pleiotropy; más aún cuando nuestra conservador umbral de significación se tiene en cuenta. Esto es consistente con nuestra observación anterior de que 383 de 933 P-único elemento de inserción líneas prueba (41%) tuvieron efectos directos sobre la tolerancia hambruna [21]. Además, identificado genes candidatos de la categoría P-elemento de la pantalla y la complementación de las pruebas de alelos QTL a mutaciones en genes candidatos posicionales son pleiotrópicos, y afectan a la especificación destino celular, la proliferación celular, oogenesis, metabolismo, y los comportamientos de alimentación [21].

Transcripción frente a la abundancia de mutaciones

¿En qué medida los genes que afectan a la respuesta a la inanición estrés identificados a partir de los cambios en la abundancia de transcripción coinciden con los implicados en la evaluación de los efectos cuantitativos de la categoría P-elemento inserciones en la tolerancia hambre? El resonante falta de una asociación estadística entre los dos métodos es un tanto engañosa. Si bien no hay asociación global, en caso de que sólo había probado el elemento P-160 mutaciones correspondientes a los genes alterados transcripción con abundancia durante la inanición, que se han encontrado que 77 (48%) en realidad había fenotípica efectos en la resistencia a la inanición. La falta de asociación fue causado por 108 genes marcados por P-elementos que afectan a la resistencia a la inanición, pero no mostrar diferencias en el nivel de transcripción en respuesta a la inanición estrés, y P-elemento inserciones en 83 genes que mostraron una diferencia significativa en la transcripción en respuesta a Hambre, pero no tienen efectos significativos sobre el hambre fenotípica tolerancia. La hambruna que afecta a los genes que son regulados post-transcriptionally, o para los que las diferencias en la abundancia de transcripción que son indetectables en la matriz tienen grandes consecuencias fenotípicas, contribuir a la primera fuente de discordancia entre los dos métodos. La segunda fuente de discordancia podría surgir en caso de la expresión de genes que muestran cambios en el hambre son realmente genes que afectan a la resistencia a la inanición, pero el particular P-elemento inserción mutación no fue probado en una región afectan a la inanición fenotipo, un P-elemento de inserción o mutación puntual En otro lugar puede producir un efecto significativo en la tolerancia hambruna [45]. Otra posibilidad es que el gen es downregulated durante la hambruna; por lo tanto, un elemento P-mutación en el gen podría no tener un efecto sobre el fenotipo de resistencia a la inanición. Por otra parte, una fracción de esos conjuntos de la sonda podría ser falsos positivos. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la evaluación de los efectos de las mutaciones en los genes que muestran los cambios en la abundancia de transcripción en respuesta a un medio ambiente (o genéticos [5, 7]] perturbación es una estrategia muy eficiente para la identificación de redes de regulación de genes pleiotrópicos rasgos complejos.

Variación genética transcripción en la abundancia y rasgos cuantitativos fenotipos

Las perspectivas de fácil identificación de los genes correspondientes a QTL utilizando microarrays de perfiles de color de rosa parecen menos en la actualidad. Se ha propuesto que los genes correspondientes a QTL son aquellas para las que se diferencia entre la expresión de sus padres las cepas utilizadas para la construcción de la cartografía de QTL población, y que se encuentran en las regiones a las que el QTL mapa [20]. Sin embargo, las diferencias de expresión entre líneas puede deberse a polimorfismos entre las cepas probadas y la cepa empleada para la construcción de la sonda fija en la matriz. Además, las líneas se diferencian por muchos rasgos, y QTL superposición de las mismas; a menos que el QTL son mapeados con muy alta resolución, genes candidatos elegidos por este criterio por sí solo puede afectar a otro rasgo. La cuestión de polimorfismo puede ser eludido por los rasgos con el medio ambiente expresión condicional por considerar sonda establece que muestran una línea de tratamiento × entorno interacción, la especificidad y de los rasgos pueden ser abordadas por correlacionar los niveles de expresión con el carácter fenotipo. Ninguno de estos criterios dio lugar a un enriquecimiento de genes candidatos con variación en la expresión dentro de las regiones QTL.

Una de las principales dificultades en el uso de los cambios en la expresión genética entre dos cepas de identificar genes candidatos correspondientes a QTL se plantea, ya que la variación en la abundancia de transcripción de genes candidatos posicionales pueden derivarse de varias causas. En primer lugar, la variación en la abundancia de transcripción se debe a la reglamentación polimorfismo en el gen candidato en sí. En segundo lugar, el candidato de genes en sí no es genéticamente variable, pero la variación en la reglamentación un segundo gen afecta a la variación en su expresión. En tercer lugar, la variación en la abundancia en la transcripción de genes candidatos se debe a la interacción de reglamentación polimorfismos en el gen candidato y de un segundo gen. Estas interacciones pueden ser aditivo o epistatic. Posicionales genes candidatos con variación en la abundancia de transcripción derivados de la primera o tercera causa podría corresponder a la variable genéticamente QTL. Sin embargo, cada vez es más claro que la variación genética en la abundancia de transcripción se debe en gran medida a la regulación de los genes disociados (véase [15 - 17, 19] y el presente documento). De hecho, el único elemento P-inserciones pueden alterar la expresión de transcripción tantos como 161 genes, frente a la co-isogénicas de control de la línea [5]. Esta baja relación señal-ruido significa que la elección de la posición genes candidatos para nuevo estudio basado sólo en las diferencias en la abundancia de transcripción entre líneas parentales no tiene una alta probabilidad de éxito.

En el futuro, la caída de los costos de todo el genoma-análisis de la expresión transcripcional facilitará la evaluación de la variación y la variación en fenotipos rasgo en el mismo QTL cartografía de las poblaciones grandes. Co-localización de QTL con efectos principales que afectan conjuntamente la variación de la transcripción y de los rasgos fenotipo ayudará a cabo winnow monomórficos genes que son regulados por disociados loci, y esos datos permitiría pruebas directas de epistasis en el nivel de transcripción y el carácter. Es poco probable que este enfoque suplantar por completo de alta resolución y cartografía de QTL complementación de las pruebas de mutaciones genéticas a fin de elucidar la compleja arquitectura de rasgos en Drosophila. Ninguno de los 12 genes que afectan a la variación de la resistencia a la inanición entre Ore y 2b [21] exhibió variación en la abundancia de transcripción en el presente estudio. Posiblemente cualquier transcripcional diferencias entre Ore y 2b alelos en estos loci son raros los mensajes por debajo del umbral de detección, o que se expresan sólo en algunos tipos de células o en un período de desarrollo. Además, no todas las diferencias alélicas entre alelos QTL son necesariamente regulada a nivel de transcripción. No obstante, la incorporación de conocimientos sobre la variación de la transcripción en gran abundancia informar a nuestra elección de los genes candidatos para su confirmación por pruebas de complementación mutante y estudios de asociación, que actualmente se encuentra sesgada por nuestro pobre entendimiento de la pleiotrópica y epistatic consecuencias de la variación de los genes candidatos posicionales en la variación En el rasgo fenotipos.

Materiales y métodos
Drosophila existencias

Se utilizó la isogénicas líneas 2b [22, 46] y Oregon-R [47] (Ore) para establecer 98 líneas de RI para el trazado de mapas QTL que afectan a la resistencia a la hambruna [21]. Supervivencia de los tiempos de Oregon-R moscas son de 36,0 y 51,6 h para hombres y mujeres, respectivamente. Por 2b, la supervivencia fueron 29,2 veces h para los hombres y de 40,4 horas para las mujeres. En este sentido, se analizan los perfiles bajo control transcripcional y condiciones para la inanición durante 2b, Ore, dos resistentes a la inanición (RI.14, RI.21) y dos inanición sensibles (RI.35 , RI.42 ) RI líneas. Recombinación de interrupción de las líneas de RI que se ha determinado previamente [23] y se resuelven a la subdivisión más cercana citológico letras. Hemos mantenido el control de moscas en la harina de maíz-agar-melaza medio, de hambre y de las moscas no nutritivos (1,5% de agar y agua) medio, bajo condiciones de cultivo estándar (25 ° C, 70% de humedad, y de 12 h luz: 12 -- H oscuro ciclo).

Hambre a la vida media

Se evaluó la supervivencia de las seis líneas de bajo condiciones de hambre, colocando dos repeticiones de diez moscas cada sexo por medio de la inanición, y el registro del número de moscas vivas en intervalos de 8 h hasta que todos estaban muertos. Hemos utilizado estas curvas de supervivencia para inferir el hambre de vida media para cada línea / sexo combinación. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) modelo Y = μ + L + S + S + L × R (L × S) + E, a la partición de la varianza en los tiempos de supervivencia en las fuentes atribuible a la cruz-clasificados efectos de las principales líneas ( L), el sexo (S), la diferencia entre replicar viales (R), y dentro de la varianza ambiental vial (E).

Transcripcional de perfiles

Para cada una de las dos réplicas independientes, se recogieron los 300 varones y 300 hembras vírgenes de todas las líneas, con edades entre 2-5 días después de la eclosión. El tratamiento consistió en el control de 100 hambre no vuela / línea / sexo. Hemos colocado a los 200 restantes moscas / línea / sexo en medio del hambre, y se recogieron alrededor de 100 moscas / línea / sexo predeterminado en la vida media de la inanición. Hambrientas moscas de todas las líneas, por lo tanto, debería ser aproximadamente en la misma condición fisiológica. Se extrajeron todo el organismo ARN de cada una de las 48 muestras independientes (6 líneas tratamientos × 2 × 2 × 2 repeticiones sexos) con Triazol reactivo (Gibco BRL), seguido por la digestión DNasa (RQ1 DNasa, Promega,) y un 1:1 Fenol (Sigma-Aldrich)-cloroformo (Fisher Ciencia) de extracción. Hemos hibridizado con biotina cRNA sondas a un solo color de todo el genoma de Drosophila Affymetrix GeneChip arreglos que se describen en el Affymetrix GeneChip Análisis de Expresión 2000 manual.

El análisis de los datos

Hemos normalizado la expresión de la expansión global de datos de la sonda conjunto intensidad a 100 en cada chip utilizando patrón de referencia de la sonda fija en cada chip para el procedimiento de normalización. Cada sonda establecido en la gama consta de 14 perfecta (PM) y la falta de adecuación de nucleótido único (MM) pares. Se utilizó la diferencia media (AD) en la expresión del RNA normalizado entre los 14 perfecta (PM) y la falta de adecuación (MM) por la sonda sonda pares set (Affymetrix Microarray Suite, versión 4.0) como la variable de análisis. Se calculó el valor umbral mínimo AD [5] como AD = 30. Si la media de una sonda AD conjunto fue inferior a 30, y el máximo valor AD fue también inferior a 30, se eliminó la sonda conjunto de tenerse en cuenta. Hemos establecido todas las restantes AD puntuaciones <30, en AD = 30. Se realizó un curso de tres ANOVA de AD sonda para cada conjunto, de acuerdo con el modelo: Y = μ + S + T + L + S + S × T × T + L × L + S × T × L + E, Donde S, T, y L representan, respectivamente, el fijo combinados con efectos de sexo, el tratamiento (control versus hambre), y la línea, y la E es la diferencia entre arrays replicar. La detección de F-ratio pruebas de importancia para cada término en el ANOVA, y consideró sonda fija con valores de p ≤ 0,001 para cualquiera de los términos a ser importante. (Hay aproximadamente 14000 sonda fija en la matriz, por lo tanto, 14 falsos positivos que se esperaría en este umbral de significación.)

Hemos calculado las mujeres: hombres de AD valores, promediados a lo largo de todas las líneas y los tratamientos, por sonda fija para el que el principal efecto de la S fue significativa. Del mismo modo, calculó el hambre: el control de ratio de AD valores, promediados a lo largo de las líneas y el sexo, de la sonda con importantes conjuntos de términos T. Hemos clasificado estos sonda fija en función de sus genes ontología (GO) para el proceso biológico y molecular, la función [48]. Se evaluaron las diferencias significativas en las categorías GO-y hasta entre downregulated sonda fija utilizando G pruebas [49], bajo la hipótesis nula de igual número de arriba-abajo y regulado sonda fija en cada categoría, y el uso de las correcciones a cuenta de Bonferroni para múltiples ensayos . Para conjuntos de sonda con un peso significativo en términos T × S, que corrió en dos sentidos ANOVAs separado por sexo utilizando el modelo reducido Y = μ + L + T + T + L × E.

Probe con importantes conjuntos de L, L × S, L × L × T o T × S términos son candidatos para QTL rasgos que varían entre las líneas. Se realizó post-hoc de Tukey para todas las pruebas de la sonda fija para que estos términos son importantes para determinar las líneas de transcripción en la que se arriba-o downregulated en respuesta a la inanición estrés. Para conjuntos de la sonda que fueron significativas para el efecto principal de L, pero no cualquiera de los términos de interacción, se realizaron pruebas de Tukey mediante la expresión a través de los valores agrupados de control y las condiciones de hambre y de ambos sexos. Tenemos pruebas de Tukey computa por separado para hombres y mujeres, un promedio de más de dos tratamientos, por sonda establece que fueron significativas para la interacción L × S, y por separado por el tratamiento, la sonda de conjuntos importantes para la interacción L × T. El análisis de Tukey separó las líneas en grupos dentro de los cuales AD valores no fueron significativamente diferentes. Desde el genotipo de cada recombinante puras online en cualquier lugar que se conoce, hemos utilizado el análisis de Tukey para clasificar sonda fija como expositoras vinculadas o no vinculadas regulación de la transcripción abundancia. Se consideraron los factores vinculados a la regulación de la transcripción y la abundancia si Ore transcripción 2b difieren en abundancia, y esta diferencia se refleja en el CI en función de sus líneas Ore y 2b genotipo de la región a la que los mapas de genes. Por el contrario, inferimos que la de que los factores de transcripción regulan la abundancia en los casos en que no hay una correspondencia 1:1 entre la línea paterna y el genotipo Tukey agrupación. La detección de la tapa de cambio entre Tukey agrupaciones mediante el cálculo de la ratio de la línea desviada (s) de expresión a nivel de la media de la expresión nivel común de los padres o de grupo. La mayoría de los análisis se Tukey inequívocos; que hay múltiples interpretaciones de lo posible, se calculó el cambio de tapa de todas las posibilidades.

Los análisis estadísticos

Hemos utilizado SAS procedimientos para todos los análisis estadísticos [50].

Adicional de los archivos de datos

Además los siguientes archivos de datos están disponibles con la versión en línea de este artículo. Adicional 1 archivo de datos contiene una lista de todos los conjuntos de sonda con expresión significativamente diferentes en las mujeres y los hombres. Adicional archivo de datos 2 contiene una lista de todos los conjuntos con sonda significativamente diferentes de expresión bajo control y las condiciones de hambre. Datos adicionales archivo 3 listas de la sonda fija para los que el sexo por el tratamiento interacción plazo es significativo. Datos adicionales archivo 4 se muestra la correspondencia entre los resultados de una pantalla de los efectos sobre la resistencia a la inanición por estrés único elemento P-inserta, en un co-isogénicas de fondo [21], y los cambios en la abundancia de transcripción entre el control y los tratamientos de hambre. Datos adicionales archivo 5 se resume la sonda fija para que haya un importante variación genética transcripción en abundancia. Archivo de datos adicional 6 muestra la sonda fija para los que la única expresión genética significativa fue el principal efecto de la línea. Datos adicionales archivo 7 da la misma información que el archivo de datos adicional 6, pero por separado para el control y tratamientos de hambre, y con los resultados de los análisis recaudado más de sexos, y para hombres y mujeres por separado. Datos adicionales de archivo 8 es el ANOVA de hambre de vida media para Ore, 2b, RI.14, RI.21, RI.35 Y RI.42 . Archivos de datos adicionales 9 y 10 de dar la cruda expresión de datos y presencia / ausencia llamadas para el control de hambre y tratamientos, respectivamente.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
El archivo incluye todos
P
ANOVA de los valores de expresión de los valores, la expresión significa en hombres y mujeres, a través de un promedio de los tratamientos y líneas de la FlyBase ID, gen nombre, el símbolo y sinónimos; citológico lugar y función molecular, la biología del proceso y celulares componente gen ontologías
Archivo Adicional 2
El archivo incluye el promedio de los niveles de expresión bajo control y las condiciones de hambre, un promedio de más de sexos y las líneas, así como la información proporcionada por cada sonda adicional fijado en el archivo de datos 1
Archivo Adicional 3
El archivo incluye el
P
- Los valores para el tratamiento plazo en la reducción de los análisis de hombres y mujeres por separado, el promedio de los valores de expresión bajo control y las condiciones de hambre para hombres y mujeres, un promedio de más de líneas de expresión si está sesgada por sexo (SB), el sexo-específicas (SS) O sexo-antagonistas (SA), además de la información dada por cada sonda conjunto de datos adicionales en el archivo 1
Archivo Adicional 4
Los resultados se agrupan en cuatro categorías: (1) Transcripción se altera la abundancia y el hambre entre los tratamientos de control, y hay un efecto significativo de la
P
- Elemento de inserción en la inanición tolerancia; (2) Transcripción se altera la abundancia y el hambre entre los tratamientos de control, pero el
P
- Elemento de inserción no afecta significativamente la tolerancia hambre; (3) No hay ninguna alteración en la transcripción abundancia entre los tratamientos de control y de hambre, pero los
P
- Elemento de inserción de manera significativa en la tolerancia hambre, y (4) No hay ninguna alteración en la transcripción abundancia entre los tratamientos de control y de hambre, y un efecto no significativo de la
P
- Elemento de inserción en la tolerancia hambre
Archivo Adicional 5
El archivo incluye todos
P
ANOVA de los valores de los valores de expresión; el gen nombre, el símbolo, sinónimos, y citológicos ubicación, la función molecular, la biología del proceso y la localización de genes celulares ontologías; co-localización de los genes que afectan a QTL con vida, sensoriales cerda números, el hambre resistencia , Ovariole número, la señal de cortejo, vuelo, la tasa metabólica y de los triglicéridos, y la asociación estadística de la variación entre las líneas de transcripción en los niveles de hambre y vida media
Archivo Adicional 6
Las células son asignado un código de color: violeta para Ore genotipo, verde para 2b genotipo, de color gris si el genotipo es desconocido ya que el gen es entre un Ore y un acompañamiento 2b marcador, y la recombinación de corte exacto no está determinado, y si el genotipo de oro Se desconoce causa de heterozigosidad residual en la línea RI. Los resultados de pruebas de Tukey separar las líneas en grupos de expresión dentro de los valores que no son significativamente diferentes se dan. Si más de una interpretación de los grupos de Tukey son posibles, todos se dan. Vinculada (L) regulación de la transcripción variación en la abundancia se infiere si el Tukey agrupaciones coincidir con el genotipo. Reglamento de la variación en la abundancia de transcripción se infiere que vincularse (IL) si el desconocido genotipos podría coincidir con esta interpretación. Disociados (U) regulación de la transcripción variación en la abundancia se infiere si el Tukey agrupaciones no coinciden con la línea de genotipos
Archivo Adicional 7
Un cuadro de dar la misma información que en el archivo de datos adicional 6, pero por separado para el control y tratamientos de hambre, y con los resultados de los análisis recaudado más de sexos, y para hombres y mujeres por separado
Archivo Adicional 8
Una tabla que muestra el ANOVA de hambre de vida media para Ore, 2b, RI.14, RI.21, RI.35
Y RI.42
Archivo Adicional 9
Un cuadro que muestra la cruda expresión de datos y presencia / ausencia llamadas para el control de tratamientos
Archivo Adicional 10
Un cuadro que muestra la cruda expresión de datos y presencia / ausencia de las llamadas de hambre tratamientos
Agradecimientos

Damos las gracias a K. Norga para anotar la P-elemento de inserción líneas. STH es el destinatario de un WM Keck de becas pre-doctorales. Este trabajo fue financiado por becas de los Institutos Nacionales de Salud a TFCM Esta es una publicación del Centro WM Keck para Biología del Comportamiento.