Cancer Cell International, 2005; 5: 11-11 (más artículos en esta revista)

In vitro análisis de las invasoras fenotipo de SUM 149, una respuesta inflamatoria línea celular de cáncer de mama

BioMed Central
Michaela R Hoffmeyer (mrhoffmeyer@hotmail.com) [1], Kristin M Wall (kmariew@hotmail.com) [2], Suranganie F Dharmawardhane (surangi@mail.utexas.edu) [1]
[1] Street, Austin, Texas, 78712, USA
[2] Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Texas en Austin, 1 University Station Stop C0800, Austin, TX 78712, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Cáncer de mama inflamatorio (IBC) es la forma más letal de cáncer de mama invasivo a nivel local conocida. Sin embargo, hay muy poca información sobre los mecanismos celulares responsables de la manifestación de la CIB fenotipo. Para comprender la singular fenotipo de IBC, se compararon los móviles y las interacciones de un adhesivo IBC línea celular, SUMA 149, a la no-IBC línea celular SUM 102.

Resultados

Nuestros resultados demuestran que ambas IBC IBC y no líneas celulares de exposición similares propiedades adhesivas de lámina basal, pero SUM 149 mostraron un marcado incremento en la adherencia al colágeno I. haptotaxis ensayos in vitro demuestran que SUM 149 fue menos invasiva, mientras que la cicatrización de heridas ensayos muestran Menos in vitro migratorias fenotipo de las células SUM 149 relativo a SUM 102 células. También demuestran una función de Rho y la E-cadherina en la única invasoras fenotipo de IBC. Immunoblotting revela superior E-cadherina y RhoA expresión en la línea celular, pero IBC similares RhoC expresión. Rodamina phalloidin tinción demuestra el aumento de la formación de las fibras de actina estrés y mayor focal adherencias en el SUM 149 relativo a la línea celular 102 SUM.

Conclusión

La única observó actina y la arquitectura celular, así como en la invasión y adhesivo respuestas a la matriz extracelular de 149 SUM IBC células sugieren que la preferencia de los IBC de células del tejido conectivo, posiblemente un mediador importante para el vasculogenic través de la imitación tubulogenesis visto en IBC especímenes patológicos . Sobreexpresión de E-cadherina y RhoA puede contribuir a la difusión pasiva de IBC mediante la promoción de la célula de la adhesión celular citoesqueleto de actina y las estructuras que mantienen la integridad del tejido. Por lo tanto, creemos que estos resultados indican un pasivo metastásico mecanismo por el que células IBC invadir el sistema circulatorio como embolia tumor más que por activa los mecanismos migratorios.

Antecedentes

Con un promedio de cinco años posteriores a la recuperación de la tasa de supervivencia del 45%, el cáncer de mama inflamatorio (IBC) es el más letal y agresiva forma de cáncer de mama localmente avanzado [1]. La letalidad de IBC se deriva de su naturaleza altamente invasiva. Diagnóstico de la IBC es a menudo complicada por la falta de una lesión palpable precursor comúnmente asociados con el cáncer de mama. Además, el diagnóstico correcto se ve obstaculizada por inflamatorios similares a los síntomas como enrojecimiento, calor y edema. IBC es característica de un cambio en la textura de la piel del seno, similar a la de una naranja, debido a la extensa invasión de los linfáticos dérmicos por IBC tumor de células embolia. Estas complicaciones contribuir a IBC letalidad en el momento en que un correcto diagnóstico está hecho, el cáncer se ha infiltrado en la agresiva y tejidos linfáticos que rodean el sistema, dando lugar a un reducido pronóstico del paciente [2]. Que complica el tratamiento de esta mortal forma de cáncer de mama es que muy poca información sobre los mecanismos celulares responsables de la única IBC fenotipo es conocido.

El cáncer de células invasión a través de la lámina basal y posterior metástasis implica varios pasos a través de la intravasation incluidos los tejidos circundantes en el sistema linfático o vascular. Transitorio de adhesión a la matriz extracelular (ECM) componentes, así como la modificación de la forma de células por la reorganización del citoesqueleto de actina se requiere para el cáncer de células infiltración en el tejido adyacente. El Rho GTPasas regular reordenamientos citoesqueleto de actina, por lo que son probables candidatos a la participación en el cáncer de células invasión y metástasis [3, 4]. Otra prueba de una relación entre el cáncer de células de la movilización y la disregulación Rho GTPasas se ve en la sobreexpresión de proteínas Rho invasoras en numerosos cánceres humanos. El reciente descubrimiento de la sobreexpresión de la isoforma Rho RhoC por IBC tumores ha sido implicado en los mecanismos fisiológicos de este mal caracterizado forma de cáncer de mama [5]. RhoC se demostró que se sobreexpresa en tumores metastásicos de pacientes con adenocarcinoma pancreático [6], murino melanomas [7], y, en el paciente derivado IBC línea celular SUM 149 [5]. Transitoria de la inhibición de las células RhoC en IBC por el tratamiento con inhibidores de farnesyl transferasa invasión y reducción de la motilidad in vitro [8]. Recientemente se informó de que RhoC sobreexpresión en células epiteliales mamarias dado lugar a un importante aumento en la migración de células [9], mediada por la vía MAPK [10]. Estos resultados nos llevaron a la hipótesis que RhoC sobreexpresión puede promover el fenotipo altamente invasoras de IBC y contribuir a la única fenotipo agresivo exhibido por IBC.

Otra característica única de IBC es la sobreexpresión de E-cadherina, una proteína transmembrana de las células que participan en la adhesión celular, que es en general muy perdido en cánceres invasivos. Parece un tanto paradójico que un cáncer agresivo que overexpresses proteínas implicadas en la reorganización del citoesqueleto de actina y la promoción de la migración (es decir, RhoC) también overexpresses célula-célula cruce de las proteínas como E-cadherina [11 - 15]. La literatura hasta la fecha parece tener a dos escuelas de pensamiento acerca de la contradictoria expresión de la proteína visto en IBC. Uno tiende a apoyar la idea de que la E-cadherina expresión fluctúa con la progresión de la enfermedad y disminuye a medida que las células se conviertan en invasivas IBC [15]. La segunda escuela apoya la teoría de la metástasis por pasiva IBC [11, 12]. En pasiva metástasis, tumor de células fuertes adherencias de células se mantienen durante la difusión de que el producto a través de vasculogénesis a través de la secreción de factores de diferenciación de las células del tumor que causa la formación de novo buque [16]. Ello se traduce en un grupo de células de cáncer en el barco, que recuerda al tumor embolia IBC IBC visto en la histología. Además, RhoC sobreexpresión en células epiteliales mamarias humanas ha demostrado que aumenta la producción de factores angiogénicos, algunos de los cuales pueden mediar pasiva o activa metástasis [17].

El IBC ha mistificado fenotipo clínico debido a su inflamatoria síntomas similares. Sin embargo IBC sintomatología no se considera una verdadera immunoreaction, sino más bien una consecuencia de la invasión de células de cáncer al sistema de linfáticos. El mecanismo por el que invade IBC no está clara y la experimentación con nuevos modelos de IBC es necesaria para aclarar el mecanismo exacto por el cual esta forma de cáncer de mama se difunde. Usando el SUM 149 IBC línea celular, hemos examinado el adhesivo y la capacidad migratoria, en un esfuerzo por entender el comportamiento invasivo de RIG para la futura experimentación in situ con imágenes de IBC en modelos animales. SUM 149 se comparó con un control de línea celular, SUMA 102, que fue seleccionado debido a que comparte una supresión en el LIBC (perdido en el cáncer de mama inflamatorio) con el gen SUM 149 línea celular, pero al parecer RhoC mRNA expresa en niveles bajos [5]. Nos muestran que SUM 149 es menos invasiva y adhesivo de la lámina basal in vitro de los componentes de SUMA 102, y 149 SUM que expresa más proteínas Rho y E-cadherina. Estos datos muestran que SUM 149 no es muy móviles y por tanto, posiblemente no invasiva activamente, sugiriendo metástasis pasiva como mecanismo de difusión IBC.

Resultados
Los niveles endógenos de Rho

Figura 1A se presenta la relación de los niveles de proteína Rho los diferentes isoformas en el IBC línea celular SUM 149 versus la no-IBC línea celular SUM 102. Anterior investigadores han reportado RhoC sobreexpresión de ARNm en las células en comparación con el IBC SUM 102 [5]. Para verificar sobreexpresión de la proteína RhoC a nivel, preformados Western blots sobre lisados de células RhoC utilizando un anticuerpo policlonal (Santa Cruz Biotechnology, CA). No se encontraron diferencias significativas en los niveles de proteína RhoC entre el 149 y el SUM SUM 102 líneas celulares. Sin embargo, immunoblotting reveló una diferencia significativa en Rho (A, B, yC), con la línea celular expresando IBC mucho más altos niveles de proteína Rho. A continuación, examinó los niveles de proteína RhoA y encontró una importante sobreexpresión de RhoA en el IBC línea celular. Este hallazgo es interesante, considerando que RhoA se ha demostrado que desempeñan un papel vital en actomyosin mediada la contractilidad [21, 24].

Subcelulares distribución de los centros de coordinación y adherencias filamentosas actina

Porque RhoA está implicado en el estrés de fibra actina y la formación de adherencias focales, que las células teñidas con rodamina phalloidin para visualizar F-actina y anti-fosfotirosina para visualizar focal adherencias. Figura 1B demuestra F-actina y centros de distribución de adherencia en ambas líneas celulares. SUM 149 mostradas adherencias focales más grandes y más estrés fibras de actina SUM 102 de la línea celular, como cabía esperar de los altos niveles de RhoA en la línea celular 149 SUM. Tras la estimulación de las células con EGF quiescente o FBS, el SUM 102 membrana de las células formaron grandes volantes (lamellipodia). Sin embargo, la estimulación por tanto FEAG FBS y parece tener poco efecto en el citoesqueleto de actina de las células SUM 149. Un aumento en la adhesión focal fue visto en el SUM 149 células después de la estimulación con EGF, de células claras, pero no se observó la polarización.

La adhesión a la matriz extracelular de proteínas

La invasión y la metástasis es un proceso de pasos múltiples en el que las células deben romper conexiones locales, pasar a través de la lámina basal, sobrevivir en circulación, y el apego a restablecer celular distantes. Evidentemente, muchas de estas medidas implican la interacción con los componentes de ECM. Transitorio de adhesión a la ECM en conjunción con citoesqueleto reordenamientos son requisitos para la motilidad celular. Para examinar la capacidad de las líneas celulares de cáncer de mama en estudio a que se adhieran a los diferentes proteínas ECM, hemos realizado ensayos de adherencia (Figura 2]. En este sentido, demuestran que tanto SUM 149 y SUM 102 células tienen similares propiedades adhesivas de laminina, el componente principal de la lámina basal. Un ligero aumento de las propiedades adhesivas de las células IBC se observó en comparación con el SUM de 102 células de colágeno IV. Sin embargo, un marcado aumento de la adherencia al colágeno I, el principal componente del tejido conectivo, se observó para la línea celular 149 SUM. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el fenotipo invasivo visto exacerbado en el IBC no es debido a las diferencias en las propiedades adhesivas de lámina basal componentes, pero pueden indicar una preferencia de IBC a las células del tejido conectivo, a través de los cuales estas células debe invadir antes de entrar en circulación. Además, el apego a los componentes del tejido conectivo puede ser importante para vasculogenic través de la imitación tubulogenesis, como se ha visto en IBC especímenes patológicos [25 - 27].

Haptotaxis estimulado invasión

Una agresiva de cáncer infiltrante debe invadir los tejidos circundantes por el movimiento a través de la ECM. Haptotaxis, o de células movimiento hacia las proteínas ECM, fue ensayada in vitro y se presenta en la figura 3. SUM 149 células fueron significativamente menos invasiva en laminina (componente de lámina basal) y colágeno I (componente del tejido conectivo) después de 24 horas de la línea celular 102 SUM. Por lo tanto, SUM 149 fue menos invasiva cuando analizarse de una manera que requiere de células individuales de un movimiento activo mecanismo de movilidad a través de una membrana con 8 μ m poros.

Distribución subcelular de actina filamentosa posterior a la polarización celular

Para inducir la polarización y migración de células que no se trate de activos de migración de las células individuales, sino colectivos migración celular lo largo de un borde de la herida, se realizaron ensayos de la cicatrización de la herida, tal como se describe en [28]. Un monocapas de células resultó herido, que conduzcan a la liberación de chemotractant señales de las células en el borde de la herida, por lo tanto, imitando las señales que la motilidad celular in vivo (Figura 4]. En este sentido, que la actual línea celular IBC SUM 149 fue menos sensible a la migración de células derivadas de las señales después de 7,5 horas. En ese momento, SUM 102 de la línea celular es mucho más invasivo en el espacio de la herida y casi se había cerrado la herida del todo. De este modo, activa la migración como una hoja de células no es el mecanismo por el cual se difunde IBC.

Endógena Expresión de E-cadherina

Una interesante y sorprendente característica de IBC es la expresión de E-cadherina invasoras por este tipo de cáncer de mama. Por lo general, la pérdida de E-cadherina se correlaciona con un mayor potencial invasivo y metastásico [29]. Para verificar la E-cadherina expresión en la línea celular IBC SUM 149, que realizó experimentos de inmunofluorescencia (Figura 5A]. Tanto SUM 149 y SUM 102 E-cadherina muestran manchas localizadas a los márgenes compartida entre células vecinas, sin embargo esta tinción es mucho más intensa en la línea celular 149 SUM. Immunoblotting análisis también demuestra E-cadherina expresión por las dos líneas celulares con mayores niveles de E-cadherina se expresa en el SUM 149 células (Figura 5B].

Discusión

IBC es una única y muy agresiva forma de cáncer de mama localmente avanzado con distinta presentación clínica. La hipótesis de que upregulated expresión de RhoC, según ha informado a los demás a ser característica de la IBC, contribuye a la inusual presentación de IBC patológicos. Por primera vez, hemos comparado la arquitectura de actina, invasoras, y las propiedades adhesivas de la línea celular IBC SUM 149 con una línea celular informó a expresar menos en comparación con el ARNm RhoC SUM 149, pero que comparten una deleción en LIBC [5]. El uso de un anticuerpo específico disponible en el comercio a RhoC, nos informan de que no se sobreexpresa RhoC a nivel de proteínas por la IBC línea celular SUM 149. Es interesante que la sobreexpresión de RhoA confirmado mediante la utilización de un anti-RhoA de anticuerpos específicos. Sin embargo, después de la regulación transcripcional de expresión RhoC puede dar cuenta de la discrepancia observada. Es posible que nuestros resultados no están de acuerdo con la expresión mRNA informó debido a la especificidad de los problemas con los anticuerpos desarrollados comercialmente. Además, nos demuestran que, en comparación con 102 SUM, SUM 149 es menos invasiva y migratorias, y muestra alteración de la adhesión a la lámina basal componentes pero firme adhesión a las proteínas del tejido conectivo.

El papel de la proteína Rho en la invasión de células del cáncer es algo controvertido. RhoA es que se sabe están involucrados en la contractilidad celular, tanto en la formación de fibras de actina y agrupados a través de la activación de las Rho quinasa y la posterior activación de la miosina de cadena ligera [30]. Esas células contráctiles, anteriormente, ha demostrado ser menos movilidad [31]. Sin embargo, Rho sobreexpresión se ha documentado en varios cánceres humanos, tales como la vejiga y de ovario, y se correlaciona con invasión ganglionar, metástasis, y mal pronóstico del paciente [32, 33]. Sobreexpresión de RhoC humanos por células epiteliales mamarias aumento de la invasión, motilidad, y el crecimiento de anclaje independiente, similar al SUM 149 [9]. Expresión de Rho T19N dominante negativo se ha demostrado de bloquear la invasión de células de melanoma [34]. Algunos investigadores informan de que la sobreexpresión Rho tiene poco impacto en la invasión y la motilidad celular, mientras que otros demuestran una correlación positiva entre Rho expresión y la capacidad de migración celular [35 - 37]. Rho es necesaria para la contracción de células cuerpo y cola retracción durante dirigida motilidad celular, en tanto que activa Rac y Cdc42 son necesarios para lamellipodia filopodios y extensión a la vanguardia [30]. Así, el potencial invasivo se considera un equilibrio entre Rac, Cdc42, y Rho actividades. Sobreexpresión o activación de una de estas Rho GTPasas que cambiar este equilibrio y dar lugar a un fenotipo celular dominado por la actina estructura promovida por la GTPasa Rho activado [38]. SUM 149 puede mostrar la reducción de la migración y la invasión in vitro en comparación con SUM 102 debido a la sobreexpresión de RhoA solo, por lo tanto, la utilización de máscaras de la movilidad efectos de Rac y Cdc42.

Otro aspecto que hace que el IBC de modo notable es que esta forma de cáncer de mama agresivo mantiene fuertes E-cadherina expresión [11 - 15]. Normalmente, la pérdida de E-cadherina expresión se correlaciona con la progresión de la enfermedad metastásica, ya que las células del cáncer que romper adherencias entre las células antes de lograr un fenotipo de la movilidad [29]. En este sentido, demostrar que el modelo de 149 SUM IBC mantiene fuertes E-cadherina expresión en la cultura, como se ha visto en otros modelos y xenoinjertos IBC IBC especímenes patológicos. Informes anteriores indican la E-cadherina eje también está completa y funcional [11]. IBC histología revela una amplia invasión de E-cadherina positivo de tumor de células dentro de la embolia cutánea linfáticos [11 - 15]. La expresión de E-cadherina puede ser crítico para la invasión en la que el IBC se piensa por algunos que se difunde pasivamente, una invasión que exige mecanismo de células-célula de [12]. En este escenario, las células tumorales mantener fuertes conexiones de la célula-célula y entrar en circulación a través de vasculogénesis en torno a un tumor de células émbolo. Otros sostienen que E-cadherina expresión varía con el maligno etapa de la enfermedad, y se pierden durante la invasión, pero una vez restablecido las células tumorales invaden la vasculatura [15]. El hallazgo informó aquí, en la que el IBC línea celular SUM 149 fue menos invasiva y adhesivo in vitro en comparación con los informes, menos agresiva de cáncer de mama línea celular SUM 102, parece apoyar una alternativa para el modo clásico de la difusión IBC citoesqueleto de actina mediada por células motilidad .

El alto nivel de expresión tanto de E-cadherina y RhoA por SUM 149 puede contribuir a la única invasoras fenotipo de IBC. Sin embargo, la señalización a través de E-cadherina a Rho está claro con E-cadherina mediada por la activación y la inhibición de Rho informó en una línea celular de forma específica [39]. Dominante negativo RhoA expresión en EL nE α y CL ha informado de las células para reducir la E-cadherina actividad [40]. Durante el desarrollo embrionario de epitelio estratificado, se constató que α-catenina, Rho, Rho quinasa y son vitales para el movimiento coordinado de los tejidos. En este sentido, mantener las células de tejidos a través de la arquitectura cadherina vinculante, pero moverse como una unidad a través de la reorganización de actina mediada por Rho y su efector abajo Rho quinasa [41]. Un argumento paralelo podría hacerse para la difusión de IBC, en el que las células tumorales estrechamente vinculado pasar como una coordinada frente. Esta posibilidad se puso a prueba en un ensayo de la cicatrización de heridas, en la que encontramos que el SUM 149 células no polarizar o avanzar en la herida después de 7,5 horas, lo que sugiere que esta forma de invasión no es el mecanismo por el que el IBC es la difusión.

Conclusión

Por lo tanto, nuestros resultados demuestran que la línea celular IBC SUM 149 es menos invasiva que la misma línea celular, SUMA 102, que se expresa menos Rho. Este hecho parece apoyar uno de los modos alternativos de difusión para IBC que la del modelo clásico invasoras, en la que las células individuales romper local y mover los archivos adjuntos a través de la ECM a través de la remodelación del citoesqueleto de actina. A modo de hipótesis de antes de la invasión de IBC, denominado metástasis pasiva, se parece, pues, el probable candidato (Figura 6A]. En pasiva metástasis, vasculogénesis, estimulada por factores secretados diferenciación, se produce en torno a un tumor de células émbolo que se ha mantenido firme célula-célula adjuntos [16]. IBC se sabe que secretan angiogénicos vasculogenic y posiblemente también los factores de crecimiento, tales como VEGF, bFGF, IL-6, IL-8 y [17]. Vasculogenic túbulo formación de las células del melanoma ha demostrado ser dependientes de la cadherina expresión [42]. E-cadherina positivo de tumor de células embolia situado en el cutánea linfáticos se encuentran típicamente en IBC histológica de los especímenes [15]. Tridimensional de la cultura SUM 149 células en matrigel resultados en IBC esferoides de células que recuerdan a las células tumorales embolia visto en la patología (Figura 6B]. La probabilidad de que las células IBC invadir el sistema circulatorio de un pasivo como mecanismo de la metástasis tumoral émbolos en lugar de por activa migratorias se está poniendo a prueba los mecanismos de análisis de imágenes in vivo de la proteína fluorescente etiquetados SUM 149 tumores mamarios en ratones SCID. Esta investigación podría cambiar drásticamente el curso de tratamiento IBC e identificar nuevas dianas terapéuticas específicas para esta forma de cáncer de mama.

Métodos
Cell Cultura

El SUM líneas celulares utilizadas para el estudio se han desarrollado recientemente de derrame pleural de los pacientes con cáncer de mama [18, 19] y son generosos donativos del doctor Stephen Ethier, de la Universidad de Michigan, MI. SUM 149 IBC es una línea celular que carece de la expresión de genes LIBC y overexpresses RhoC [5]. SUM 102, desarrollado a partir de un humano mínimamente invasivo del cáncer de mama [20] será utilizada como un modelo para los no-humanos IBC células de cáncer de mama. SUM 149 células fueron cultivadas en el F-12 Hams (Gibco ™, CA) suplementado con 5% de suero fetal bovino (Cultura de Tejidos Biológicos, CA), la insulina, y la hidrocortisona. SUM 102 células fueron cultivadas en el F-12 Hams (Gibco ™, CA) suplementado con 5% de la albúmina sérica bovina (BSA), factor de crecimiento epidérmico, T3, etanolamina, y selenita de sodio.

Los ensayos de adherencia

Adhesión celular ensayos se realizaron de acuerdo a [21]. En pocas palabras, el vidrio coverslips (Fisher Científico, TX) fueron recubiertas con 50 μ g / ml laminina (Gibco BRL, MD), 10 μ g / ml de colágeno I (BD Biosciences, MA), 10 μ g / ml de colágeno IV (BD Biosciences, MA) y se incubaron durante la noche a 4 ° C. El coverslips fueron bloqueados durante 1 hora con 1% al calor desnaturalizado BSA (Sigma Chemical Corporation, MO) en PBS. Células (10 5) se colocaron en coverslips y se permite que se adhieran durante 15 minutos. No adherentes células fueron eliminadas por el lavado. El adherente células fueron fijadas en el 3,7% formaldehído (Sigma Chemical Corp, MO) y manchados de F-actina como se describe más adelante en la cuantificación de las ayudas. El número de células por coverslip se cuantificó con un 40 × contraste de fase objetivo.

Haptotaxis invasión de ensayo

Cell invasión ensayos se realizaron como se describe en [22]. Modificado Boyden cámaras (cultivo de tejidos tratados, 6,5 mm de diámetro, 10 μ m de espesor, 8 μ m poros, Transwell ®, Costar Corp, Cambridge, MA) fueron recubiertos en la superficie superior (invasión), de la membrana con 50 μ g / ml laminina , 10 μ g / ml colágeno I, o 10 μ g / ml colágeno IV la noche a 4 ° C y luego colocado en la cámara baja contiene 500 μ l cultura de los medios de comunicación con 10% de suero fetal bovino (SFB). Suero de hambre células (10 5) han sido añadidos a la superficie superior de cada cámara de la migración y les permite migrar a la parte inferior de la membrana durante 24 horas (invasión). Las células no migratorias en la parte superior de membrana de superficie fueron removidos con una torunda de algodón, y las células migratorias adjunta a la parte inferior de la superficie de la membrana teñidas con yoduro de propidio (CalBioChem-Novabiochem Corp, CA). El número de células invasoras por membrana se contó con un microscopio de fluorescencia Olympus en posición vertical con un 40 × objetivo.

La cicatrización de heridas de ensayo

Las células fueron cultivadas a una monocapas, herido con una hoja de afeitar estéril y que se les permita migrar de 7,5 horas antes de la fijación, permeabilizing, y el bloqueo. Las células fueron teñidas con F-actina como se describe a continuación y visualizados mediante un microscopio de fluorescencia Olympus vertical.

Microscopía de inmunofluorescencia

Para focales de adherencia y F-actina tinción, las células fueron cultivadas en coverslips hasta que alcanzó el 60% y confluency de hambre durante 24 horas en la M-12 sin Hams. Las células fueron entonces estimulados con 50 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), el 5% de SFB, de control o de PBS por 10 minutos, fijada en el 3,7% formaldehído (Sigma Chemical Corp, MO), permeabilized con 0,2% Triton X-100 ( Sigma, MO), y bloqueada con 5% de suero de cabra (Gibco ™, CA), y el 5% de BSA (Sigma Chemical Corp, MO) en PBS. Las células se tiñeron con rodamina phalloidin (Molecular Probes Inc, OR) para visualizar F-actina, y un mouse monoclonal anti-fosfotirosina anticuerpo, el clon 4G10 (Upstate Biotechnology, NY), seguido de FITC-conjugado de cabra anti IgG de ratón (ICN Biomedicals Inc, CA) para visualizar las adhesiones focales. Fosfotirosina tinción a que comúnmente se utilizan para visualizar focal adherencias [23]. Por E-cadherina tinción, las células se cultivaron hasta el 60% confluency, fijados en metanol a -20 ° C durante 15 minutos, y bloquearon con 5% de suero de cabra (Gibco ™, CA) y el 5% de BSA (Sigma Chemical Corp, MO ) En PBS. Las células se tiñeron con el mouse monoclonal anti-E-cadherina anticuerpo, el clon del G-10 (Santa Cruz Biotechnology, CA), seguido de FITC-conjugado de cabra anti-ratón IgG (ICN Biomedicals Inc, CA). Las celdas eran imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus vertical con Spot avanzada cámara digital de software, la versión 2.2.1 (Diagnostic Instruments Inc, MI).

Immunoblotting

Las células fueron cultivadas a confluency en placas de 6 cm, y la bolita trypsinized lavados en PBS 1X. El pellet de células lisadas fue entonces en el 1% NP-40 buffer de lisis. Igual cantidad de proteínas, según lo determinado por Bio-Rad (Hercules, CA) ensayo de la proteína total, fueron separados por el 10% SDS-PAGE gel para Rho (A, B, yC), RhoA, y RhoC, o el 8% SDS - PAGE gel para la E-cadherina. Las proteínas celulares fueron luego transferidos a una membrana de nitrocelulosa. Membranas fueron bloqueadas con leche de 4% y 0,05% de Tween determinada con conejo policlonal anti-Rho (A, B, y C) (Upstate Biotechnology, NY), mouse monoclonal anti-RhoA (Santa Cruz Biotechnology, CA), de cabra policlonal anti - RhoC (Santa Cruz Biotechnology, CA), o el ratón monoclonal anti-E-cadherina (Santa Cruz Biotechnology, CA), seguido de peroxidasa de rábano-cabra conjugado de anticuerpos anti-ratón (Pierce Endogen, IL) de Rho o fosfatasa alcalina anti ratón conjugado de cabra Anticuerpos de E-cadherina (Pierce Endogen, IL). Rho immunoblots se detectaron con la Super Señal West Femto-Sustrato kit de quimioluminiscencia (Pierce Endogen, IL) y película Kodak Biomax MR (Fisher Científico, TX). E-Cadherin immunoblots se detectaron con NBT / BCIP sustrato de la fosfatasa alcalina (Pierce Endogen, IL).

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MRH participó en el diseño del estudio, llevado a cabo los ensayos, incluyendo su cuantificación y la interpretación, y fue el principal autor del manuscrito. KMW participaron en el cultivo de células, con la asistencia en las pruebas y de su cuantificación e interpretación, y ayudó a redactar y revisar el manuscrito. Fondo Social para el Desarrollo es el responsable de la concepción del proyecto, asesoramiento y formación sobre diseño experimental y los procedimientos, con la ayuda en el análisis e interpretación de datos, y ha ayudado a revisar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a la doctora Rebecca Richards-Kortum para la aportación fundamental durante la preparación de este manuscrito. Esta investigación fue apoyada por NIH / NCI CA83957-01A1 y la Universidad de Texas Ingeniería Biomédica de Semillas Subvención a la SD, del Departamento de Defensa de EE.UU. Ejército BC031906 a MH, y la Universidad de Texas a los Premios Sociedad Cooperativa KW.