Reproductive biology and endocrinology : RB&E, 2005; 3: 13-13 (más artículos en esta revista)

MAA modulación de la apoptosis inducida en células germinales masculinas: papel de las células de Sertoli P / Q-tipo de canales de calcio

BioMed Central
Fortunata Barone (fortunata.barone @ casaccia.enea.it) [1], Salvatore Aguanno (salvatore.aguanno @ uniroma1.it) [2], Angela D'Agostino (angela.dagostino @ uniroma1.it) [2]
[1] Biotechnology Unit Casaccia Research Center, ENEA, 00060 Rome, Italy
[2] Department of Histology and Medical Embryology, University of Rome "La Sapienza", 00161 Rome, Italy

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Resumen

Espontánea de células germinales de muerte por apoptosis se produce en condiciones normales de la espermatogénesis en mamíferos y se cree que juegan un papel fisiológico en el mecanismo de limitación de la expansión clonal de esa población celular en la gónada masculina. En el testículo prepuberal rata, la más notable de células que mueren son pachytene espermatocitos, que también son el objetivo principal de la apoptosis inducida experimentalmente por la methoxyacetic ácido (MAA). Desde que nos han informado recientemente de que las células de Sertoli, la somática componente del epitelio seminífero, regular no sólo la viabilidad de células germinales y diferenciación, pero también de su muerte, hemos seguido investigando los mecanismos implicados en dicho control.

En el presente trabajo se han utilizado la proteína clusterin, producida por las células de Sertoli y tejidos asociados con el daño o el perjuicio, ya que el indicador de la apoptosis de células germinales en los túbulos seminíferos de rata tratados con MAA, en presencia o en ausencia de omega-agatoxin, un inhibidor específico De P / Q tipo de voltaje que funciona con los canales de calcio (VOCC). Se realizó un análisis cualitativo de contenido clusterin apoptosis de las células germinales y por inmunofluorescencia experimentos y un análisis cuantitativo por fin situ en el etiquetado de las células germinales seguida de apoptosis por citometría de flujo. Los resultados obtenidos demuestran que las células de Sertoli modular la apoptosis de las células germinales inducida por ácido methoxyacetic también en el P / Q-tipo VOCC's.

Antecedentes

Espermatogénesis en mamíferos es un proceso complejo que depende de la estimulación hormonal, así como la interacción dinámica entre las células de Sertoli, la somática componente del epitelio seminífero, y las células germinales. De hecho, en el testículo las células germinales de mamíferos, la diferenciación de las espermatogonias a espermatozoides maduros, están en estrecho contacto con las células de Sertoli, que el suministro de nutrientes y la hormonales esenciales para el éxito de las señales de la espermatogénesis. Espontánea muerte de las células germinales se produce normalmente durante la espermatogénesis por el proceso de apoptosis [1], que supone la pérdida de hasta el 75% del número potencial de espermatozoides [2], probablemente como un mecanismo fisiológico que limita la expansión clonal de las células germinales y Los espermatozoides liberación. Este proceso ha estimulado una serie de estudios in vivo e in vitro por los investigadores que trabajan en el ámbito de la endocrinología reproductiva masculina y toxicología [3 - 5], con el objetivo de definir los mecanismos celulares y moleculares de ambas espontánea y tóxica inducida germen Apoptosis de las células. Entre las sustancias tóxicas más comunes que inducen lesiones del sistema reproductivo masculino [6 - 8] el 2-metoxietanol glicol (2-ME), una de las principales bioproduct industria de la pintura, causa graves lesiones testiculares en muchas especies de mamíferos, incluido el hombre [9] . Al utilizar el ácido methoxyacetic (MAA), el metabolito tóxico proximal de la 2-ME, de germen de la muerte de las células puede ser inducida in vitro en los túbulos seminíferos culturas [10]. En ratas de 18-21 días de edad, que aún no han completado el proceso de spermatogenetic, el MAA-se refiere a la muerte celular inducida por una gran proporción de pachytene espermatocitos. Recientemente hemos demostrado que esos MAA inducida por la apoptosis es significativamente impedido por co-tratamiento con nifedipino y ω-conotoxin [11], que bloque, respectivamente, y de tipo L-N-tipo de voltaje que funciona con los canales de calcio (VOCC). Canales de Ca + + en muchos diferentes tipos de células activar a la despolarización de membrana y mediar Ca + + afluencia en respuesta a potenciales de acción y sub-umbral depolarising señales. Ca + + entrar en las células a través de la VOCC sirve como mensajero de la segunda eléctrica de señalización, de la iniciación de eventos intracelulares como la contracción, la secreción, la transmisión sináptica, y la expresión de los genes.

L-N-tipo y el tipo de VOCC están presentes en la membrana plasmática de células de Sertoli [12] y sobre todo encuentra a nivel de superficie de contacto entre las células de Sertoli y pachytene espermatocitos adluminal en el compartimento del epitelio seminífero [12]. Esos canales de calcio son los responsables de la considerable afluencia de Ca + + en las células de Sertoli de rata [13], y desempeñar un papel en la laminina dependen de los productos básicos [Ca + +] i elevar en células de Sertoli y secretora de células de Sertoli en el proceso [14, 15].

Además de L-y N-tipo VOCC's, en la membrana plasmática de células de Sertoli está presente un tercer tipo de canales de Ca 2 +, el P / Q tipo [12], específicamente bloqueado por el ω-agatoxin IVA, un péptido aislado del veneno de Agenolanopsis aperta. Estos canales están localizados en las membranas plasmáticas de células de Sertoli, adyacente a la lámina basal, a nivel de la barrera sangre-testículo, que selecciona las sustancias que pueden llegar a la luz de los túbulos seminíferos. P / Q tipo de canales se ha demostrado en las neuronas en el que son los primeros responsables de la entrada de Ca 2 + y la liberación de neurotransmisores en las sinapsis rápido [18]. Además, varios tipos de células endocrinas expresar estos canales de Ca 2 +, a menudo se considera aún que se expresen sólo en el sistema nervioso. Células pancreáticas [19], células de la pituitaria [20], suprarrenal medular de células cromafines [21], así como assmall células de carcinoma de pulmón de células [22] y de secretar insulina líneas celulares [23] expresar P / Q tipo de canales de Ca 2 + que participan en El control de su actividad secretora.

Clusterin es una glicoproteína heterodimeric doquier expresó que es la principal proteína producida por las células de Sertoli de rata cultivadas [16]. Un tema común en varios tejidos es la asociación de clusterin con daño tisular o lesión. Se ha demostrado [11, 17] que, en la apoptosis inducida por MAA, derivado de células de Sertoli clusterin es muy temprano en el acumulado en el citoplasma de las células germinales que mueren en un determinado momento de la diferenciación, es decir, pachytene espermatocitos.

En el presente estudio se utilizó la proteína clusterin como un marcador de la apoptosis de verificar si las células de Sertoli P / Q-tipo del VOCC participan en la modulación de la MAA de la muerte inducida de células germinales. La presencia de la VOCC en el epitelio seminífero sólo en la membrana plasmática de células de Sertoli y no en las células germinales es muy intrigante. ¿Cuál es la función de esos canales en la espermatogénesis?

Debido a su papel de mediador de exocitosis y de su peculiar localización en el plano de la barrera sangre-testículo, que se investigue si P / Q tipo de canales, así como la L-y N-tipos, estuvieron involucrados en el proceso de apoptosis de las células germinales , La modulación de las células de Sertoli MAA respuesta a la lesión, clusterin secreción y acumulación en pachytene espermatocitos y, en consecuencia, la muerte de las células germinales.

Métodos
Productos Químicos

Ω-agatoxin se adquirió de Péptido Instituto, Louisville, KY. Ω-conotoxin GVIA fue adquirido por Bachem, Reino Unido. Otros productos químicos, a menos que se especifique lo contrario, son de la más pura disponible grado de Sigma (St Louis, MO).

Animales

Hombre rata Wistar fueron utilizados en todos los experimentos. Los animales fueron alojados de conformidad con las directrices para el cuidado de los animales de la Universidad de Roma "La Sapienza", y fueron muertos por asfixia humanamente con CO 2 antes de la extracción de órganos. Los testículos inmaduros fueron extirpados de ratas Wistar con edades de 18 a 21 días, cuando la espermatogénesis es todavía incompleto, se lava y se procesa inmediatamente después de la escisión, tal como se describe a continuación.

In vitro de células de Sertoli culturas

Monocapas de células de Sertoli se prepararon de los testículos, de 18 de los 21 días de edad ratas Wistar según métodos descritos anteriormente [11, 12]. En pocas palabras, después de la escisión, los testículos se decapsulated mecánicamente, la reducción en pequeños fragmentos y resuspendido en la igualdad de volumen de minimo Eagle's Essential Medium (MEM) (Life Technologies, Inc, Grand Islas, NY). Los fragmentos fueron digeridos con tripsina 0,25% (Difco Laboratories, Detroit, MI) 10 μ g / ml DNAase I (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) por 30 min a 32 ° C, y luego se lava con Hank's Balanced Salt Solutions (HBSS) (Sigma , St Louis MO) y digeridos con HBSS complementado con un 0,1% de colagenasa más 10 μ g / ml DNAase I (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) para extraer el tejido intersticial peritubular y células. La suspensión celular fue después se centrifuga a 15 × g durante 5 min. "Pellets" se resuspendió 1:10 en el suero libre de Earle's MEM con la sal (Life Technologies, Inc, Grand Islas, NY). Las células fueron entonces de plata de 3,5 cm en cajas de Petri y se incuba a 32 ° C en atmósfera controlada de 95% de aire y 5% de CO 2. El día 3 de la cultura, monocapas de células fueron sometidas a tratamiento hipotónico [14] eliminar completamente endógena de las células germinales y se recuperarse a las 24 horas. Los experimentos se realizaron en el día 4 de la cultura.

El tratamiento con MAA

A 500 mM solución madre de MAA> 97% puro (Fluka, CH9471 Buchs SG, Schweiz) fue preparado por el método de dilución en medio de cultivo y el pH se ajustó a 7,4 con 1 N NaOH. MAA Este balance fue diluido a una concentración final de 5 mM en el medio de cultivo.

El tratamiento con bloqueadores de los canales de calcio

Stock soluciones fueron preparadas con los vehículos (H 2 O, 100% o 100% de etanol DMSO), de acuerdo a su solubilidad. El final de las concentraciones de etanol y DMSO en los cultivos fueron ≤ 0,1%. - Controles de vehículos sólo se incluyeron en todos los experimentos. No hay diferencias entre las medianas y sólo controla el vehículo-sólo los controles se observó durante los experimentos.

Túbulos seminíferos in vitro culturas

Testículos de 18-21 días de edad, las ratas fueron digeridos decapsulated y bajo agitación suave a temperatura ambiente en MEM con 1 mg / ml de colagenasa A (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). Después de la dispersión de la intersticio tubular de la masa fue lavarse con MEM, y luego se extiende de los túbulos fueron disecados por medio de agujas y fuerte cuidadosamente transferidos a 3,5 cm de la cultura platos en 300 μ l de medio. Los túbulos se incubaron durante 10 minutos a 32 ° C en una cámara de humidificado bajo una atmósfera que contiene un 5% de CO 2. Al final del tiempo de incubación, el medio fue reemplazado por 600 μ l de media a estar expuestos a diferentes tratamientos.

SDS-PAGE y immunoblotting

Cultivadas de células de Sertoli se desprendieron de la cultura platos, pildoradas y lavados con PBS. "Pellets" se resuspendido en buffer de lisis (150 mM NaCl, 1% SDS, 20 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, inhibidor de la proteasa de mamíferos Cocktail (Sigma, St Louis, MO), pH 8), y se incubaron 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras fueron luego se centrifuga a 10, 000Xg durante 10 min. Las muestras que contengan 20-40 μ g de proteína se cargaron en el 10% Tris-Glicina-Bis geles de acrilamida, en virtud de la reducción de las condiciones de plazo y borró a 0,45 μ m membrana de nitrocelulosa (Novex). Después de un bloque de la noche a la mañana con un 5% (v / v) de leche desnatada en PBS, la blots fueron immunostained el 1,5 Horas con anticuerpos policlonales de cabra planteadas en contra de un péptido de cartografía en el carboxilo terminal de ratón clusterin de origen (500 ng / ml) (Santa Cruz Biotecnología Inc). Después de la incubación en la fosfatasa alcalina-conejo conjugada anti-IgG de cabra (Sigma, St Louis, MO) (1:1000), bandas inmunorreactivas se detectaron por una mayor utilización de la metodología quimioluminiscencia ECL-Plus, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham Biosciences Europe GmbH). Todos los anticuerpos fueron diluidos en el 2% de la leche desnatada en PBS (v / v) y la mancha se lavaron con PBS extensamente entre cada etapa. Immunoblots fueron escaneados y digitalizados imágenes fueron analizadas por densitometría cuantitativamente con AIDA 2,0 programa.

Immunoprecipitation experimentos

Immunoprecipitation experimentos se llevaron a cabo para examinar si el VOCC del bloque de MAA tratados con células de Sertoli cultivadas podría modular la secreción clusterin. Células de Sertoli eran etiquetados de la cultura con 50 μ Ci / ml de 35 S-metionina (NEN Life Science Products, spec. Actividades. 1175 Ci / mmol) por 6 horas, en presencia de 5 mM MAA más el ω-agatoxin (1 μ M) . Al final de la incubación, los medios de comunicación fueron removidos y procesados, tal como se describe. Por immunoprecipitation, hemos utilizado la proteína-GSepharose cuentas (Amersham Pharmacia Biotech), que fueron primero RIPA resuspendido en buffer (150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% de sodio deoxycholate, y el 1% NP40), lavados dos veces y luego incubadas durante 3 h con Una cabra de anticuerpos policlonales planteadas en contra de un péptido de cartografía en el carboxilo terminal de ratón clusterin de origen (500 ng / ml) (Santa Cruz de Biotecnología Inc), que se utiliza para la inmunocitoquímica, también. Tras varios lavados con buffer RIPA, cuentas fueron incubadas con medios de cultivo de células de Sertoli durante la noche a 4 ° C con agitación continua. 1000Xg Después de la centrifugación de 1 min sobrenadante y la remoción, los pellets fueron lavados varias veces y luego resuspendido en buffer Laemmli muestra (20% de glicerol, 10% β-mercaptoetanol; 5% SDS; 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, y 0,4% de bromofenol Azul). Las muestras fueron hervidas durante 5 min y se ejecutan en un 12% SDS-gel de poliacrilamida seguida de fluorography. Imágenes digitalizadas fueron analizadas por densitometría cuantitativamente con AIDA 2,0 programa.

Immunolocalisation de clusterin en túbulos seminíferos cryosections

La inmunohistoquímica clusterin localización de la proteína se realizó en cryosections (6 μ m), de los túbulos seminíferos cultivadas en la presencia de MAA, MAA, más ω-agatoxyn o sin cualquier sustancia añadida (control). Las láminas fueron fijadas por primera vez con el 4% paraformaldehido durante 10 min a 4 ° C, lavados dos veces con PBS y pre-incubados con PBS más 4% BSA durante 20 min. A temperatura ambiente. Secciones fueron tratados con 0,1% y 0,1% Triton citrato de sodio en hielo durante 5 min y teñidas con un anticuerpo policlonal de cabra planteadas en contra de un péptido de cartografía en el carboxilo terminal de ratón clusterin de origen (500 ng / ml) (Santa Cruz de Biotecnología Inc .), Por 60 min a 4 ° C en una estrecha, humidificado cámara. Entonces, la cryosections se lavaron dos veces con PBS más 1% de BSA y se incuba con una FITC-conjugado de conejo anti-anticuerpo secundario de cabra (Sigma, St Louis, MO), lavada con PBS y fotografiado por un microscopio de fluorescencia Zeiss con un sistema de procesamiento de imágenes Axiocam .

Detección de la apoptosis de las células germinales de los túbulos seminíferos cryosections

La apoptosis se detectó en cryosections túbulos seminíferos (6 μ m) utilizando un sistema de detección de la apoptosis, el In Situ Cell Death Kit de detección (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). El sistema final de las etiquetas de la fragmentación de ADN de las células germinales apoptóticas utilizando modificados terminal deoxynucleotidyl transferasa mediada dUTP nick de fin de etiquetado (TUNEL) ensayo. Consiste en la incorporación de biotynylated nucleótidos en el ADN 3'-OH termina, utilizando la enzima terminal deoxynucleotidyl transferasa (TdT). El ensayo se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. En resumen, las secciones se rehidrata, lavados en PBS e incubadas a 37 ° C durante 1 hora con una mezcla de reacción TUNEL. Esto permite la detección directa de la fragmentación de ADN en células apoptóticas con fluoresceína-12-dUTP por medio de la enzima TdT. Controles negativos fueron procesados de la misma manera, salvo que se omitió TdT. Como controles positivos, secciones de los túbulos seminíferos de control fueron tratados con DNAase I durante 10 minutos antes de llevar a cabo la reacción final de etiquetado. Después de los lavados necesarios, las secciones estaban cubiertos con glicerol y vidrio coverslips.

Citometría de Flujo

Para el análisis cuantitativo de los niveles de apoptosis de las células germinales, la suspensión celular preparado a partir de los túbulos seminíferos se analizó por citometría de flujo utilizando un sistema de detección de la apoptosis (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). Túbulos seminíferos cultivadas cultivadas en la presencia de MAA, MAA, más ω-agatoxyn o sin cualquier sustancia añadida (control) fueron digeridos con tripsina 0,25% y 0,02% y EDTA testicular suspensión celular fue permeabilized permeabilización con una solución (0,1% Triton 100X en 0,1 % Citrato de sodio) durante 2 min en hielo. A continuación, las células se resuspendió en 50 μ l de mezcla de reacción TUNEL o etiqueta solución como control negativo durante 60 min a 37 ° C, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células se resuspendió en un volumen final de 500 μ l de PBS y se analizaron con un Coulter Epics XL flujo cytometer (Beckman Coulter).

Para la detección de los niveles clusterin, suspensión celular de epitelio seminífero se lavan una vez con PBS frío, más el 1% de BSA antes de la incubación con anticuerpos. Luego, las células fueron fijadas con paraformaldehido 1% en frío durante 5 min, mientras que el 0,1% y el 0,1% Triton citrato de sodio en PBS se utiliza para la permeabilización. Para la detección de clusterin intracelular, las muestras fueron incubadas durante la noche a 4 ° C con un anticuerpo policlonal de cabra planteadas en contra de un péptido de cartografía en el carboxilo terminal de ratón clusterin de origen (500 ng / ml) (Santa Cruz de Biotecnología Inc). Posteriormente, las células fueron lavadas dos veces con PBS más 1% de BSA y se incubaron 30 min en el hielo con un FITC-conjugado anti-conejo cabra secundaria de anticuerpos, lavados dos veces con PBS más 1% de BSA, y analizado. Las células se utilizan con acceso por parte de dispersión hacia adelante frente a excluir las células muertas y los desechos. Fluorescencia de 10 4 células / muestra fue adquirido en el modo logarítmico para la inspección visual de la distribución, y en el modo lineal para cuantificar la expresión de las moléculas mediante el cálculo de la media de intensidad de fluorescencia. Además del análisis morfológico, el ADN teñido con yoduro de propidio de ploidía de análisis para evaluar la pureza de cada fracción de células germinales, como ha sido descrito previamente [24].

Estadísticas

Prueba t de Student se utiliza para la comparación estadística entre los medios cuando corresponda. El software estadístico utilizado fue el SPSS versión 9.0 (Chicago, Illinois).

Resultados
Efectos de la MAA y ω-agatoxin rata en células de Sertoli en la cultura

Con el fin de utilizar el clusterin como marcador de P / Q-VOCC's tipo de modulación de la apoptosis es necesario verificar si clusterin nivel intracelular, que es estimulada por la MAA de rata cultivadas en células de Sertoli [17, 11], fue modulada por P / Q - El tipo de canales de Ca 2 +. Con el objetivo de responder a esta pregunta, las células de Sertoli de 18-21 días de edad ratas Wistar se cultivaron durante 6 horas con cualquier fármaco añadido (control) o en la presencia de 5 mM y MAA, de 5 mM MAA más el inhibidor específico de la P / Q-tipo de canales de Ca 2 +, la ω-agatoxin (1 μ M). Las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE seguida de Western blot y inmunomarcación con anticuerpos policlonales planteadas contra clusterin. Fig. 1 muestra que el MAA-aumento de la cantidad de clusterin se redujo considerablemente en las muestras tratadas con MAA más ω-agatoxin. Fig. 2 muestra también una modulación de la clusterin secretada en el medio de cultivo: las células de Sertoli, cultivadas en la presencia de MAA, secretan una gran cantidad de clusterin respecto a la de control, el bloque del P / Q canales de ω-agatoxin reduce Esa secreción a los valores basales.

Efectos de la MAA y ω-agatoxin sobre la apoptosis de células germinales en los túbulos seminíferos de rata cultivadas

Con el objetivo de estudiar el efecto de la MAA y ω-agatoxin sobre la apoptosis en el epitelio seminífero, túbulos seminíferos se cultivaron durante 6 y 12 horas, en presencia de MAA (5 mM), y MAA más ω-agatoxin (1 μ M) . Los controles se realizaron en ausencia de cualquier fármaco añadido al medio de cultivo. El tiempo de 6 horas fue elegido porque es el mínimo tiempo necesario para identificar el clusterin en el citoplasma de espermatocitos pachytene [11, 17], mientras que 12 horas es el tiempo mínimo necesario, en nuestras condiciones experimentales, para la detección de apoptosis en células cultivadas seminíferos Túbulos.

Al final de la cultura de una alícuota de los túbulos seminíferos se immunostained con anticuerpos contra clusterin planteadas por TUNEL o transformados, con el fin de visualizar, respectivamente, el efecto de la MAA y ω-agatoxin sobre clusterin localización y en la apoptosis de células germinales en cryosections histológico. El resto de alícuota de los túbulos seminíferos se trypsinized con el fin de medir cuantitativamente el clusterin contenido de la apoptosis y por el análisis de citometría de flujo. El clusterin contenido fue evaluada después de inmunomarcación de las células con anticuerpos contra planteadas clusterin mientras que la apoptosis se determinó por TUNEL.

La inmunofluorescencia análisis de la anatomía cryosections (Fig. 3] muestra que, después de 6 horas de la cultura, el tratamiento con MAA no sólo aumenta el contenido de clusterin en células de Sertoli (flechas dobles), pero las evidencias de la presencia de clusterin también en las células germinales ( Solo flechas) que se reduce en presencia de ω-agatoxin. Paralelamente, el análisis de citometría de flujo cuantitativa confirmó estos resultados. Luego de 6 horas de la cultura, clusterin contenido se incrementa en MAA tratados con túbulos seminíferos (gris histograma 2), y se redujo en los túbulos seminíferos tratados con MAA más el ω-agatoxin (gris histograma 3). La apoptosis no es apreciable (negro histogramas), de acuerdo con datos de la literatura in vitro e in vivo [10, 11], debido al poco tiempo de MAA tratos. En la Fig. 4, el análisis de inmunofluorescencia túbulos seminíferos cultivadas durante 12 horas demuestra que la apoptosis de los espermatocitos pachytene (solo flechas) es mayor en presencia de la MAA y disminuye por la VOCC del inhibidor. Fig. 4 también figura el análisis realizado por citometría de flujo: ω-agatoxin (histogramas 3) hace disminuir el MAA inducida por apoptosis de las células germinales (histograma 2). Fig. 5 muestra una comparación entre ω-agatoxin, nifedipina y ω-conotoxin efectos sobre la apoptosis inducida por MAA. El efecto inhibidor debido al bloque de P / Q canales de tipo parece menos pronunciado (media + / - SEM: 51 + / - 2,8) que el de la L (nifedipina-sensibles) (media + / - SEM: 30 + / - 1,4 ) Y N (ω-conotoxin-sensibles) (media + / - SEM: 33.5 + / - 3.5) tipo VOOC'S. Expresado como porcentaje de la MAA ofinhibition respuesta, el bloque debido a ω-agatoxin es de 85%, mientras que la nifedipina y ω-conotoxin bloques son de 91% y 90%, respectivamente.

Discusión

Un creciente cuerpo de evidencia que demuestra tanto espontánea (en condiciones normales de la espermatogénesis) y el aumento de células germinales de muerte provocada por diversos estímulos regulador [25 - 29] en ratas se producen a través de la apoptosis. Sin embargo, los mecanismos por los que estos estímulos proapoptóticos activar la muerte de las células germinales no se conocen bien. Recientemente, hemos propuesto un mecanismo de calcio mediada por apoptosis inducida subyacente spermatocyte por MAA [11]. Se ha demostrado que, en la rata epitelio seminífero células de Sertoli pueden modular la apoptosis de las células germinales de todo tipo y la L-N-VOCC del tipo y que los contactos entre las células de Sertoli y las células germinales son necesarios para tal modulación [11].

En el presente estudio hemos demostrado que las células de Sertoli participan en MAA inducida por apoptosis de las células germinales en todo VOCC también está bloqueado por ω-agatoxin, es decir, de P / Q tipo. El bloque de tales VOCC del inhibe la acumulación de células de Sertoli-clusterin producido en el citoplasma de las células germinales, como consecuencia de la MAA de tratamiento, y previene la apoptosis pachytene spermatocyte. Los datos presentados aquí, sin embargo, ponen de manifiesto que, desde un punto de vista cuantitativo, la inhibición de la muerte de las células germinales es menos pronunciado respecto al inducido por nifedipino y ω-conotoxin, sugiriendo un papel sinérgico de P / Q canales de calcio tipo. Estos resultados encajan bien con la peculiar localización de P / Q canales de calcio tipo en el epitelio seminífero.

La anterior identificación de los P / Q canales de la membrana plasmática de células de Sertoli en la zona adyacente a la lámina basal y su participación en la modulación de la secreción de la proteína [12], sugiere un papel en el plano de la barrera sangre-testículo (CEL ), Que selecciona las sustancias que pueden llegar a la luz de los túbulos seminíferos. En el plano de la CEL Ca 2 + juega un papel relevante. Se sabe que las células de Sertoli barrera puede ser perturbado y volver por manipular [Ca 2 +] en el medio de cultivo [31]. En la rata, todo el proceso de desarrollo de células germinales, con la excepción de la primera fase de la espermatogénesis, se separa de la circulación sistémica por la CEL. Esto significa que cualquier sustancia tendría que pasar por el citoplasma de células de Sertoli para llegar a la tarde y después de los meióticas meióticas células germinales. P / Q canales tipo debe representar el primer "centinela" puertas de las células de Sertoli, y que pudiera constituir un primer mecanismo inhibitorio respecto a la L-N-y el tipo de canales, que están localizadas profundamente en el epitelio seminífero, cerca de la luz de los túbulos . Además, la comprobación de que el bloque de P / Q-tipo VOCC inhibe la apoptosis de las células germinales menos de L-y N-debe sugerir un tipo gradual, el control espacial de la muerte de las células germinales.

La disminución de clusterin intracitoplasmática de las células de Sertoli y la inhibición de su acumulación en pachytene espermatocitos, a raíz de P / Q canales de bloque, sugieren que los canales de calcio de control de la apoptosis de células germinales en todo un mecanismo indirecto. El efecto protector de los bloqueantes de los canales de calcio MAA contra la apoptosis inducida por spermatocyte es probablemente mediada por la inhibición de la clusterin transferencia de células de Sertoli de células germinales. Esta hipótesis de acuerdo con datos recientes de la literatura que demuestran que la forma de clusterin intracelular podría ser citotóxico [32 - 34]. Clusterin acumulación en las células germinales podría ser un mecanismo de selección de las células lesionadas en segundo lugar, y se comprometieron a muerte. Por otra parte, al ser las células de Sertoli el blanco directo de MAA, el perjudicado no debe de células más capaz de apoyar una mayor diferenciación de las células germinales y deben limitar el número de espermatocitos. Esta última hipótesis de acuerdo con los últimos resultados obtenidos en las ratas tratadas con MAA-donde la expresión de las dos células de Sertoli proteína del receptor de andrógenos y de la proteína de unión de andrógenos son significativamente alterada [35]. Se sabe, de hecho, que la disminución de los receptores de andrógenos es concomitante a la disminución de los niveles de andrógenos intratesticular y se acompaña de importantes apoptosis de las células germinales [7, 36]. Expresión alterada de SPA en ratones transgénicos está asociada a la apoptosis de los espermatocitos pachytene [37].

Además, en este trabajo se demuestra un papel de la P / Q-tipo VOCC específicas para el control de la muerte de las células germinales masculinas. En otros tipos de células, es decir, las neuronas corticales en cultivo, expuestas a la proteína amiloide β con el fin de inducir la apoptosis, el bloque de tipo L-voltaje-sensibles canales de Ca + + atenúa la apoptosis neuronal mientras que el bloque de la N-y P / Q tipo de canales ha Ningún efecto [38].

Nuestro trabajo confirmar y ampliar datos anteriores que muestran que la VOCC del localizados exclusivamente en la membrana plasmática de células de Sertoli modular de células de Sertoli respuesta a las lesiones que podrían dañar la diferenciación de células germinales. Tal intratesticular mecanismo regulador el control de la apoptosis de células germinales añade una nueva pieza del rompecabezas en relación con el conocimiento del programa de apoptosis en el testículo [39].

Contribuciones de los autores

FB fue responsable de la actividad experimental. Se realizaron cultivos celulares, inmunofluorescencia y análisis de citometría de flujo, partecipated en el análisis de los datos y en la redacción del manuscrito. SA colaboró en el análisis de inmunofluorescencia cryosections túbulos seminíferos y proporcionó valiosas sugerencias durante el manuscrito escrito. AD encargada de la coordinación y diseño del estudio. Se analizaron los datos y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido apoyado por una beca de MIUR 2002, y por contribuye de Agilent Technologies y Fondazione Cassa di Risparmio di Roma.