Virology Journal, 2005; 2: 27-27 (más artículos en esta revista)

Caracterización físico-química de vibriophage N5

BioMed Central
Anindito Sen (sena@mail.nih.gov) [1], N Amar Ghosh (ghoshan@hotmail.com) [1]
[1] División de Microscopía Electrónica, Instituto Nacional de Cólera y entéricas Diseaess, P-33, CIT Road, Scheme-XM, Beleghata, Kolkata-700010. India
[2] (Dirección Actual) Laboratorio de Biología Estructural, Sala 1504, Edificio 50, NIAMS / NIH Bethesda, MD, 20852, EE.UU.

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Resumen

Fagos N5 es uno de los fagos de Vibrio cholerae O1 serovar biotipo El Tor (Ghosh, AN, Ansari, MQ, y Dutta, GC Aislamiento y caracterización morfológica de El Tor cólera fagos. J. Gen. Virol. 70: 2241-2243, 1989). En la presente comunicación la curva de crecimiento, peso molecular y la confirmación del genoma, la desnaturalización parcial de ruta y de endonucleasa de restricción digestión patrón que se ha determinado. Desnaturalización parcial indica que el mapa del genoma no ha permutada / secuencia invariante. Presencia de cohesión termina también se ha documentado.

Vibrio cholerae, el agente causal del cólera en humansis clasificarse en dos serotipos: O1 y nonO1 [1]. Las cepas O1 se divide en dos biotipos: Clásico y El Tor. Antes de 1961 la mayoría de las epidemias han sido causadas por el biotipo clásico. Sin embargo después de 1961 las cepas El Tor se convirtió en el principal agente causal del cólera. Fagos escribiendo ha demostrado ser útil y eficaz herramienta para el tracto la propagación de esta terrible enfermedad. Vibriophage también ha demostrado ser útil en el estudio de los cromosomas de acogida [2]. En el presente trabajo se informe de la caracterización físico-química de un ElTor vibriophage N5 que se aisló de las muestras de agua de alcantarillado de Calcuta, India [3].

El N5 fagos fue aislada de la red de alcantarillado de agua de Calcuta [3] y se propagó sobre MAK 757, un Vibrio cholerae O1 ElTor cepa. - Un paso curva de crecimiento de este fago se realizó siguiendo el método descrito en el Adams [4]. Acerca de 10 5 células de recién cultivadas MAK 757 estaban infectadas con el N5 de fagos en una moi de 0,1. Una alícuota se retiró por cada 5 minutos y se titula para el número total de fagos. Un total de 8 × 10 8 unidades formadoras de placa se generan después de 50-55 minutos desde el momento de la infección. El período de eclipse es casi 8-10 minutos.

Un lisado de fagos N5 se preparó sobre soft agar (1% nutrientes de Agar, pH 7,4, 0,5% de NaCl 1,5% Agar, HiMedia laboratorios, Mumbai, India) usando superposición recién cultivadas MAK 757 (moi de 0,01), como la propagación de la cepa [ 4]. Unas pocas gotas de cloroformo se añadieron a la recién preparada para eliminar los fagos lisado bacteriano contenido en el mismo. El lisado de fagos (casi 10 9 fagos / ml) fue objeto de ultracentrifugación a 35000 rpm durante 1 h 30 min en un rotor Sorval T 865 y una bolita de fagos se obtuvo. Los fagos pellet se resuspendió en 1 ml de 50 mM - Tris-HCl pH 7,5, 20 mM - MgCl 2 (TM buffer) de concentración y de los fagos se almacenaron a 4 ° C. Los fagos fue purificado en un gradiente de sacarosa paso de 10% a 40%, tal como se describe anteriormente [5, 6] utilizando un Sorval TW 668 swing-out rotor revolución en la velocidad de 35000 rpm durante 1 h 15 minutos. El pellet de fagos purificados l se volvió a suspenderse en 1 ml de TM de amortiguación y almacenadas a 4 ° C. La concentración final fue casi la resuspensión 10 11 fagos / ml.

El N5 isomérica fagos tiene una cabeza con una muy breve no contráctil cola (figura 1 bis inserción). El diámetro (distancias entre lo contrario apices) de la de la cabeza es casi igual a 71,5 ± 1,5 nm y la longitud de la cola es igual a 12,2 ± 1,9 nm. Las colas son tan cortas que en muchos de los fagos, cuando observó bajo microscopio electrónico, las colas no son visibles debido a la inadecuada orientación de la muestra de cine o de la rotura de apoyo durante la preparación de fagos. N5 fagos pertenece a la 'podoviridae' la familia de acuerdo con el comité internacional para la taxonomía de los virus (1982).

El alto título purificada lisado de fagos (10 11 / ml) se mezcla con igual volumen 0,0625 M Tris-HCl (pH 6.8) con un 1% a lo largo de dodecil sulfato de sodio (SDS) 15% de glicerol, 1% Beta-mercaptoetanol y azul de bromofenol. La solución entonces se incubaron a 100 º C durante 3 minutos. SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se realizó por el método de Laemmli [7], aprobado por Sambrook et al. [8], para la obtención de la SDS-PAGE patrón de las proteínas estructurales de la N5 fagos. La aparente masas moleculares de los polipéptidos vibriophage N5 fueron evaluados por SDS-PAGE 12,5% paso-electroforesis en gel (figura 2a]. De la figura 2a encontramos cuatro grandes bandas de los tamaños de 51 kDa, 37 kDa, 25 kDa y 18 kDa, respectivamente. El componente principal tiene un tamaño molecular de 51 kDa (aprox.). Sin embargo, dos pequeñas bandas de 15 kDa y 12 kDa también en el paso SDS-PAGE-electroforesis en gel de paso, junto con varias otras bandas extremadamente débil que apareció en la figura 2 bis, que son probablemente los desechos de bacterias.

Una comparación de estos resultados con el SDS-PAGE de la N4 fagos [6] revela que las masas moleculares de los polipéptidos N5 son ligeramente más alta que la de fagos N4. Sin embargo, la segunda banda de 37 kDa en N5 (figura 2a] es muy buena parte del mismo tamaño que el de los 36 kDa de la N4 fagos. De hecho, el SDS-PAGE de las proteínas estructurales de la N5 vibriophage asemeja el SDS-PAGE patrón de otro Vibrio El Tor fagos e5 [9], que también tiene un polipéptido de 51 kDa como un componente importante.

N5 vibriophage Se extrajo el ADN de los fagos utilizando fenol-cloroformo método descrito en Sambrook et al., [8] y dializados contra 20 mM NaCl, 5 mM EDTA, (pH 7.4) buffer. El ADN fue N5 propagación de proteínas utilizando la técnica de monocapas de Kleinschmidt et al. [10] con las modificaciones que se describen en [11] Inman. Alrededor de 500 ng / ml N5 de ADN se mezcló con 50 ng / ml de pBR322 con marcador de ADN a lo largo de 0,067 M Na 2 CO 3, 0,0107 M EDTA, 50% formamida (Sigma), y 0,01% citocromo c (Sigma) a pH 7,4. El hypophase fue el doble de agua destilada. La proteína ligada al ADN fue recogida en redes de carbono recubiertos de níquel, teñidas con acetato de uranilo y fue sometido a la sombra rotativo con platino. Figura 1b muestra una N5 ADN. Los dos extremos (marcados con flechas) son claramente visibles indicando así que la N5 ADN es lineal. La longitud de la N5 fagos ADN se calcula a ser 40,7 ± 0,7 kb, en comparación con pBR322 DNA de longitud 4,36 kb utilizarse como un marcador (no visto en la figura 1]. Esto es muy similar al tamaño de la N4 vibriophage lineal de ADN que tiene un tamaño de 40,4 ± 0,1 kb [6].

Parcial desnaturalización de la N5 vibriophage de ADN se llevó a cabo tal y como se describe anteriormente [4, 8] Un alto pH de amortiguamiento se preparó la que figura el 34% formaldehído, 10 mM Na 2 CO 3, 1 mM EDTA y adecuada cantidad de NaOH para compensar el pH A 10,9. Acerca de 7 μ l de ADN N5 suavemente se mezcla con 3 μ l de buffer de pH alto y se incubaron a 37 ± 1 ° C durante 15 minutos. La solución final fue mezclado con formamida y citocromo c a una concentración final de 50% y 0,01%, respectivamente. Desnaturalizado parcial vibriophage N5 moléculas de ADN fueron obtenidos (no se muestra en la figura). Las moléculas de ADN fueron dispuestos en forma lineal de acuerdo a sus sitios de desnaturalización y una parcial desnaturalización mapa fue construido (figura 3 bis]. Un peso promedio, de desnaturalización histograma (figura 3b], de estos mapas se trazan para visualizar el promedio patrón de la desnaturalización total N5 moléculas de ADN. Es tranquilo desprende de la histograma de que hay al menos 5 principales sitios de desnaturalización. Siempre hay una desnaturalización sitio en un extremo (por convención a la derecha, en la parte final, Inman, [11]] de la molécula de ADN, independientemente del grado de desnaturalización. La desnaturalización otros sitios de nuestro conflicto se encuentran en el 26%, 65%, 75% y 91% de la mano izquierda respectivamente, y un pico menor en la posición 55% (gráfico 3b]. El resultado muestra que el vibriophage N5 ADN tiene un no se permutan y única secuencia. Comparación con el mapa de desnaturalización N4 [6] revela que había N5 desnaturalización sitio en un extremo (extremo derecho), mientras que el ADN tiene una N4 desnaturalización sitios en ambos extremos. Sin embargo, el ADN ha vibriophage D10 desnaturalización picos en los mismos lugares que en N5 que fago. En este sentido desnaturalización N5 mapa de ADN es similar a la de D10 ADN [5].

Dado que el ADN es N5 permutada no se esperaba que el ADN podría tener fines coherente [12]. Con el fin de comprobar si el ADN ha cohesionado N5 termina 3 μ l N5 de ADN (500-800 μ g / ml) fue mezclado con 2 mM Tris, 0,2 mM EDTA buffer (pH 8.4), junto con 20 mM Tris, 2 mM EDTA buffer ( PH 8.4), 50 mM Na 2 CO 3 y el 50% de formamida [13].

La mezcla se dejó de incubación a temperatura ambiente durante 72 horas. Después de aproximadamente 48 horas 2 μ l de Tris-EDTA buffer (0,1 M Tris + 10 mM EDTA (pH 8,4)) se agregó (para mantener el pH de la mezcla) a la mezcla y la izquierda para otra incubación de 24 horas a temperatura ambiente. Después de la terminación de 72 horas de incubación de 3 μ l del citocromo c se añadió a una concentración final de 0,01% y fue extendido en agua bidestilada. Después de examinar alrededor de 10 moléculas de ADN, se constató que las moléculas tienen casi el doble de la longitud nativos longitud de la N5 ADN. La duración media de estos 20 moléculas es de 79 ± 0,8 kb mientras que es el doble de la longitud de las mencionadas anteriormente, es decir 40,7 ± 0,7 kb. Esto confirma que el ADN ha cohesionado N5 fines.

Endonucleasa de restricción de la digestión N5 vibriophage se llevó a cabo con la ayuda de la metodología recomendada por los fabricantes ( "Genie", la India). Las enzimas utilizadas fueron: Eco RI, Sal I, Bam H1, Bgl II, Pst I, Bgl I, Ass I, Sma habrían I, Hind III, Hpa II, Eco RV, Acc I, Hae III y Xba I. Endonucleasa de restricción de la digestión patrón N5 fagos ADN revelaron que el ADN es el doble N5 varados. El N5 fagos ADN fue resistente a Eco RI, Sal I, Bam H1, Bgl II, Pst I, Bgl I, Ass Iy Sma habrían I. Vale la pena mencionar aquí que el ADN de Vibrio El Tor escribiendo fagos' e5 'es también resistente a los primeros cinco endonucleasas de restricción se ha mencionado anteriormente [9]. No obstante, ambos e5 y N5 fagos han AND sitios de restricción Hpa II (figura 2b y [9]]. También se observó que Hind III da lugar a 6 kb, 2 kb, y 1,3 kb común de los fragmentos en N4 y N5 [6] pero N5 ADN tiene un nuevo fragmento de 21 kb, que no se da en el ADN N4.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr SK Bhattacharya, director del instituto, por su interés y el aliento en este estudio.