Virology Journal, 2005; 2: 37-37 (más artículos en esta revista)

Transmisión de humano virus de la hepatitis C en pacientes secundaria de las células a largo plazo para la cultura

BioMed Central
Dennis Revie (revie@clunet.edu) [1], Ravi S Braich (rbraich@alnylam.com) [2], David Bayles (daveb@cimm.net) [2], Nickolas Chelyapov (chelyapo@pollux.usc.edu ) [3], Rafat Khan (rafat@cimm.net) [2], Cheryl Geer (doctorgeer@hotmail.com) [4], Richard Reisman (rreisman@cmh.org) [5], Ann Kelley S (annzaki @ Aol.com) [6], John G Prichard (johnprichard@mail.co.ventura.ca.us) [7], Zaki S Salahuddin (zaki@cimm.net) [2]
[1] Departamento de Biología, Universidad Luterana de California, Thousand Oaks, California, EE.UU.
[2] California Institute of Molecular Medicine, Ventura, California, EE.UU.
[3] Instituto de Medicina Molecular y Tecnología, Huntington Hospital, Pasadena, California, EE.UU.
[4] Centro de la Mujer, Bienestar, Camarillo, California, EE.UU.
[5] Comunidad Memorial Hospital de Ventura, California, EE.UU.
[6] Ventura Especialistas en Hematología-Oncología, Oxnard, California, EE.UU.
[7] Ventura County Medical Center, Ventura, California, EE.UU.
[8] Universidad del Sur de California, Los Ángeles, California, EE.UU.

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Resumen

La infección humana por virus de la hepatitis C (VHC) es la principal causa de la hepatitis después de la transfusión y enfermedades crónicas del hígado en todo el mundo. Un fiable sistema de cultivo in vitro para el análisis y aislamiento de este virus no está disponible actualmente, y, en consecuencia, el VHC patogenia es poco conocida. Presentamos aquí el primer sistema robusto in vitro para el aislamiento y la propagación de VHC de la sangre de donantes infectados. Este sistema consiste en infectar a los macrófagos recién preparada con el VHC y, a continuación, la transmisión de los macrófagos-adaptado virus en recién inmortalizada de células B de la sangre del cordón fetal humano. El uso de este sistema, recientemente se han aislado VHC reproducirse in vitro en continuo culturas de más de 130 semanas. Estas cepas fueron también transmitidas por celda libre de los métodos en diferentes tipos de células, incluidas las células B, células T y células precursoras neuronales. Estas células infectadas secundariamente también producidos in vitro infecciosas transmisibles virus. La replicación del ARN del VHC fue validado por RT-PCR y análisis de hibridación in situ. Aunque la secuenciación de ácidos nucleicos del VHC aislar informó aquí indica que el aislado es, probablemente, de tipo 1a, otros tipos de VHC también se han aislado mediante este sistema. Western blot muestra la síntesis de las principales proteínas estructurales del VHC. Presentamos aquí, por primera vez, un método cada vez más productiva para el VHC in vitro por períodos prolongados de tiempo. Este método permite que los estudios relacionados con la comprensión del proceso de replicación, patogenia viral, y el desarrollo de anti-VHC medicamentos y vacunas.

Introducción

El impacto en la salud pública mundial de la infección crónica por el VHC y la consiguiente enfermedad hepática sigue creciendo en número. Se ha estimado que hay más de 170 millones de portadores del VHC en todo el mundo, con un aumento de la incidencia de nuevas infecciones [1]. En los Estados Unidos, se estima que el 1% y el 5% de los 2,7 millones de personas que actualmente están crónicamente infectadas muere debido a la infección por el VHC [2].

Aunque el VHC ha demostrado ser muy difícil de cultivar in vitro, el ARN del VHC se ha detectado en cultivos de células de una variedad de tipos de células, la presencia de la vertiente positiva de ARN-VHC persiste por períodos que van de unos días a varios meses, Aunque sin evidencia de infección por el virus de [3 - 6]. La reciente creación de ARN-VHC replicons ha contribuido a una mejor comprensión de algunos de los eventos moleculares, en particular la expresión de los genes [7 - 9]. Sin embargo, los estudios que utilizaron partes de un virus sólo puede dar información limitada sobre el proceso infeccioso y la patogénesis de un determinado genotipo. Para el desarrollo de terapias eficaces y racional de la producción de vacunas de protección, un sistema reproducible in vitro para el aislamiento de la replicación del VHC y de los pacientes es fundamental.

Presentamos aquí, y que el aislamiento a largo plazo de la replicación del VHC in vitro. Dado que se trata de la primera experiencia con el VHC activamente reproducir in vitro, algunos de los resultados que se muestran aquí puede que no se adecue a los conceptos actuales utilizando sistemas que no replicar virus infeccioso.

Materiales y Métodos
La infección de cultivos celulares con sueros de pacientes infectados por el VHC

Suero de pacientes infectados por el VHC (un mínimo de 10 4 equivalentes de genoma / ml) fue filtrada a través de filtros de 0,45 μ (Fisher Ciencia) y congelados en 1 ml alícuotas a -70 ° C. Un nuevo vial de suero congelado se utiliza para la transmisión de cada nuevo experimento. Las células fueron infectadas usando 500 μ l de suero de donantes descongelado [10, 11].

Generación de los macrófagos

Macrófagos humanos fueron generados a partir de células mononucleares de sangre de cordón (CBMCs) por tratamiento con Phorbol-12-myristate-13-acetato (PMA, 5 ng / ml en total medianas) [12]. La mayoría de las células que se adhirieron a la plástica fueron positivas para esterasa no específica, y la fagocitosis, que se estableció para todos los marcadores de macrófagos. Múltiples frascos (Falcon 3108 y 3109) se prepararon en todos los casos para ser utilizadas por separado, ya sea para la infección por el VHC en el suero o para coculture con el paciente infectado células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las células no adherentes figuran aproximadamente el 60% CD19 y CD20 positivo de células B, células T y monocitos de contabilidad para el resto. Las células que no se mancha de macrófagos o marcadores específicos de la fagocitosis se designaron como no comprometido células linfoides, y después infectados con el VHC, ya sea utilizando 500 μ l de suero o cocultured con PBMC de la misma paciente.

La infección con el VHC de los macrófagos

Los macrófagos fueron tratados con polybrene noche a la mañana (5 ng / ml) y, a continuación, ya sea infectadas con 500 μ l de sueros o cocultured con la PBMC de la misma paciente (Figura 1A]. Estos macrófagos infectados se incubaron durante la noche a 37 ° C en el 5% de la atmósfera de CO 2. Se cambiaron los medios de comunicación y las culturas se continuó por otros seis días, con el cambio de los medios de comunicación en el día cuatro.

Generación de inmortalizada de células B

Para crear inmortalizada de células B, células mononucleares de sangre de cordón (CBMC) fueron estimulados con pokeweed mitogen (PWM, 5 μ g / ml en medio de cultivo completo), y después infectados con la transformación de virus de Epstein-Barr (VEB). Estos inmortalizada de células B no produjo VEB [13, 14].

Preparación de los sobrenadantes de cultivo de células

Medios tomado de las culturas de los macrófagos infectados fueron centrifugadas a 500 × g durante 10 minutos. Los sobrenadantes fueron filtradas a través de un filtro de 0,45 μ para eliminar materiales extraños. El sobrenadante filtrado que se denomina el sobrenadante de cultivo de células.

Cell libre de la transmisión del VHC

El objetivo de las células fueron premeditados, con la noche a la mañana polybrene (5 ng / ml). A 500 μ l alícuota de sobrenadante de cultivo celular fue utilizado para infectar a cada una de las células objetivo.

- Diseño de positivos y negativos-capítulo primers

Con el fin de identificar el ARN del VHC, anidados primers para cada capítulo de la 5 'no traducidas región (UTR) fueron diseñados por el CIMM utilizando los parámetros por defecto de la DNASTAR PrimerSelect programa (Tabla 1].

La detección de positivos y negativos-strand-ARN-VHC por RT-PCR anidada ensayo

ARN total fue extraído a partir de sobrenadantes de cultivo de células infectadas cosechado 5 días después de un cambio de los medios de comunicación (Tri Reactivo LS, Molecular Research Center Inc Cincinnati, OH). Un par base 269 región se amplificó por RT-PCR anidada de la altamente conservadas 5'-UTR del genoma del VHC.

La vertiente positiva de ensayo se realizó con un 10 μ l alícuota de la ARN total fue extraído invertir transcritas utilizando la cartilla 9,2 VHC con la MMLV la transcriptasa reversa (Promega Corp Madison, WI) o con la Sensiscript la transcriptasa reversa (Qiagen Inc Valencia, CA ) De acuerdo con las las instrucciones de los fabricantes. A 5 μ l cDNA de la alícuota fue amplificado por PCR anidado utilizando VHC 9,1 y 9,2 como el VHC fuera de los cebos, seguida de la amplificación de 5 μ l de los primeros productos utilizando PCR VHC 10,1 y 10,2 VHC como el interior de los cebos.

El capítulo negativo ensayo se realizó usando el Oligotex Direct Kit de purificación de ARNm (Qiagen Inc) para extraer el ARN de las células. Un 10 μ l alícuota de la ARN transcrito fue invertir usando las HCV1 primer Thermoscript con la transcriptasa reversa (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Nested mediante amplificación por PCR se realizó en un 5 μ l alícuota de la cDNA utilizando HCV1 y HCV2 el exterior como los cebos, seguida de la amplificación de 5 μ l de la primera PCR utilizando el producto HCV3 y HCV4 como los primers anidados bajo condiciones estándar de PCR.

Para cada PCR, cuarenta ciclos de amplificación se realizó con los siguientes perfiles de temperatura: 94 ° C por 1 min, 55 ° C por 1 min y 72 ° C durante 1 min para el primer conjunto exterior y 94 ° C durante 1 min, 60 ° C por 1 min y 72 ° C durante 1 min para el interior del primer set.

La detección de positivos capítulo de ARN-VHC en tiempo real por RT-PCR

El ARN total fue extraído solubilizados en 10 μ l de RNasa libre de agua y luego transcritas invertir utilizando la cartilla con el VHC 10,2 transcriptasa reversa MMLV. A 5 μ l cDNA de la alícuota fue amplificado por PCR en tiempo real, utilizando el VHC 10,1 y 10,2 primers VHC sobre el Rotor-Gene 200 sistema de amplificación (Corbett Research, Australia) y el SYBR Green I tinte fluorescente (BioWhittaker Molecular de aplicaciones, Rockland , ME), utilizando el las instrucciones de los fabricantes. Un transcrita in vitro RNA a partir de la 5'-UTR del VHC se utilizó como estándar. Cuarenta ciclos de amplificación se realizaron con el siguiente perfil de temperatura: 94 ° C por 1 min, 55 ° C por 1 min y 72 ° C durante 1 min.

La detección del ARN del VHC por hibridación in situ

Aproximadamente 6 × 10 4 células fueron centrifugadas (Cytospin II, Shandon, Pittsburgh, PA) en RNasa libre de poli-L-lisina revestidos diapositivas (Fisher Científico, Pittsburgh, PA), formando así un modelo uniforme monocapa propagación de las células. Estas células fueron fijadas y desecadas con etanol. Las células fueron entonces rehidratada con 1 × amortiguación CDC y tratados de digestión de las proteínas con proteinasa K (Fisher) para la permeabilidad y la retención. Hibridación de las sondas a las células de la noche a la mañana se realizó a los 56 ° C. Después de la noche a la mañana la hibridación, para reducir al mínimo la cantidad de unhybridized sondas, las células fueron lavadas tres veces con formamida seguido de un lavabo con RNAse A, y, a continuación, un lavabo con RNAse sin buffer. Dependiendo del lote de reactivos, las muestras fueron recubiertas con emulsión líquida (Liquid Emulsión K5, Ilford Imaging, Reino Unido) y expuestos por 10-15 días. Después de la exposición, las diapositivas se desarrollaron con Kodak D19 desarrollador (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) y fijarán mediante el Ilford Hypam Fixer (Ilford Imaging, Reino Unido). Las diapositivas fueron desarrollados luego teñidas con Wright-Gimsa Stain (EM Sistemas de Diagnóstico, Gibbstown NJ), y montadas con permount. Las sondas utilizadas para hibridaciones in situ, fueron preparados por la clonación con fines de una secuencia de ADN correspondiente a la 5 'no traducidas región (5'-UTR), 55-308 nucleótidos, de ARN del VHC en pGEM-T Easy vector (Promega Corp Madison, WI). S 35-etiquetados sondas, complementaria a la positiva o negativa-capítulo de ARN-VHC, se han generado por la transcripción in vitro en presencia de un 35 S rUTP (Amersham Biosciences, Inglaterra), mediante el apropiado RNA polimerasas como suministradas por el fabricante (Promega Corp Madison, WI) y purificado a través de Sephadex G50 [11].

La detección del ARN del VHC mediante microscopía de fluorescencia

Un inmunofluorescencia indirecta (IF) de ensayo se utilizó [11]. Las células fueron lavadas por 10 minutos tres veces con solución salina amortiguadora de fosfato (PBS), resuspendido en PBS, depositado en diapositivas recubierto de teflón, secado al aire, y fijadas en acetona fría durante 10 minutos. De los pacientes de suero inactivado por calor (56 ° C durante 30 minutos y luego aclarar por centrifugación) se agregó a las células fijo, y se incuba a 37 ° C durante 40 minutos. Posteriormente fueron lavadas con PBS, secado al aire, y teñidos con FITC-conjugado IgG anti-humano durante 40 minutos. Las células fueron nuevamente lavadas, secadas al aire, contra el manchadas de Evans Blue durante 5 minutos y montadas con IF solución de montaje.

Cinética de la producción in vitro del VHC para determinar cuál sería el mejor día para la cosecha capítulo positivo-CIMM-ARN del VHC

En el día cero, un CIMM-VHC cultivo celular fue sacado de nitrógeno líquido, resuspendido, que se divide en siete frascos de aproximadamente 10 6 células cada uno, frescos y medios de comunicación se agregó a cada matraz. La concentración inicial del virus en los medios de comunicación, por lo tanto, comienza en cero partículas virales. Para cada uno de los próximos siete días, se cosechó un matraz y análisis en busca de los positivos y negativos-de los capítulos del ARN del VHC mediante RT-PCR anidada.

CIMM genotipo de VHC-ARN

ARN de sobrenadantes de cultivo de células se amplificó a través de RT-PCR anidado utilizando el capítulo positivo de RT-PCR primer ensayo conjunto, tal como se describe anteriormente. Productos de la RT-PCR fueron clonados en la PCR 4,1 clonación vector (Invitrogen Corp Carlsbad, CA). Plásmido de ADN fue aislado de los clones y secuenciado en un ABI 377 automatizados secuenciador de ADN utilizando un Kit de Secuenciación Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Purificación de inmunoglobulina (IgG) de los sueros de pacientes infectados por el VHC

Suero de los pacientes # 081, se aplicó a un Affi-Gel II Proteína Una columna (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), y la fracción IgG se eluyen. IgG purificada se concentraron Microcon por 50 columnas (Millipore Corp, Billerica, MA) y almacenados a -20 ° C.

La extracción de las proteínas virales de sobrenadantes de cultivo de células

Las proteínas totales se precipitó a partir del 1 ml de sobrenadante de cultivo de células o suero de pacientes con el reactivo TRI (Molecular Research Center, Inc Cincinnati, OH). El etanol lavado de pellets de proteína fue solubilizados en 200-500 μ l de SDS 1% por incubando a 55 ° C durante 10 minutos. Cualquier subcelulares partículas insolubles restantes fueron retirados por centrifugación a 14000 × g durante 10 minutos a 4 ° C. Las proteínas fueron cuantificados usando el ensayo de proteínas Bradford (Sigma-Aldrich Corp St Louis, MO) y congelados (-20 ° C).

Dot-blot y Western blot análisis

Para el ensayo de dot-blot, 2 μ l de diversas muestras de proteínas (sin diluir a 10 -3) se diluye a 25 μ l utilizando dot TBS y se borró en una membrana de nitrocelulosa (0,22 μ, Micron separaciones Inc Westboro, MA). Para el análisis occidental, proteínas fueron separadas por SDS-PAGE en virtud de la no reducción de las condiciones y transferidos a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad Labs). Las membranas fueron bloqueadas con 2% de leche en 20 mM TBS, 500 mM NaCl, 0,02% de Tween 20 durante 1 hora. Las muestras fueron incubadas con IgG purificada (1:1000 dilución) por 2-4 horas a temperatura ambiente. Unión de los anticuerpos fue detectado por incubación con fosfatasa alcalina-conjugado de cabra anti-anticuerpos humanos seguida por el desarrollo de color (Bio-Rad) [15].

Adhesión números de las secuencias utilizadas para el VHC genotipo

El 5 'UTR secuencia se obtuvo utilizando el 10,1 y el 10,2 primers (Tabla 1], y tiene el número de DQ010313. La secuencia parcial de la región NS5B se obtuvo utilizando la C-anti y a la inversa C1A complemento de los cebos, y tiene el número de DQ010314.

Resultados

Hace nueve años, nos comprometimos a aislar infecciosas VHC de los pacientes y de crecer esos aislamientos in vitro. Nuestros experimentos iniciales para desarrollar un sistema in vitro de la replicación del VHC se realizaron como se informó anteriormente por muchos investigadores usando una gran variedad de líneas celulares establecidas compuesto de diversos tipos de células [16]. Estas incluyen las células del hígado humano transformado además de Hela, CEM, H9, Jurkat, Molt 3, Molt 4, U937, P3HR1, Raji, Daudi, fibroblastos humanos prepucio (ATCC, Bethesda, MD). Todos estos tipos de células pueden ser infectados por los métodos, con la excepción de los fibroblastos humanos prepucio, que se uninfectable (Tabla 2]. Los resultados de estos esfuerzos no resulten ser reproducible para la replicación del VHC sostenido. Aunque hemos sido capaces de detectar positivos y negativos-capítulo (replicativa) para ARN del VHC en algunos de células B, células hepáticas, y monocytoid células, ninguna de estas líneas celulares estándar del VHC producido infecciosas que pueden transmitirse en las células no infectadas. Estos recién infectados más tarde se convirtieron en cultivos de células negativas para el ARN-VHC, mientras que las células no infectadas creció. Ahora ya sabemos por nuestra experiencia que el VHC se comporta como un virus lítico, con un máximo de 20% de muerte celular en cultivos celulares infectados. B-células infectadas forma ampliada las células que finalmente mueren sin más réplica (Fig. 2C]. Línea celular U937, a pesar de su naturaleza monocitos y la presencia de detectarse positivos y negativos-strand-ARN-VHC, tiene muy bajos niveles de expresión de ARN viral.

Porque nuestros experimentos iniciales no siempre mejora significativa en las conclusiones de informes anteriores, hemos utilizado un enfoque diferente para el VHC aislada. Hemos observado niveles más elevados de ARN-VHC en los macrófagos infectados en comparación con otras células infectadas. Esto es análogo a la infección de células similares con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) [17]. Por lo tanto, se inició el uso de la recién aislados macrófagos y otras células. Hemos probado una gran variedad de tipos de células de diferentes orígenes de la infecciosidad con el VHC: las células endoteliales del cordón umbilical fetal frescas, las células mononucleares de sangre de cordón fetal, CBMC, PBMC, y células de Kupffer y hepatocitos de las biopsias de hígado fresco. Estas células fueron obtenidas recién infectable y expresó-tanto los positivos y los negativos de los capítulos del ARN del VHC.

Además se diseñaron los experimentos que utilizan los macrófagos como el intermedio de acogida. Los resultados de los macrófagos culturas fueron muy alentadores. Varios investigadores han utilizado anteriormente las células B como un objetivo [4, 6]. Por lo tanto, hemos decidido combinar los macrófagos con las células B en un solo sistema. También puso de manifiesto que a fin de llevar la transmisión del virus durante un largo período de tiempo in vitro, de larga vida de células B se requieren. Hemos optado en favor de los recién inmortalizada de células B, ya que son libres de los diversos agentes adventicios como micoplasma y otros contaminación celular. Retransmisiones se lograron mediante el uso de la cultura sobrenadantes obtenidos a partir de los macrófagos y las células B-preparado en nuestros laboratorios.

La transmisión de las cepas de VHC

Con el fin de demostrar que nuestro sistema podría ser usada para cultivar el VHC durante largos períodos de tiempo, probamos cada aislar a intervalos regulares por RT-PCR y la retransmisión en células frescas (Tabla 3]. Debido al gran número de muestras que se probaron, el VHC y el aislamiento a largo plazo de replicación se llevaron a cabo en varias fases: a corto plazo culturas (VHC positivo para un máximo de 10 semanas), mediano plazo culturas (positivo para 10-23 semanas), o Prorrogó plazo culturas (positivo por más de 23 semanas). Los experimentos ya sea usando sueros de pacientes humanos o PBMC eran igualmente capaces de infectar a los macrófagos que se podrían utilizar en la celda libre de la transmisión del VHC. No hemos comparar los niveles de virus producidos por estos dos métodos. Un ejemplo de un largo plazo positivo cultivo celular es aislar # 081. Este aislar se obtuvo de manera similar numeradas suero de los donantes # 081. Aislar # 081 se ha mantenido en más de una cultura Ciento treinta semanas. Esto es designado como el índice de aislar: CIMM-VHC. Este aislar ha sido propagada en diferentes tipos de células, como las células B enriquecido, células T, y los no comprometidos células linfoides obtenidas de sangre fresca por las dos co-cultivo de células y libre de los métodos. A las transmisiones de serie recién transformado de células B se realizaron por celular libre de los métodos de análisis más (Figura 1B]. La primera transferencia de VHC de los macrófagos a células objetivo es designado como T1. Una transferencia de la cultura a la nueva T1 células objetivo es designado T2. Las transferencias de los aislados se han llevado a cabo hasta cuatro veces (T4), tales como aislar PCLBT4. Sobrenadantes de cultivo de células se cosecharon por lo menos cada mes y ensayados para el capítulo positivo-ARN-VHC por RT-PCR anidada análisis (Tabla 3]. Nested PCR se ha utilizado como un método de diagnóstico por muchos investigadores [18 - 20], y fue utilizado con el fin de eliminar los falsos positivos. Debido a la forma coherente y positiva nested PCR secuencial ensayos biológicos de transmisión a lo largo de muchos meses, el VHC aislada se consideró reproducir y virus infeccioso.

Nuestros resultados sugieren que no existe una diferencia significativa entre el uso de suero de los pacientes o PBMC como fuente de la agente infeccioso, pero no se han hecho intentos para cuantificar los niveles de virus infeccioso en la primaria de las muestras (suero o de las células). Dado que sólo una célula de producción de virus infecciosos puede ser suficiente para lograr la transmisión, ambos métodos pueden ser utilizados con éxito a la cultura del VHC.

Anfitrión gama de cepas de VHC

CIMM-VHC se mantiene en un tipo de células: recién transformado de células B. Con el fin de establecer la gama de huéspedes de este aislar, un gran número de tipos de células se realizarán las pruebas de VHC propagación como se describe anteriormente. Además de las células B y los macrófagos, los precursores neuronales también podrían estar infectados. Estas células neuronales son muy similares a los macrófagos, y que se convirtió en un importante productor de VHC infecciosas (Cuadro 4]. Neuronal células T crecer en gran adherente y no adherente agrupa y la M células son generalmente adherente y forma neuronal de células similares a los procesos. Ellos sobrevivieron a la infección por el VHC mejor que las células B en términos de viabilidad celular (Figs. 2A y 2B]. Cell-libre CIMM-VHC se transmitió a los dos tipos de células neuronales, T (telencephalon) y M (metencephalon), que posteriormente mostró la replicación de virus infecciosos transmisibles (experimento 244). Virus de estas células fue posteriormente transmitido a fresco y T M cultivos de células neuronales en el experimento de 248 y de 248 a 260 (Cuadro 4]. Estas retransmisiones son similares a las realizadas por las células B (Tabla 3]. Infecciones de las células neuronales se repitieron varias veces con resultados similares con respecto a la producción del VHC. Hemos transmitido desde este VHC experimentos de 260 a 273 y 273 a 277 (datos no presentados).

Prueba de la VHC sistema de aislamiento de los pacientes utilizando adicionales

Con el fin de aprovechar el sistema desarrollado en nuestros laboratorios, se obtuvieron 156 muestras de pacientes que se ofrecieron como voluntarios para donar su sangre. De estos, 151 fueron muestras de sangre periférica de pacientes infectados por el VHC y 5 eran de los controles no infectados. Todos los especímenes fueron adquiridos con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (IRB) y de los donantes consentimiento informado. Los infectados por el VHC se obtuvieron muestras de 109 caucásicos, 37 hispanos y 5 de los afroamericanos. Los controles no infectados fueron a partir del 2 de los caucásicos, el 2 de los hispanos, y 1 de África y de América. Los participantes incluyeron 108 varones y 48 mujeres. Todas las muestras fueron procesadas recién dentro de una hora de la sangre dibujo. Repita las muestras fueron obtenidas de 77 pacientes del original con el fin de confirmar nuestros resultados iniciales. Treinta y tres de estos 151 pacientes infectados por el VHC fueron co-infectados con VIH-1, y el resto de los donantes tenían neoplasias hematológicas o de otros tipos de cáncer. VHC fue aislado con 75% de eficiencia de estas 151 especímenes. En el caso de los pacientes co-infectados, el hecho de no aislar el VHC es comúnmente debido a la rápida muerte de la célula. No fue el VHC cada vez aislado de los 5 controles no infectados. Esta alta tasa de aislamiento del VHC demuestra que este sistema es útil en la obtención de VHC de una variedad de pacientes individuales para un mayor análisis.

Determinación de los días óptimos para la cosecha de extracción de ARN de VHC

Con el fin de determinar cuál sería el mejor día para la cosecha de la más alta acumulación capítulo positivo-RNA, la cinética de la producción de VHC se midió usando PCR anidada. Para cada uno de los próximos siete días, frascos fueron cosechadas y análisis en busca de los positivos y negativos-de los capítulos del ARN del VHC mediante PCR anidada. Un ejemplo de nuestros resultados se muestra en la Fig. 3A. Mientras que el día 5 que mostró la mayor acumulación de positivo-capítulo de ARN-VHC, los niveles de la negativa de capítulo dentro de las células de los siete días se mantuvo sin cambios (Fig 3A]. No hubo aumento significativo en el número de células durante el experimento.

En un experimento realizado simultáneamente, la vertiente positiva de ARN-VHC en los sobrenadantes de cultivo de células se analizó cuantitativamente por tiempo real de RT-PCR. Como era de esperar, en el día cero no existe mensurables ARN-VHC. En el primer día, el número de copias mensurables de ARN-VHC fue 3200, que aumentó durante el experimento a aproximadamente 27000 copias por ml en el día 5 y luego disminuyó de respecto (Fig. 3B]. Este dato es coherente con el patrón obtenido mediante la RT-PCR anidada ensayo muestra en la Fig. 3A. Tenga en cuenta que los datos de las figuras 3A y 3B se utilicen las mismas muestras. El día de la cosecha óptima este aislar de VHC fue en el día 5. Otros han producido aislamientos de las curvas de crecimiento similares (datos no presentados).

Siete cepas fueron probadas por RT-PCR anidada para demostrar que los resultados de la Figura 3A se reproducible. La presencia de los esperados productos de PCR demostró que en el día 5, positivos y negativos-de líneas de ARN-VHC estuvieron presentes en nuestro sistema (Figura 3C]. Este experimento demuestra tanto la replicación y la producción extracelular del virus. Esto indica que la cosecha de ARN en el día 5 permitirá resultados reproducibles.

La detección del ARN del VHC por hibridación in situ

Analizamos nuestras células infectadas por el VHC realizar hibridaciones in situ para visualizar el porcentaje de las células infectadas y la localización de las líneas específicas de VHC [21]. Las células no infectadas utilizado como control de hibridación no sea negativo o positivo capítulo sondas (Figs. 4C y 4D]. En todos los casos, el número de granos de luz de fondo. Hibridación con la sonda de la vertiente positiva-producido un halo alrededor de apariencia similar a la periferia de las células infectadas (Fig. 4E]. Una fuerte señal de la negativa capítulos de ARN-VHC fue visto confinadas dentro de las células, tal vez en el citoplasma (Figs. 4A y 4B]. Microscopía de fluorescencia de los cultivos celulares infectados mostró un resultado similar (Fig. 4F]. Aunque aproximadamente el 5% de las células parece muy positivo, esta puede haber sido inferior a la real debido a: (1) la lisis celular de las células infectadas en la cultura, y (2) la pérdida de las células que se adhieren al filtro tarjetas utilizadas en la preparación de la cytospin Diapositivas. A la hibridación tanto positivos y negativos-de líneas de ARN-VHC sugiere la replicación del VHC y de la producción. Dado que la mayoría de las células no parecen positivos, la positivitity se observó que no es sólo un resultado de la falta de tinción específicos de las células. Resultados de las hibridaciones in situ son coherentes con la RT-PCR anidada ensayo se ha descrito anteriormente. La mayoría de las células infectadas parecen ser grandes, pero hay un número significativo de células más pequeñas que también dio positivo por encima de las señales de fondo. En comparación, ni la ampliación de las células ni los pequeños en el control de la población mostraron ninguna señal positiva (Fig. 4C y 4D]. Creemos que los pequeños, las células infectadas producen virus y probablemente ampliar progresivamente y mueren, como colorante azul de tripan exclusión pruebas mostraron que estas células finalmente falleció. Fenómenos similares se observan en los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el HHV-6 cultivos de células infectadas [22].

Genotipificación de la CIMM-VHC aislar

Sobre la base de análisis de secuencias, el VHC se ha clasificado en seis genotipos principales y una serie de subtipos [23]. El altamente conservadas 5 'sin traducir región (5'-UTR), habitualmente utilizado RT-PCR para la detección del ARN del VHC, exposiciones considerable heterogeneidad genética [24] y muestra polimorfismo entre tipos y subtipos. Esta heterogeneidad genética de la 5'-UTR se ha utilizado para la determinación del genotipo del VHC [19, 25 - 29], por lo tanto, la 5'-UTR de CIMM-VHC fue clonado y secuenciado. Sobre la base de búsquedas de homología de secuencia, CIMM-VHC fue similar al genotipo 1a.

Con el fin de comprobar in situ el genoma de CIMM-VHC, hemos probado la mayoría de los publicados anteriormente primers [30 - 33]. Nosotros, sin embargo, encontró que muchas de estas primers no dio lugar a la RT-PCR los productos de nuestra aislar, incluyendo CD 2,10 [31], CD 5,10 [31], CD 5,20 [31], A5310 [33], y A6306 [33 ]. Esto puede ser debido a la heterogeneidad de ARN del VHC [18]. También es posible que partes de nuestro aislar pueden diferir significativamente de los de informes anteriores secuencias. Hemos incluido aquí la secuencia de la parte de los genes de NS5B CIMM-VHC, que se encuentra cerca del extremo 3 'del genoma. Esta secuencia es similar a la mayoría de VHC de genotipo 1a/2a.

Aunque el sistema descrito aquí la cultura es capaz de aislar el VHC de aproximadamente el 75% de los pacientes infectados, este proceso puede seleccionar más competentes y virus infeccioso. Nuestro análisis de las secuencias de los 5 'UTR región muestra, en un caso, que la sangre de un paciente y en el aislamiento de la cultura son a la vez de tipo 1b. No se encontraron diferencias significativas en las secuencias de la paciente y el aislado de esta región (Revie, Alberti, y Salahuddin, manuscrito en preparación).

Reactividad de la IgG policlonal purificado de los sueros de pacientes infectados

Para determinar la reactividad de la IgG policlonal purificado, diferentes diluciones de la proteína total de los preparativos de sobrenadantes de cultivo de células se analizaron. Una reacción positiva se observó con el uso de proteínas de suero homólogo CIMM-VHC obtenido de las células B sobrenadante, sobrenadantes de las células neuronales (de la prueba de transmisión de 260), y disponible en el comercio VHC básico antígeno (ViroGen Corp Watertown, MA) (Fig. 5A ). No hubo reacción con NS4, así como los sobrenadantes de cultivo de células no infectadas. Estos resultados muestran que la IgG purificada del suero del paciente específicamente detecta virus VHC proteínas, en particular Core antígeno, y que el virus crecido en la cultura reacciona con los anticuerpos del suero del paciente.

Seis diferentes aislamientos independientes VHC (081T1, 112T1, 238T1, 313T1, 314T2, y PCLBT4) se pusieron a prueba contra anticuerpos policlonales de 238 pacientes utilizando un dot blot (Figura 5B]. Esto se realizó con el fin de determinar si estas cepas reaccionaron de manera similar a la anterior experimento muestra en la Figura 5A. La paciente reaccionó con todos los anticuerpos de estas cepas, así como a la comercial y Core antígeno NS4. El importe de puro NS4 utilizado aquí fue de 2 μ g Esto demuestra que todos estos aislamientos del VHC están produciendo proteínas VHC, y que incluso en un cuarto de transferencia (T4), de un aislamiento en recién transformado de células B produce todavía reactiva VHC proteínas (PCLBT4). Cada una de estas cepas se ha pasajes en la cultura muchas veces.

El análisis de las proteínas del VHC

El VHC genoma codifica una poliproteínas, que luego se transforma en una serie de madurez estructural y no fracciones [34]. Con el fin de determinar si la reproducción de CIMM-VHC se producen grandes VHC proteínas, Western blot utilizando análisis de la reducción de las condiciones no se han realizado. La IgG policlonal detectado una serie de proteínas (i) en el suero de pacientes VHC positivos y (ii) en el sobrenadante de cultivo de células infectadas (Figs. 6A y 6B]. Las proteínas de 140, 75, 50, 37, 32, 27 y 25 kDa fueron detectados en estas muestras. La IgG policlonal dio también una reacción positiva con las obtenidas comercialmente básico antígeno recombinante (carril 5, Fig 6A]. Este núcleo ha antígeno β-galactosidasa fusionados en el N-terminal y es por lo tanto, aproximadamente 140 kDa en tamaño, según informa el fabricante.

Existen dos proteínas altamente glicosilada dotación, E1 (32 y 35 kDa) y E2 (70 kDa) [35 - 39]. Una banda de aproximadamente ~ 140 kDa se observó en todas las cepas de VHC (Fig. 6A]. Esta banda ha sido visto por otros investigadores [40, 41], y pueden haber resultado de la multimerization del núcleo, E1 y E2, o homodimerization de E2. Las proteínas E1 y E2 se sabe que no forma covalentemente heterodimers vinculados en virtud de la no reducción de las condiciones [36, 40, 42]. El Core E1 y proteínas también se unen a los demás [43, 44], y. Posiblemente VHC forma de proteínas y complejos de proteínas celulares de acogida también.

Las proteínas en el 32 y 37 kDa también se detectó en el Western blots (Fig. 6B]. Estas bandas están en consonancia con el tamaño conocido de E1. Una proteína de aproximadamente 75 kDa También se detectó en todas las muestras infectadas de las que se analizaron (Fig. 6A]. Esta proteína se corresponde con el peso molecular conocido de E2.

En todas las cepas de VHC que se pusieron a prueba, una importante proteína de la banda de aproximadamente 50 kDa fue visto (Fig. 6B]. Esto es tal vez debido a la incompleta tramitación de la poliproteínas precursoras [45]. Desde que la banda se presente sólo cuando la proteína purificada a partir de sobrenadantes de cultivo de células infectadas se utilizaron para los análisis, la banda es, por lo tanto, las proteínas relacionadas con el VHC.

Bandas de aproximadamente 25 y 27 kDa también fueron detectados en el Western blots (Fig. 6B]. La célula huésped cleave peptidasas señal de la región N-terminal del polipéptido precursor para producir la proteína básica VHC [37, 46, 47]. El núcleo de proteínas del VHC se extiende entre los 16 y 25 kDa de tamaño. Sin embargo, es posible que el tamaño de las diferencias que se han informado anteriormente puede ser debido a diferencias en el procesamiento de la proteína básica VHC [37, 45, 48, 49]. Creemos que el antígeno Core, expresada por nuestros aislamientos de VHC, puede ser más grande que se ha descrito anteriormente.

CIMM-VHC crecido en tres diferentes líneas de células producido el mismo patrón de bandas. A pesar de que estaban utilizando IgG policlonal extraídos de los sueros de pacientes, que hemos detectado las proteínas del VHC que han sido reportados por otros investigadores.

Discusión

Nuestro sistema comprende el cultivo de células recién preparada inmortalizado macrófagos y las células B para el aislamiento de VHC. Los aislamientos se realizan utilizando los dos co-cultivos de células y libre de los métodos. Recién preparada macrófagos en nuestro sistema son esenciales como un huésped intermedio para el VHC aislada. No hemos explorado el mecanismo de infección o de la replicación del VHC, pero los macrófagos de una variedad de fuentes parecen tener un papel positivo en este proceso. Es posible que los macrófagos o bien concentrar las partículas del VHC o modificar el VHC suficiente a fin de que puedan infectar a otros tipos de células. Por ejemplo, los cambios en la dotación glicosilada proteínas E1 y E2 [36, 38, 39] podría afectar a la capacidad infecciosa del virus de la progenie, así como definir su gama de huéspedes. En las bacterias, los fagos que infectan pueden tener su ADN modificado por la modificación del sistema de acogida. Esto permite que los fagos para escapar a la restricción del sistema, lo que permite una mejor infección de los nuevos anfitriones. Por tanto, no es demasiado difícil imaginar que varios tipos de células animales pueden producir versiones modificadas de infectar a los virus. Estos virus pueden infectar preferentemente diferentes tipos de células. También es posible que los macrófagos reducir o eliminar el VHC defectuosos que se encuentran en la sangre del paciente que pueden interferir con iniciar un productivo sistema de la cultura. Los macrófagos, pues actúa como un guardián, sólo permite intacta VHC a ser cultivados y desestime los defectos que pueda interferir con el cultivo.

Como se dijo antes, descubrimos que las células precursoras neuronales pueden ser infectados por el VHC-CIMM y, a su vez, son importantes productores de virus infeccioso. En repetidas ocasiones hemos transmitido varias cepas de VHC en estas células neuronales. Estas células son similares a otros macrófagos, tanto en la tinción de las características funcionales y de ensayos. Ellos son dependientes del factor de crecimiento y así crecer in vitro, y en la cultura han sido durante más de dos años. Macrófagos de otras fuentes, por ejemplo, las células de Kupffer del hígado, obtener infectados, pero después de unas semanas poco a poco pierden el virus de la producción. ARN-VHC, sin embargo, puede detectarse durante varias semanas. Esta pérdida de la producción de virus pueden estar relacionados con la maduración, cytostasis, y la eventual muerte de las células de Kupffer. Similares experimentos se realizaron con una recién cultivados obtenidos a partir de células endoteliales humanas de cordón umbilical, ya que estos están relacionados con hepatocitos del hígado, que también son células endoteliales. Los resultados de estas células también mostraron un patrón de producción similar a la del virus de la células de Kupffer.

En casi todos los virus humanos, es así-observó fenómeno de la asincronía de expresión, con algunas notables excepciones como la del VIH. Por Herpes virus humano, no importa que la célula hospedadora que utilizan, sólo una minoría de células de la reproducción de los virus de producir [50, 51]. No sabemos por qué menos del 5% de las células en nuestro sistema productivo. Virus de la inmunodeficiencia humana, como el VIH-1 muestra la replicación activa en menos de 20% de las células T infectadas si recién aisladas leucocitos se utilizan [52]. El sistema que hemos descrito utiliza todas las células recién aisladas. Es muy probable que un determinado receptor puede ser el factor limitante en la determinación del número de células infectable.

Se determinó que la cantidad de ARN-VHC en el sobrenadante de cultivo de células se eleva hasta el día 5, entonces disminuye gradualmente. Por lo tanto, el quinto día después de subcultivando es óptimo para la recolección de ARN-VHC. Como se muestra en la Figura 3C, la recolección de ARN en el día 5 reproducible permite la detección del ARN del VHC. Los cambios en los niveles generales de ARN-VHC puede reflejar la suma de la producción de ARN y ARN destrucción de la cultura. Esta periodicidad observada en el capítulo positivo, por lo tanto, puede ser debido a: (1) la desaceleración del proceso de replicación de las células infectadas o de un inhibidor de la producción in situ, o (2) la lisis de las células infectadas que causan la destrucción del virus y Su RNA, por ejemplo, puestos en libertad por las proteasas y ribonucleasas, o (3) ambas de las posibilidades anteriormente mencionadas. El nivel medido de la negativa en el capítulo de las células se mantuvo estable. Dado que el número de células y el porcentaje de células que están infectadas no cambian durante el cultivo del virus, observó la estabilidad de la negativa de capítulo dentro de las células es comprensible.

Aunque la mayoría de las muestras de los pacientes descritos anteriormente son de tipo 1b, nuestro análisis de CIMM-VHC es mostrar secuencias de tipo 1a. En la región 5'UTR hay muy poca diferencia entre los tipos de secuencias 1a y 1b. Cambiar de una base puede provocar la secuencia se asemejan más a tipo 1b. Es posible que sólo un pequeño subconjunto de VHC en un paciente es, en realidad, infecciosas, y, por lo tanto, nuestro sistema mejor escrito como tipo 1 bis. Una secuencia completa del genoma del VHC CIMM-revelará su identidad. Es posible que una infección crónica en los pacientes pueden desarrollar mutantes que se parecen a otro tipo. Sin embargo, tenemos más aislados que son compatibles con otros genotipos como 1b (datos no presentados). Las secuencias que hemos informado aquí indican que ambos extremos del genoma viral están presentes en nuestras culturas. En la actualidad estamos en el proceso de secuenciación de todo el genoma CIMM-VHC con el fin de determinar mejor su genotipo, así como para comparar a la actualiza VHC genomas.

Dado que este es el primer sistema in vitro para el cultivo del VHC, hemos sido capaces de hacer observaciones iniciales acerca de la replicación del virus. Otros estudios relacionados con la replicación del VHC y la patogénesis están en curso. La hibridación in situ resultados verse en la figura 4 sugieren que el capítulo positivo de VHC se sintetiza en o emigra a la membrana plasmática, y que la vertiente sigue siendo negativo en el citoplasma. Esta observación sólo puede hacerse en un sistema dinámico activamente con la reproducción de virus. Esta propuesta es apoyada por los recientes informes de que el RNA-dependiente del RNA polimerasa contiene una serie de sesiones de transmembrana que está anclada en la membrana [53]. Proteínas no estructurales y la vertiente positiva de ARN también se han encontrado asociados con las membranas plasmáticas [54]. Estos resultados sugieren que el sitio donde está totalmente montado el VHC es probablemente en o cerca de la membrana plasmática de las células infectadas. Probablemente VHC-ARN se sintetiza en el citoplasma y emigra a la membrana plasmática para el montaje final. El virus se completó luego liberados en el espacio extracelular.

Creemos que un paciente con infección crónica hace que los anticuerpos de su propio virus. Por lo tanto, la IgG policlonal es específica para ese virus. Esta es la confirmación de nuestro dot blot de diferentes cepas de VHC. Desde estas cepas ha sufrido tantos como cuatro transferencias en las células frescas y muchos pasajes de serie, el sistema que describimos aquí mantiene estable aislados en la cultura, la producción de proteínas específicas-VHC.

Del mismo modo, los datos de Western blot de las proteínas del VHC en los sobrenadantes de cultivo de células muestran que la espera de todos los principales proteínas estructurales están presentes. No encuadernaciones de anticuerpos específicos se observaron en las muestras de sobrenadantes de cultivo de células no infectadas. En conjunto, estos resultados sugieren que es la producción de proteínas específicas del VHC en CIMM-cultivos de células infectadas por el VHC. Estos datos muestran que el virus que se cultivan en la cultura contiene epitopos de todos los principales problemas estructurales de las proteínas que reaccionan con anticuerpos purificados de la paciente. Esta es una fuerte evidencia de que el virus crecido en la cultura no es significativamente diferente de la creciente VHC en el paciente. Además, una cepa que se cultivaron en diferentes líneas de células mostró un cuadro de las bandas de Western blots. Esto es adicional y pruebas sólidas de que el resultado de las bandas de proteínas del VHC. Hemos llegado a la conclusión de que la replicación del VHC es un virus estable.

Además de los análisis moleculares que se establece que nuestras células están produciendo viriones VHC, la serie de transmisión del VHC a través de las células frescas de células no infectadas cultura libre de sobrenadantes establece pruebas biológicas de virus infeccioso (Figura 1B: PCLBT1-PCLBT4). Dado que este virus es contagioso y todos in vitro de las principales proteínas parecen estar presentes, el virus que se ha crecido en la cultura más probable es que contiene el genoma en su totalidad. No creemos que hay una gran cantidad de VHC defectuoso presente en nuestro sistema. Aunque nuestro nivel de ensayo es amplificar el 5 'UTR región, hemos sido capaces de obtener secuencias de otras regiones del genoma. Esto, junto con las pruebas de la presencia de las principales proteínas estructurales del VHC, es fuerte evidencia de que el genoma en su totalidad está presente. Además, hemos sido capaces de utilizar el primer HutLA2 (Cuadro 1], que es complementaria a una región cerca del extremo 3 'del capítulo positivo, de producir cDNA. Usando nuestro nivel de los primers 5 'UTR región a amplificar el cDNA, hemos sido capaces de detectar el VHC ARN positivo-capítulo (datos no presentados). Esto indica que una proporción significativa de la presente ARN contiene el 3 'y 5' extremos del genoma. Además, el trabajo en curso sugiere que un representante de virus que aumenta la población en este sistema, lo que sugiere que un determinado genotipo no está seleccionado (Revie, Alberti, y Salahuddin, manuscrito en preparación).

Nuestro sistema nos ha permitido aislar el VHC y reproducen de una mayoría de los pacientes y en algunos casos estos cultivos celulares se han ejecutado a más de 130 semanas. Nuestra capacidad para detectar el VHC para estos períodos prolongados muestra de que estamos no sólo la detección de virus que se ha diluido de la muestra inicial. Para la infección inicial, de 50 μ l de suero se añadió a 2 ml de los medios de comunicación y, a continuación, los medios de comunicación se cambió una vez a la semana durante meses. Una estimación conservadora de la dilución del virus a 130 semanas sería más de 10.130 veces. La cantidad de VHC producido a partir de este sistema es suficiente para realizar biológicos, moleculares, inmunológicos y de las investigaciones. Nos sigue llevando a cabo otras investigaciones en este campo.

La analogía entre los macrófagos-inició la propagación in vitro del VIH y el VHC es bastante notable. Las células dendríticas específicos de ICAM-acaparamiento no integrinas (DC-SIGN) puede obligar VIH, y protegerla durante períodos prolongados de concentración y de entregar los viriones a causa de la infección de células T en trans con alta eficiencia [55, 56]. La base estructural para el reconocimiento selectivo de oligosacáridos en virión dotación proteínas por DC-SIGN y DC-SIGR efecto, puede ser un patrón común por la que el VIH y el VHC se concentran in vitro para la transmisión a sus respectivas células sensibles [57, 58]. A diferencia de CD4 para el VIH, el VHC del receptor CD81 en la actualidad un tema de graves discusiones [58 - 61].

Nos gustaría señalar que nuestro sistema nos permite producir cantidades significativas de VHC, que hizo posible estos estudios. Tener un fiable y de crecimiento a largo plazo del sistema para el VHC en cultivos celulares facilitará los estudios in vitro y también ayuda en la producción racional de los medicamentos y las vacunas. Este sistema de la cultura, por lo tanto, permiten a los investigadores en el campo del VHC y la enfermedad hepática para realizar una amplia variedad de nuevos análisis, que puede ayudar en la comprensión del ciclo de vida de VHC y de los mecanismos de la patología inducida en humanos anfitriones.

Declaración de intereses

Todos los derechos de propiedad intelectual están reservados por el California Institute of Molecular Medicine (CIMM), y en todos los aspectos de este trabajo fueron realizadas por el CIMM. No hay intereses contrapuestos entre la Universidad Luterana de California o en cualquier otro organismo y CIMM.

Contribuciones de los autores

SZS y RK realiza la labor biológica y los aislamientos, transmisiones y retransmisiones de VHC. JGP, ASK, CG y RR realizado el trabajo clínico, el reclutamiento de los pacientes, y la adquisición de los especímenes. DR, RSB, PP, NC y molecular realizado el trabajo.

Agradecimientos

El Instituto de California de Medicina Molecular gustaría dar las gracias a los Dres. Richard Green y Terry L. Cole Memorial Hospital de la Comunidad, Ventura, CA, Drs. Rosemary McIntyre Parsa y de los especialistas de Hematología y Oncología de Oxnard, Ventura, CA, Drs. Kip Lyche y Ronald Chochinov de Ventura County Medical Center, Ventura, CA, Binom Galloway, Phlebotomist, Inmunología Clínica, Ventura County Medical Center, Ventura, CA, el personal de enfermería del Trabajo y de entrega en el Memorial Hospital de la Comunidad, Ventura, CA y Hematología & Especialistas en Oncología, Ventura, CA por sus constantes esfuerzos en el apoyo y promoción de la investigación VHC. Los autores también S. Ramakrishnan las gracias por sus esfuerzos y el doctor Joan Vinos de la Universidad Luterana de California para obtener ayuda en la preparación de este manuscrito. Autores muy agradecidos por el don de transformar el virus de Epstein-Barr (B-95 / 8) de la fallecida doctora Meihan Nonoyama de Showa-Centro de Investigación Internacional de Teikyo, Florida, y el tipo de donación de células precursoras neuronales para nuestra investigación por el Dr Olag Kopyov Del Instituto de Neurociencias de California, San Juan Regional Medical Center, Oxnard, CA. Los autores también son muy agradecidos al Dr Len Adelman de la Universidad del Sur de California para que nos permita utilizar el Roto-2000 sistema de amplificación de genes. Parte de este estudio fue apoyado por NSF # 0116789 conceder al Dr Dennis Revie.