Virology Journal, 2005; 2: 41-41 (más artículos en esta revista)

Comparación de la amplificación de las enzimas para el virus de la hepatitis C quasiespecies análisis

BioMed Central
Stephen J Polyak (polyak@u.washington.edu) [1], Daniel G Sullivan (dsully@u.washington.edu) [1], A Michael Austin (usmarine@u.washington.edu) [1], James Y Dai (yud@u.washington.edu) [4], Margaret C Shuhart (mshuhart@u.washington.edu) [5], Karen L Lindsay (klindsay@usc.edu) [7], Herbert L Bonkovsky (bonkovsky @ Uchc.edu) [8], Adrian Di Bisceglie M (dibiscam@slu.edu) [9], William H Lee (William.Lee @ UTSouthwestern.edu) [10], Chihiro Morishima (chihiro@u.washington.edu) [1], David R Gretch (gretch@u.washington.edu) [1], (polyak@u.washington.edu)
[1] División de Virología, Departamento de Laboratorio de Medicina de la Universidad de Washington, Seattle, WA, EE.UU.
[2] Departamento de Microbiología de la Universidad de Washington, Seattle, WA, EE.UU.
[3] Departamento de Pathobiology, de la Universidad de Washington, Seattle, WA, EE.UU.
[4] Departamento de Bioestadística de la Universidad de Washington, Seattle, WA, EE.UU.
[5] Departamento de Medicina de la Universidad de Washington, Seattle, WA, EE.UU.
[6] Departamento de Pediatría, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE.UU.
[7] de la División de Enfermedades gastrointestinales y hepáticas, de la Universidad del Sur de California, Los Angeles, CA, EE.UU.
[8]-biliar del hígado-páncreas Center y el Centro de Investigación Clínica General de la Universidad de Connecticut Health Center, Farmington, CT, EE.UU.
[9] de la División de Gastroenterología y Hepatología, Saint Louis University School of Medicine, St Louis, MO, EE.UU.
[10] División de Enfermedades Digestivas y de Hígado de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Virus de la hepatitis C (VHC) circula como quasiespecies (QS), cuya evolución está asociada a la patogénesis. Estudios previos han sugerido que el uso de polimerasas termoestables sin función de corrección de pruebas puede contribuir a la evaluación inexacta de VHC QS. En este informe, comparamos no corrección de pruebas (Taq) con corrección de pruebas (Ventaja Alta Fidelidad-2; HF-2) polimerasas en la sensibilidad, robustez, y el VHC QS diversidad y complejidad en la segunda dotación de genes hipervariables región glucoproteína 1 (E2 - HVR1) en la base de referencia muestras de 20 pacientes en el ensayo HALT-C, y en una pequeña cohorte de 12 de VHC / VIH los pacientes co-infectados. QS diversidad y la complejidad se cuantificarán mediante ensayos de movilidad heterodúplex (HMA).

Resultados

La sensibilidad de ambas enzimas fueron comparables a 50 UI / ml, aunque HF-2 era más robusto y un poco más sensible que la Taq. Ambas enzimas generadas QS diversidad y la complejidad que los resultados se correlacionaron (r = 0,68, p <0,0001 y r = 0,47, p <0,01; rango de correlación de Spearman). QS diversidad fue similar para ambos Taq y HF-2 enzimas, aunque hubo una tendencia a mayor diversidad en las muestras amplificadas por Taq (p = 0,126). Taq amplificado dado muestras de la complejidad que las puntuaciones fueron significativamente más altos que las muestras HF-2 (p = 0,033). HALT-C que fueron pacientes VHC positivos o negativos tras 20 semanas de IFN pegilado más ribavirina tuvieron resultados similares QS diversidad de Taq y HF-2 muestras, y hubo una tendencia de aumento de la complejidad de las puntuaciones de Taq, en comparación con las muestras HF-2 . Entre los pacientes con VHC y VIH-SIDA, el aumento de la TARGA VHC QS diversidad y complejidad, en comparación con los pacientes que no recibieron terapia, lo que sugiere que la reconstitución inmune unidades VHC QS evolución. Sin embargo, la diversidad y la complejidad resultados fueron similares para ambos HF-2 y Taq amplificado especímenes.

Conclusión

Los datos sugieren que, si bien puede sobreestimar Taq VHC QS complejidad, su uso no afecta significativamente los resultados basados en cohortes de los estudios analizados por el VHC QS HMA. Sin embargo, el uso de las enzimas como la corrección de pruebas HF-2 se recomienda para la caracterización más precisa de VHC QS in vivo.

Antecedentes

VHC existe como quasiespecies (QS) en individuos infectados, que consiste en una variante viral predominante y afines, pero genéticamente distintas variantes menores [1]. El estudio de VHC QS históricamente ha centrado en la región hipervariables 1 (HVR1) de la segunda dotación (E2) glicoproteína de genes [2, 3], la más variable de la región del genoma del VHC. Los primeros estudios revelaron que HVR1-E2 es un blanco de los anticuerpos neutralizantes [4 - 10]. Inmune presión se piensa que es el principal responsable de la fijación de las mutaciones en esta región del gen E2.

QS VHC han sido analizados en diferentes cohortes de pacientes. HVR1 QS evolución puede reflejar la progresión de la enfermedad hepática [11 - 15]. VHC QS también reflejan el resultado de la infección por el VHC aguda [16], y las respuestas a la terapia antiviral [17]. Estudios más recientes han investigado el efecto de HCV / HIV co-infección por el VHC en QS dinámica [18, 19]. En el presente estudio, se analizaron 20 muestras de la línea de base HALT-C juicio y el 12 de VHC-VIH co-infectados muestras de paciente. El HALT-C es un estudio multicéntrico y aleatorizado ensayo clínico para evaluar los efectos a largo plazo de interferón pegilado-α (peg-IFN) en el tratamiento de la progresión de la fibrosis hepática descompensada y el desarrollo de la enfermedad hepática en pacientes con hepatitis C que no son Respondedores a la previa IFN pegilado más ribavirina el tratamiento [20, 21].

Viral QS han sido analizados por muchas técnicas. La clonación y secuenciación es el estándar de oro. Basada en la movilidad electroforética ensayos, como los análisis de polimorfismo de conformación capítulo (SSCP) y análisis de la movilidad de heterodúplex (HMA) permitir la determinación del VHC QS heterogeneidad sin necesidad de secuenciación (revisado en [22]]. HMA fue originalmente descrita para el análisis de la secuencia de la heterogeneidad de la dotación de genes de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) [23, 24]. HMA implica la hibridación de una sonda radiactivos generados desde una variante QS ni a la reacción de PCR heterogéneo de los productos derivados directa mediante amplificación por PCR de muestras clínicas, o para homogénea HVR1 derivados de las secuencias clonadas QS variantes (clonal análisis de frecuencias, CFA; [25]]. Hibridaciones entre la sonda y destinatarios diferentes secuencias como resultado la formación de moléculas de ADN doble varados (heteroduplexes) que producen los cambios, cuando los híbridos no son separados en geles de poliacrilamida-desnaturalización. Los turnos son determinados por comparación a un homoduplex control de la sonda (sonda hibridada a sí mismo). El alcance de la heterodúplex cambio en comparación con el control homoduplex es proporcional al grado de divergencia entre la secuencia de las dos moléculas de ADN. Hemos demostrado una excelente correlación entre la diversidad genética y la complejidad (número de variantes) de las distintas variantes QS derivados por HMA, en comparación con el estándar de la clonación y secuenciación de la HVR1 [11 - 13, 25, 26]. Además, HMA puede ser aplicada a los estudios de evolución del VHC QS, en el contexto de la terapia, la transmisión, la patogénesis y [11, 12, 25 - 29].

Taq polimerasa es la enzima utilizada en la mayoría de los estudios de análisis de VHC QS. Sin embargo, dado que carece de Taq actividad de corrección de pruebas, matemática debates se han suscitado a sugerir que se sobreestima QS evolución por mutaciones inducidas Taq [30]. De hecho, en un informe, el uso de Taq aumento de la proporción de menores QS variantes [31], y hemos encontrado que, en general, QS diversidad es menor si la corrección de pruebas enzimas se utilizan en lugar de Taq [32]. Pero se plantea la cuestión de si Taq mutaciones inducidas afectan a los resultados y conclusiones de los estudios de cohortes basado en QS VHC. Así, en el actual estudio, y en comparación Taq polimerasa HF-2, en términos de sensibilidad y robustez, y en términos de evaluar el VHC QS diversidad y la complejidad según la evaluación de CFA de la HVR1-E2 sobre la base de referencia muestras de 20 pacientes en la HALT - C juicio y el 12 de VHC-VIH co-infectados pacientes que reciben o no reciben TARGA.

Resultados

Características clínicas de la HALT-C-VHC y el VIH los pacientes co-infectados se representan en los cuadros 1 y 2. HALT-C para los pacientes, todos los pacientes estaban infectados con VHC genotipo 1, con 10/20 (50%), siendo el genotipo 1a, y 7 / 20 (35%), siendo el genotipo 1b. Subtipo designaciones no se obtuvieron de 2 / 20 (10%) pacientes con genotipo 1, y 1 paciente fue designado como tipo 1a o 1b. 16/20 (80%) pacientes eran varones. La edad media de los pacientes fue de 48,9 años, y el promedio de carga viral fue 10 6,56 UI / ml (3,6 × 10 6 UI / ml). Para el VHC / VIH co-infectados pacientes, todos los pacientes estaban infectados con VHC genotipo 1, con 10/12 (83%), siendo el genotipo 1a, y 2 / 12 (17%), siendo el genotipo 1b. Ocho de los 12 pacientes (67%) eran varones. La edad media de los pacientes co-infectados fue de 44 años, y el promedio de carga viral fue 10 6,53 UI / ml (3,3 × 10 6 UI / ml).

Figura 1 se presenta la sensibilidad de la PCR HVR1-E2 utilizando versus Taq polimerasa HF-2. Diluciones seriadas del VHC norma internacional se ejecuta a través del ensayo, y de los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa. Como se muestra en la Fig. 1, Taq producido en todos los productos de amplificación de diluciones, con 1 de 2 duplicados de las muestras de dar una señal a una dilución de 50 UI / ml. Sin embargo, la HF-2 enzima producida más que producto de PCR en todos los Taq diluciones y ambas repeticiones fueron positivos en 50 UI / ml. Debajo de cada carril es el resultado de Roche COBAS Amplicor cualitativo pruebas de RT-PCR de la misma suero, que se califican como positivo (+) o negativo (-). A 50 UI / ml Amplicor la prueba fue positiva para el 1 de las 2 copias. Los datos indican que la sensibilidad de la Taq y HF-2 enzimas son similares a la de ensayo Amplicor, y el HF-2 enzima fue ligeramente más sólida y sensible que Taq polimerasa.

El 2 enzimas producidas QS diversidad y la complejidad que los resultados se correlacionaron (análisis de regresión lineal: R cuadrado: 0,4113, p <0,0001 a la diversidad, y la R-squared: 0,311, p <0,001 para la complejidad; rango de correlación de Spearman prueba: r = 0,68, p <0,0001 a la diversidad, y r = 0,47, p <0,01 para la complejidad). La figura 2 muestra la frecuencia de análisis clonal representante (CFA), de HALT-C de referencia muestras de los pacientes 9 (figura 2A], 6 pacientes (figura 2B] y 16 pacientes (figura 2C], amplificado por tanto Taq y HF-2 enzimas. El primer carril de cada gel homoduplex representa el control de la sonda, hibridadas obtenidos por la sonda a su radiomarcada no etiquetados libre. El homoduplex (designado como "HD" en la figura) sirve como el punto de referencia para todas las comparaciones de los distintos patrones de cambio clonal gel. El segundo carril de cada gel representa la heterogénea (es decir, no clonal) PCR producto, que contiene todas las variantes en el nivel de calidad de amplificación de la muestra de suero, y se designa como "H" en la figura. Para cada CFA, un cambio de control se incluye también, en el que participan la hibridación de la sonda hibridada a otra HVR1 producto de PCR. En todos los casos, pasar los controles de los cambios producidos claramente identificables, lo que indica la reacción de hibridación y la electroforesis fue exitoso (datos no presentados). Un control interno también se deriva de una comparación de la heterogénea producto de PCR ( "H") frente a los patrones de cambio CFA gel. Si el gel de cambio de los patrones de cada uno de los clones son representativos de la heterogénea PCR producto, el Comité de Libertad Sindical ha tenido éxito [11, 26, 27].

Como se muestra en la Figura 2A, paciente 9 había muy pocos discernible gel turnos, y los cambios no fueron muy distintos de las homoduplex control de la sonda. El mismo patrón se observó cuando uno de Taq o HF-2 fue utilizado. De hecho, las puntuaciones de Taq HMR y HF-2 (0,9954 vs 1,0000) fueron similares, al igual que la complejidad de las puntuaciones de las muestras analizadas por Taq y HF-2 (2 vs.1 variantes). La línea plana naturaleza de la CFA patrón no se debió a un fallo de la reacción de hibridación, ya que el cambio de control (la misma sonda hibridada a un producto diferente HVR1 PCR) se produjo un cambio significativo en gel de cambio (datos no presentados). Además, el mismo patrón se observó cuando el heterogéneo producto de PCR (antes de la clonación) se hibridó con la sonda (Figura 2A, carril 2). Los resultados indican que este paciente había mínimo QS heterogeneidad. En contraste, los pacientes en 6 turnos gel claramente identificable, en comparación con la sonda (Figura 2B]. El mismo patrón se observó si la reacción se realizó con Taq o HF-2 enzima. Una vez más, Taq y HF-2 resultados fueron similares tanto para HMR (0,9903 vs 0,9912 (Taq vs HF-2)) y la complejidad (8 vs 6 variantes (Taq vs HF-2)). El gel de cambio de patrón observado con CFA fue similar a la observada cuando el patrón heterogéneo producto de la PCR mismo tiempo punto se hibridó con la sonda (Figura 2B, carril 2). Paciente 16 mostradas aún más marcada heterogeneidad QS (Figura 2C]. Esta fue su cuantificación, tanto en términos de HMR (0,9047 vs 0,9409 (Taq vs HF-2)) y la complejidad (6 frente a 9 variantes, (Taq vs HF-2)). Los gráficos de barras en los gráficos 2D y 2E resumen de la diversidad (HMR) y la complejidad de datos, y confirmar la QS progresivamente creciente diversidad y complejidad de los pacientes 9, 6, y 16. Tenga en cuenta que el aumento de QS diversidad se refleja como una disminución de la HMR.

Además, dio Taq inferior HMRs indicativo de mayor diversidad en todos los 3 pacientes, y una mayor complejidad en las puntuaciones de 2 de los 3 pacientes. Los datos sugieren que el VHC puede sobreestimar Taq QS diversidad genética y de la complejidad cuando analizados por HMA.

De examinar más a fondo esta cuestión, CFA se realizó durante 20 HALT-C especímenes de referencia, y QS resultados diversidad y complejidad resultados fueron determinados. Estos datos se resumen en la Tabla 1 y se muestra gráficamente en la Figura 3. Figura 3A muestra los resultados HMR, mientras que la Figura 3B muestra la complejidad de las puntuaciones de los 20 pacientes HALT-C analizados por ambas enzimas. El promedio de Taq HMR fue amplificado muestras 0.9845 (rango 0.9047-0.9993), mientras que el promedio para el HMR HF-2 enzima fue 0.9889 (rango de 0,9407-1,000). Taq muestras parece algo más diversas que HF-2 muestras. Sin embargo, esta tendencia no alcanzó significación estadística (p = 0,126). Del mismo modo, la media de la complejidad de las muestras amplificadas Taq fue de 4,8 (rango 2-8), mientras que el promedio para la complejidad HF-2 enzima fue de 3,6 (rango 1-9). QS complejidad resultados fueron más altos en las muestras amplificadas por Taq, en comparación con las muestras amplificadas por HF-2 (p = 0,033).

Acumulativamente, los datos indican que el VHC QS Taq sobrevalora la diversidad genética y de la complejidad. Sin embargo, lo que no está claro es si esta tendencia a la sobreestimación de los efectos Taq QS resultados en los estudios clínicos.

Para abordar esta cuestión, que agrupan los 20 pacientes HALT-C de acuerdo a si son positivas o negativas suero para ARN del VHC tras 20 semanas de IFN pegilado más ribavirina terapia. Mediante este criterio, 6 pacientes fueron ARN-VHC negativo y 14 pacientes fueron ARN del VHC positivos en la semana 20. La figura 4 presenta las HMR y la complejidad de las puntuaciones de los 2 grupos de pacientes y demuestra que HMR y la complejidad resultados fueron similares entre los pacientes que fueron ARN-VHC negativo o positivo después de 20 semanas de peg-IFN más ribavirina, con independencia de la enzima utilizada. Hubo una tendencia de HF-2 muestras de la generación de menor complejidad, en comparación con las puntuaciones de Taq muestras, pero la diferencia no fue significativa. Tenga en cuenta también que la reducción de la complejidad de las puntuaciones HF-2, en comparación con Taq muestras procesadas entre la semana 20 respondedores y no respondedores refleja los resultados cuando todos los pacientes fueron examinados conjuntamente (Figura 3].

Para seguir determinar si la elección de la amplificación enzimática afecta a los resultados del paciente en los estudios de cohorte, en comparación QS diversidad y complejidad de las muestras entre el 12 de VHC / VIH co-infectados pacientes tratados o no tratados con gran actividad la terapia antirretroviral (HAART). Como se muestra en la Figura 5, los pacientes que reciben TARGA ha aumentado la diversidad QS (que se muestra como una disminución de la HMR en el panel A) y la complejidad (grupo B) en comparación con los pacientes que no reciben TARGA. Esta tendencia se manifiesta con independencia de Taq y HF-2 fueron utilizados. El aumento en la diversidad y la complejidad resultados a la TARGA no alcanzó significación estadística. Por otra parte, y la complejidad HMR resultados no fueron significativamente diferentes entre Taq y HF-2 muestras. De hecho, HAART-muestras amplificadas por HF-2 mostraron una tendencia de aumento de la complejidad resultados (complejidad = 4), en comparación con muestras de Taq (complejidad = 3.2). Estos datos sugieren que, si bien puede sobreestimar Taq QS complejidad, que probablemente no oculten clínicos potencialmente importantes asociaciones QS VHC cuando se analizan por HMA.

Discusión

En la presente investigación, encontramos que la sensibilidad de Taq y HF-2 enzimas en amplificar la HVR1-E2 fueron similares a las cualitativo Roche COBAS Amplicor RT-PCR ensayo. La HF-2 enzima genera más producto y la PCR fue más sensible que la Taq. Para muestras HALT-C, QS diversidad, expresado como un HMR, fue similar para ambos Taq y HF-2 enzimas, aunque Taq tiende a dar mayor diversidad de resultados. QS complejidad del VHC fue significativamente mayor en muestras amplificadas por Taq, en comparación con las muestras amplificadas por HF-2. Por el contrario, en el VHC / VIH co-infectados muestras, la diversidad y la complejidad resultados fueron similares en los dos enzimas. Los datos de este limitado de cohortes sugieren que QS resultados no son significativamente influido por la elección de la polimerasa cuando se utiliza el método de CFA.

Nuestros datos indican que los errores inducidos Taq proporcionar estimaciones infladas de VHC QS diversidad y complejidad. Los datos están en consonancia con anteriores modelos matemáticos de VHC QS mutaciones [30], y un estudio reciente que demostró que los errores inducidos Taq puede generar variantes QS menor [31]. Sin embargo, nuestros resultados muestran sólo una tendencia de aumento de HMR de Taq amplificado HALT-C, así como muestras de HMR y la complejidad de las puntuaciones de VHC / VIH co-infectados muestras. Sobre la base de los actuales resultados, parece que Taq y corrección de pruebas enzimas son aceptables para el VHC QS analizados por CFA. Sin embargo, otros estudios sobre cohortes más grandes de pacientes hay que llevar a cabo.

Evolución genética en la HVR1-E2 se cree que reflejan las fuerzas de impuesto selectivo de este dominio por anticuerpos neutralizantes [4 - 10]. También es posible que la respuesta inmune mediada por células haga puedan presiones selectivas sobre HVR1. A la vista de la presión inmune, la plasticidad de la HVR1 puede permitir que el virus de persistir. Sin embargo, estudios recientes sugieren que la HVR1, aunque es la región más variable en el genoma del VHC, tiene ciertas limitaciones en su estructura. Es intrigante que la clave básica de residuos son altamente conservados, que mantiene las propiedades químicas y la conformación de la HVR1 [33]. Porque HVR1 es un dominio expuestos en la proteína E2, estos datos sugieren que la carga positiva HVR1 participa en la interacción con las moléculas con carga negativa, como lípidos, proteínas, o glicosaminoglicanos (GAG). Como tal, el HVR1 pueden interactuar con la célula huésped GAG facilitar el reconocimiento y la adhesión [33]. En este sentido, recientemente se ha demostrado que el VHC QS pretratamiento de alta diversidad y complejidad en la línea de base están asociadas con la falta de respuesta a IFN pegilado ribavirina en pacientes HALT-C [34].

La terapia HAART parece aumentar el VHC QS diversidad y complejidad, con independencia de la enzima utilizada, pero esto no alcanzó Significado en esta pequeña cohorte. Estos datos están en consonancia con los recientes informes que sugieren que HAART reconstitución inmune inducida por el VHC unidades QS evolución [18, 19]. Adicional sobre ensayos prospectivos más grandes cohortes de pacientes son necesarios para examinar más a fondo las relaciones entre la presión inmune, el VHC QS evolución, y la progresión de la enfermedad hepática en pacientes coinfectados con VIH y VHC.

Materiales y métodos
Los pacientes

Veinte pacientes que cumplieron los criterios de entrada para el ensayo HALT-C se incluyeron en el estudio actual. Las muestras de suero de referencia (semana 0; (W00)), antes del inicio de la terapia IFN, fueron analizados. Escrito, el consentimiento informado fue proporcionada por todos los pacientes, a raíz institucional y el proceso especificado IRB reglamentos. El diseño y realización de los ensayos HALT-C, se han descrito [21]. En pocas palabras, en el período inicial o en curso de la terapia, todos los pacientes sean tratados con interferón pegilado (Pegasys, de Roche) más ribavirina durante un período de 24 semanas, con evaluación virológica en la semana 20 para evaluar si son o no tener una respuesta virológica. Los pacientes que son respondedores en la semana 20 de tratamiento y seguir recibiendo un curso completo de 48 semanas de tratamiento. Los que siguen siendo positivos para el VHC en el suero en la semana 20 son asignados al azar a recibir ya sea seguido de baja dosis de interferón pegilado (sin más ribavirina) o ningún tratamiento adicional más allá de la observación cuidadosa para los 3,5 años. Inmunología y virología accesorios incluidos QS análisis de los estudios están encaminados a ampliar nuestra comprensión de las complejas interacciones de los virus y de acogida en esta enfermedad debilitante y generalizada [34].

Las muestras procedentes de doce pacientes co-infectados con el VIH y el VHC fueron también analizados. Siete de estos pacientes reciben TARGA, mientras que 5 pacientes no. Todos los 32 pacientes fueron infectados con el VHC de genotipo 1.

E2-HVR1 RT-PCR de amplificación y clonación

HCV RNA fue extraído a partir de 100 μ l de sueros de pacientes utilizando ARN del VHC en el aislamiento columnas (Qiagen). ARN se resuspendió en agua tratada con DEPC, y convertido en cDNA utilizando oligonucleótidos AMV y de la transcriptasa inversa, como se describe anteriormente [26]. La misma muestra fue entonces cDNA amplificado utilizando cualquiera de Taq (Perkin Elmer, Wellesley, MA) o Alta Fidelidad Advantage 2 (HF-2) (Clontech; Mountain View, CA) polimerasas, utilizando una reacción de PCR anidado como se describe [26]. Proporcionar un comienzo caliente, AmpliWax (Perkin Elmer) piedras fueron utilizadas para separar la enzima Taq y cebos, mientras que el HF-2 contiene una mezcla de enzimas anti-anticuerpos Taq. Los primers generado la esperada segunda ronda producto de 176 pares de bases. Productos de PCR fueron extirpados y purificado con el sistema de depuración de QiaEx (Qiagen, Valencia, CA), ligated en pCR2 vector, y se transforma en células TOP10 como se describe [11].

Sensibilidad de E2-HVR1 el ensayo de PCR

Para determinar la sensibilidad de la HVR1-E2 utilizando el ensayo de PCR de alta frecuencia versus Taq polimerasa-2, diluciones seriadas de un VHC Organización Mundial de la Salud (OMS), estándar internacional [35] fueron preparados a partir de 50000 a 50 Unidades Internacionales / mililitro (UI / ml) . Se extrajo el ARN, convertida en cDNA y amplificado por PCR anidada como se ha descrito anteriormente. Productos de PCR se separaron en geles de agarosa. Alícuotas de las normas de la OMS también se ejecuta a través de la Roche Amplicor ensayo de comparación interna.

Y cuantificación del ARN del VHC genotipo

ARN del VHC fue cualitativamente medida por RT-PCR utilizando la Roche COBAS Amplicor HCV prueba de la versión 2.0 (RocheMolecular Systems, Branchburg, NJ), y cuantitativamente utilizando Roche COBAS Amplicor HCV Monitor v. 2.0 (Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). La genotipificación se realizó a través de INNO-LiPA HCV II Kit (Bayer Diagnostics, Emeryville, CA) Todos los ensayos se realizaron de acuerdo a las especificaciones del fabricante.

Análisis de frecuencias clonal (CFA)

Para cada producto de PCR clonado HVR1, 20 colonias fueron recogidos directamente en los tubos para volver a la amplificación de la segunda ronda de PCR producto. Así, por cada paciente, el 20 de PCR productos que representan el 20 individuales QS clones derivados de la línea de base de suero fueron analizadas. Productos de la PCR se visualizaron en bromuro de etidio-geles de agarosa teñidos, y uno HVR1 producto de PCR fue seleccionada al azar, purificado, tal como se describe más arriba, y al final, marcadas con 32 P ATP y T4 polinucleótido quinasa. No incorporado etiqueta se separó con Centrisep columnas (Princeton separaciones, Adelphia, NJ), y la sonda de ADN marcado fue eluida de la columna. Etiquetados sonda se hibridó directamente a cada producto de amplificación de PCR durante 2 horas a 55 ° C como se describe [11]. Los híbridos fueron separadas el 6% no desnaturalización MDE geles de poliacrilamida (Cambrex, Baltimore, MD) y visualizados por autorradiografía como se describe [11].

Análisis de Datos

QS complejidad fue determinado por el número total de los patrones de cambio único gel. QS diversidad genética fue determinada por la media de heterodúplex derivados de la movilidad de todos los clones homoduplex relativo a la sonda de control. Un heterodúplex movilidad ratio (HMR) se calcula dividiendo la distancia en milímetros (mm) desde el origen de la gelatina a la heterodúplex por la distancia en mm desde el origen hasta el homoduplex control. En el caso de que ambos capítulos de la heterodúplex se distingue claramente, el promedio de la distancia de cada línea de la heterodúplex se utilizó para calcular heterodúplex la movilidad [25]. El HMRs para todas las variantes en un promedio de la población es proporcionar a la final HMR valor. No paramétrica de Wilcoxon Firmado pruebas de las categorías se utiliza para comparar las diferencias en la complejidad y la diversidad QS resultados entre los diferentes enzimas. Análisis de regresión lineal y correlación de Spearman en la clasificación de las pruebas también se utilizaron para determinar la correlación de Taq y Ad-HF2 QS mediciones de diversidad y complejidad.

Agradecimientos

Esta es la publicación número 9 de la HALT-C Trial Group. Apoyo financiero: Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y del Riñón y el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas en virtud de los contratos números N01 DK92318, DK92319, DK92321, DK92324, DK92325, DK92326, y DK92328, con fondos suplementarios de El Instituto Nacional del Cáncer, el Centro Nacional de Salud para Minorías y Disparidades de Salud y por el Centro de Investigación Clínica General de subvenciones del Centro Nacional de Recursos para investigación, los Institutos Nacionales de Salud (subvención números M01 RR00043, RR00633, RR06192). Fondos adicionales para realizar este estudio fue proporcionado por Roche Laboratories, Inc

Autores sin relaciones financieras a revelar son los siguientes: SJP, DGS, MAA, JYD, y CM. Financiera relaciones de los autores con Laboratorios Roche / Hoffmann-La Roche, Inc, son las siguientes: supervisión, control y vigilancia es un consultor y orador de la mesa miembro; KLL es un consultor y recibe apoyo a la investigación; HLB es un consultor, orador miembro de la Mesa, y recibe la investigación Apoyo; AMDB es un consultor, orador miembro de la Mesa, y recibe apoyo a la investigación; WML es un orador y miembro de la Mesa recibe apoyo a la investigación, y DRG recibe subvención educativa de apoyo.

Los autores agradecen la HALT-C estudio de los investigadores, personal de investigación, y los participantes. Los miembros de la HALT-C Trial Group que contribuyeron a la realización de los estudios clínicos son: Dawn Bombard, RN; Minjun Chung; Maureen Cormier, NP-C; Nicole Crowder, LVN; Michael Doherty, MS; Rivka Elbein, RN; Donna Giansiracusa, RN, BSN; Carol B. Jones, RN; Michelle Kelley, ANP; Debra King, RN; Rachel Vida, BS; Peter F. Malet, MD; Savant Mehta, MD, Susan L. Milstein, RN; Patricia Osmack ; Amanda Reeck; Marisol Serrano; Rohit Shankar; Judy Thompson, RN, y Elizabeth Wright, PhD.