Raras mutaciones que predisponen a la poliposis adenomatosa familiar en griego pacientes con PAF

Mutaciones germinales en el gen APC son la causa más importante para el síndrome de Polyposis adenomatosa familiar que sigue un patrón de herencia autosómico dominante [1, 2]. FAP pacientes desarrollan múltiples a miles de pólipos de colon antes de su segunda década de vida.

Si se deja sin tratar los pólipos que dan lugar a cáncer colorrectal en casi todos los casos. El síndrome tiene dos formas, una denominada PAF clásico y uno más leve forma atenuada denominado FAP (AFAP) [3]. La mayoría de los pacientes con PAF extracolonic desarrollar ciertas características [3, 4]. La hipertrofia congénita del pigmento retiniano Epitelio (CHRPE) está presente en la mayoría de los pacientes con PAF. Casi el 94% de APC germinal mutaciones dar lugar a una proteína truncada producto. Treinta y tres por ciento de los APC representan mutaciones sin sentido mutaciones puntuales, el 6% de las pequeñas inserciones y deleciones pequeñas 55% [5].

Recientemente, varios estudios han demostrado la presencia de mutaciones APC menos común en los pacientes con PAF, como los grandes reordenamientos genómicos que afectan a mutaciones o empalme [6, 7]. En general, se observó que las grandes reordenamientos tienen más probabilidades de producir un fenotipo PAF clásico, mientras que las mutaciones de empalme tienden a resultar en atenuados FAP (AFAP) [8 - 13].

Las grandes reordenamientos representan hasta un tercio de identificado mutaciones en el BRCA1 y el hMLH1 y hMSH2 genes que son responsables de otros o distintos tipos de cáncer relacionados, respectivamente [14, 15]. En APC, los porcentajes son más bajos, pero de acuerdo a los últimos informes pueden alcanzar hasta el 10% de las mutaciones identificadas [16]. Recientemente, MLPA se ha utilizado en nuestro laboratorio, a fin de identificar grandes supresiones en el hMSH2 genes BRCA1 y [17, 18].

Sitio de empalme mutaciones son un acontecimiento común para inactivar varios genes humanos calcula que representan aproximadamente el 15% de las mutaciones [19]. En el cajero automático y la NF1 genes que representan alrededor del 50% de las mutaciones identificadas [20, 21]. Más frecuente blanco de las mutaciones del sitio de empalme son el consenso y GT AG donante y aceptor dinucleotides respectivamente. Sin embargo, varias mutaciones sitio de empalme o alterar otras exonic nucleótidos vecinos intronic el consenso sitios, se han descrito [12, 21, 22]. Screening de los correspondientes genes' cDNA aclara la mayoría de los defectos de empalme.

Sin embargo, estos estudios señalan la necesidad de más intensivo de detección de la mutación de codificación de la región y la salida del empalme de secuenciación. Finalmente, estos estudios de abordar la cuestión de que tales mutaciones poco frecuentes puede haber sido subestimado debido a los métodos de detección de la mutación que se han utilizado generalmente en el último decenio.

En el presente estudio, dos casos de familias con dos PAF raro APC mutaciones se presentan: un sitio de empalme mutación en el quinto de nucleótidos de intrón 9 y un gran genómica supresión de un cromosoma 5 que abarca cerca de 250 Kbp, a partir de intrón 5 de la Gen APC y se extienda más allá de exón 15. Estamos también más apoyo nuestro estudio en curso sobre la presentación de otros cuatro PAF frameshift mutaciones del gen APC gen identificado en cuatro pacientes no relacionados.

Por último, se propone un algoritmo simple para la APC pruebas genéticas de los pacientes con PAF sobre la base de nuestra experiencia después de cribado 96 personas de 25 familias de nuestra PAF griego cohorte.

Los pacientes fueron remitidos a nuestro centro y los seleccionados para las pruebas genéticas que se describió anteriormente [4]. Se obtuvo la aprobación ética de la HYGEIA - Centro de diagnóstico y terapéutica de Atenas SA - hospital del comité consultivo (ref.27931/23.10.2000) y todos los pacientes firmaron un consentimiento informado.

ARN y ADN genómico purificado se leucocitos de la sangre periférica mediante protocolos estándar de la extracción, como ya se ha descrito anteriormente [4].

Todos los 16 exones (1-15, 10A), incluyendo los cruces de empalme de APC fueron amplificados por PCR (polymerase chain reaction) como ya se ha descrito en otra parte [4, 23]. Los primers utilizados fueron tomados de otros estudios [1, 4].

El WAVE sistema de análisis de fragmentos de ADN (Transgenomic, Inc, EE.UU.) y asociados WAVE-Maker ™ software se utilizaron como ha sido descrito previamente [23].

Purificación de los productos de PCR y secuenciación automatizada del ciclo para ambos capítulos se realizó en el ABI Prism ^® 310 Genetic Analyzer como ha sido descrito previamente [4, 23].

Primer capítulo de síntesis desnaturalización fue realizada por aproximadamente 500 - 1000 ng RNA total y azar hexámeros (5 μ M concentración final) durante 4 min a 70 º C, seguido por el broche de congelación en hielo y además de dNTPs (0,5 mM concentración final), 1 U / Μ l RNasa inhibidor recombinante (Invitrogen, Países Bajos) y 200 U de transcriptasa reversa MMLV (Invitrogen, Países Bajos). La mezcla se incubó a 37 ° C durante 1 hora seguido de la desnaturalización de las enzimas a 95 ° C durante 5 min. 4 μ l de cDNA se utilizaron para su posterior amplificación de PCR. Los primers utilizados para la PCR fueron descritas por Varesco et al (1994) [22] y ampliar el cDNA región entre 8 y 12 exones del gen APC.

MLPA se llevó a cabo utilizando el kit P043 APC (MRC-Holland, Países Bajos) según las instrucciones del fabricante. Fragmento de análisis se llevó a cabo en el ABI Prism ^® 310 Genetic Analyzer utilizando TAMRA-500 proporcionado por el fabricante, como el tamaño estándar. Un pico de patrón, de 31 picos que van en tamaño de 130 a 400 nt se obtiene [24].

Metafase cromosoma preparativos se obtuvieron a partir de linfocitos de sangre periférica usando técnicas estándar. Análisis citogenético convencional se realizó utilizando de bandas GTG de alta resolución (1200 bandas). Las células fueron analizadas, y karyotyped capturados por ordenador de imágenes (Cytovision sistema, Análisis de imagen, Applied Imaging, Sunderland, UK).

FISH análisis se realizó como ya se ha descrito por Dauwerse JG et al (1992) [25]. Cosmid sondas cAPC1, cAPC2, cAPC3 para el gen APC y MCBCD, para el MCC gen en la banda 5q22.2 simultáneamente se hibridó con el telómero PAC GS-240G13 (5qter) y SG-24H17 (5pter) para la identificación del cromosoma 5 [26 , 27].

Una familia en la proband era un hombre joven a la edad de 29 con un fenotipo que muestran más de un centenar de pólipos en todo el colon, sobre todo en el recto, sigma y colon descendente. No se encontraron pólipos en el esófago, el duodeno y el íleon, a excepción de una lesión polipoide adenomatosa en el estómago. Los pólipos se adenomatosa, menores de 5 milímetros y algunos adenomas tubulares y serrado también fueron observados. Todos mostraron lesiones de bajo grado medio o displasia serrado, mientras que algunos adenomas fueron ligeramente hiperplásica. Examen del fondo mostraron la ausencia de CHRPE.

DHPLC cribado de la APC reveló un gen aberrante elución perfil para la amplificación que abarque tanto los exones 9 y 9A. Posterior secuenciación de amplificación que confirmó la presencia de la IVS9 +5 G> Una mutación (Fig. 1a]. Con el fin de examinar las consecuencias de la G a una transición, RT-PCR se realizó de ARN total extraído de linfocitos de sangre periférica de la proband. Total ARN normal de las personas y otros pacientes con PAF identificado mutaciones en otras regiones del gen APC, se utilizaron como controles normales para esta RT-PCR. RT-PCR productos fueron separados por no desnaturalización PÁGINA 6% y visualizados por tinción EtBr (Fig. 1b]. Dos transcripciones normal se ampliaron en todas las muestras que representan los dos empalmados normal de las formas de exón 9: 9 y 9A (Fig. 1b]. Una novela más breve transcripción fue sólo a partir de la amplificación del ARN proband (Fig. 1b]. La correspondiente banda de 336 pb fue purificado y secuenciado. Análisis de secuencias reveló un suplente transcripción en la que el conjunto de exón 9 y faltaba el exón 8 se sumaron directamente a exón 10. Este empalme de resultados anormales en una frameshift y crea una señal de STOP en la 16 ^ª codón 10 del exón (Fig. 1c].

El proband fenotipo se asemeja a la AFAP con una edad de inicio tardío. El proband's hermanos fueron asintomáticos, pero menores de 25 años de edad mientras que los padres del proband fueron de fenotipo normal. Con el fin de excluir AFAP de esas personas, que fueron seleccionadas por dHPLC para la IVS9 +5 G> Una mutación. Todos los individuos fueron genotipo de la normalidad, lo que indica que la mutación de novo.

En la familia B proband era un hombre joven a la edad de 25 con un fenotipo de más de cien pólipos a lo largo de su colon. La paciente, la madre y tío materno murió a la edad de 46 y 30 de la CRC y el cáncer de hígado - probablemente metastásico, respectivamente. La abuela materna de la paciente había muerto por CCR a la edad de 45 (Fig. 2]. Los pólipos también estuvieron presentes en el estómago, el duodeno y el íleon. Los pólipos se tubular adenomas, que varían en tamaño desde 5 a 15 milímetros y algunas con un diámetro de más de 10 mm se pediculus. Todos mostraron lesiones de bajo grado medio o displasia. Examen del fondo, demostró la presencia de CHRPE para este paciente.

DHPLC y secuenciación de toda la región de codificación de la APC, incluidos los cruces de empalme mostraron sólo la conoce polimorfismo G4479A para que el paciente se homocigotos. Considerando estos resultados y la severidad del fenotipo del paciente, se realizó MLPA para la detección de reordenamientos genómicos que pudieran habían sido detectados con las técnicas convencionales. MLPA análisis demostró la supresión de los exones 6 al 15 de un alelo, en los linfocitos del paciente, de las dos muestras de sangre (Fig. 3]. El proband asintomáticos del hermano a prueba normal.

Un gran supresión, a partir del intrón 5 y termina abajo de la última APC exón, fue revelado. Con el fin de optimizar los 3 'de corte, se realizó un análisis de cariotipo del paciente en linfocitos de sangre periférica. Cariotipo fue negativo excluyendo una deleción más de 20 Mbp. FISH análisis posterior confirmó que una gran parte de la gen APC falta de un cromosoma 5 (datos no presentados). Más FISH análisis mostró que el 3 'de la supresión de corte está mintiendo en el MCC gen cerca de su extremo 3' (datos no presentados). El 5 'es un punto de corte en intrón 5, que tiene un tamaño de alrededor de 12 Kbp. Estos datos indican que la supresión abarca alrededor de 250 Kbp.

Cuatro mutaciones frameshift (1577insT, 1973delAG, 3180delAAAA y 3212delA) del gen APC se identificaron en cuatro pacientes con PAF no vinculados y la mutación C1690T tontería fue identificado en dos pacientes no relacionados. A nuestro entender es una novela 1577insT mutación.

En dos pacientes no se identificó la mutación en el gen APC, ya sea de selección para las pequeñas inserciones, deleciones o mutaciones puntuales o para grandes reordenamientos genómicos.

En el estudio actual los IVS9 +5 G> Una mutación se identificó e investigó. Nuestro fenotipo del paciente se asemejan más a la AFAP que a la FAP, con los pequeños pólipos, en particular en el colon derecho. Una novela de transcripción se produce en la aerolínea linfocitos de sangre periférica no estaban presentes en los controles normales. Normal transcripciones también están presentes en la muestra del paciente, pero producir una reducción de la amplificación, en comparación con las correspondientes muestras de la normal (Fig. 1a]. El IVS9 +5 G> Una mutación no altera el empalme de la zona donante, pero cambios muy conservada de nucleótidos. Varesco et al, (1994) [22] han documentado la transversion de G a T (IVS9 +5 G> T) en el mismo punto de ser patógenas. El IVS9 +5 G> T mutación causas ineficiente la omisión de exón, lo cual produce un fenotipo más suave que conduzca a PAF atenuado. En ambos casos, la proteína truncada predijo producto de alrededor de 35 kDa no es lo suficientemente grande como para permanecer estable y producir un efecto negativo dominante. La ausencia de CHRPE de este paciente está de acuerdo con las conclusiones de Olschwang et al (1993) [28], que llegó a la conclusión de que los pacientes con mutaciones en el exón 9 antes no se desarrollan CHRPE.

La mayoría de las mutaciones observadas en todo el sitio de empalme de donantes, que causa aberrantes de empalme, se producen en las posiciones -1, +1 o +2 de la intrón [19]. Hay pocos informes de mutaciones alterar posición +5 [12, 21, 22]. Sin embargo, la sustitución de los residuos en la posición G +5, así como en la posición +1, se espera que produzca una reducción significativa de la base de la estabilidad emparejamiento entre el 5 'sitio de empalme y su complementario de la región U1 snRNA [29 , 30]. U1 snRNA vinculante es un paso fundamental para el correcto plegado de pre-mRNA antes de la división y bandas en la spliceosome.

Moisio et al (2002) [12], el informe también IVS4 +5 G> C mutación a causa omisión del exón 4 de la APC en el nivel de mRNA y lo AFAP. Sobre la base de los datos presentados aquí y en estudios anteriores [12, 22] llegamos a la conclusión de que la IVS9 +5 G> Una mutación es la responsable de esta AFAP fenotipo del paciente, y que el G +5 de los donantes es un sitio muy conservadas y funcionalmente importante de nucleótidos.

En este FAP familia del paciente es fenotipo clásico FAP, de acuerdo con otros estudios [8 - 10] que el apoyo a toda la gen APC supresiones producir el clásico lugar de PAF PAF atenuado. Considerando MLPA y FISH resultados, el tamaño de la supresión identificado tiene una longitud de alrededor de 250 Kbp.

La presencia de CHRPE en este paciente está en contradicción con la observación general de que los pacientes con mutaciones en el exón 9 antes no se desarrollan CHRPE. Davies et al (1995) [31] también han informado de un paciente con una mutación CHRPE y en el empalme afectan a los donantes sitio de empalme de intrón 4. Wallis et al (1994) [32] afirman que la presencia de CHRPE depende del tamaño de la proteína truncada de APC. Esto deja la posibilidad de una transcripción de fusión como el resultado de nuestra paciente la supresión ser aclarado por más experimentos, como posiblemente 3 'rápida amplificación de cDNA Ends (RACE).

Después de haber analizado 25 familias con PAF en los últimos 3 años, una familia (4%) con una gran supresión en el locus APC fue identificado. Esto apoya la idea de que los grandes eventos genómica no son raras en la APC, sino que se necesita un mayor número de datos con el fin de calcular el porcentaje entre los pacientes griego. Recientemente, la idea de que los reajustes no son tan raras de la APC, pero puede dar cuenta de más del 10% de su mutación del espectro, con el apoyo de estudios en "APC negativos" los pacientes con PAF. Su et al (2000) [6], el informe de un porcentaje del 13% y Cao et al (2001) [16] informe el 9% de los pacientes con PAF llevar grandes reordenamientos. Es posible que el verdadero porcentaje de estas mutaciones es subestimado debido a las limitaciones convencionales de la mutación de exploración utilizado hasta ahora.

Tres pequeñas supresiones, una pequeña introducción y un disparate mutación se identificó en este estudio, el apoyo al hecho de que la mayoría de APC causar mutaciones frameshift y por lo general suprimir de insertarlas nucleótidos. Las mutaciones identificadas se predice que producen proteína truncada la introducción de productos de los codones STOP: 1577insT en el codón 535, C1690T en el codón 564, 1973delAG en el codón 672 mientras 3180delAAAA y 3212delA en el codón 1125.

En los últimos 3 años hemos examinado 25 familias con poliposis adenomatosa [4, 23]. Para minimizar el tiempo, costo y esfuerzo, usamos un simple algoritmo para realizar test genéticos para los pacientes con PAF. En primer lugar, examinar cuidadosamente el fenotipo del paciente con el fin de clasificarla como clásico FAP o AFAP.

Por PAF clásico de empezar dHPLC cribado de la APC de la MCR (Mutación Cluster Region), seguida de la selección de los restantes 5 'región del exón 15. Luego el resto de los exones pantalla con el siguiente orden: los exones 11 a 14, los exones 1 a 10A y por último el resto de exón 15. MLPA se realiza con el fin de determinar las posibles graves alteraciones genómicas que afectan a la gen APC. Para AFAP pacientes, la selección sigue el orden: exones 1 - 10A, 3 'región del exón 15, exones 11 - 14, 5' y MCR región del exón 15. Si no se detecta la mutación que finalmente realizar la prueba MLPA.

Incluso después de la anterior algoritmo hay un pequeño número de pacientes en los que el FAP no patógena mutación se puede detectar en el gen APC. Estos casos incluyen pacientes portadores sin clasificar variantes de estos genes como I1307K, E1317Q y D1822V en el gen APC. Los grandes estudios epidemiológicos y los estudios funcionales con animales transgénicos son necesarios para caracterizar estas mutaciones. También, antes de examinar estos casos promotor de las mutaciones o defectos de expresión, la revisión de la historia familiar del paciente y se recomienda encarecidamente a fin de investigar la posibilidad de que otros genes están implicados. Recientemente, numerosos estudios señalan la necesidad de que la selección de genes para MYH bialélicas mutaciones en línea germinal "APC negativo" PAF pacientes [33 - 35]. En estos pacientes, surge de la poliposis múltiples mutaciones somáticas que se acumulan en el gen APC, debido a la inactivación de la bialélicas MYH.

En conclusión, la combinación de los métodos anteriores; PCR, dHPLC, RT-PCR, de secuencias y MLPA es una buena herramienta para el éxito de las pruebas genéticas de los pacientes con PAF. Permite la identificación de los comunes, pero también poco frecuentes o raras mutaciones en el gen APC. Sitio de empalme o defectos graves alteraciones genómicas puede haber sido subestimado por el de más edad y que requieren métodos de prueba y detección de genes cDNA reordenación de pruebas.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

MM llevó a cabo la detección de mutaciones, la identificación y la interpretación de los resultados y la preparación del manuscrito y las cifras, AA contribuido en la mutación de cribado, la preparación del manuscrito y la creación de la MLPA, HD realizó la FISH experimentos y su interpretación, realizado VV El cariotipo, AP realizó el examen del fondo, AK, PK, ID, JT, GF y NA material proporcionado al paciente, el diagnóstico y la gestión y la GN concebido del estudio, y participaron en su diseño y coordinación.

Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

La historia previa a la publicación de este documento puede accederse en:

Http://www.biomedcentral.com/1471-2407/5/40/prepub