Expresión de una novela de la anhidrasa carbónica, CA XIII, normales y neoplásicas en la mucosa colorrectal

Anhydrases carbónica (AC) son una familia en crecimiento de zinc que contienen Metaloenzimas que tienen un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis del pH por catalizar la hidratación reversible del dióxido de carbono, CO ₂ + H ₂ O ↔ HCO ₃ ^- + H ^+. Esta familia incluye al menos doce enzimáticamente activa de las isoenzimas, cuya localización subcelular, la distribución de tejidos y cinética propiedades diferentes. Cinco de los isoenzimas son citosólico (CA I, II, III, VII y XIII), cuatro son de membrana asociados (CA IV, IX, XII y XIV), dos son mitocondrial (CA VA y VB) y uno es una forma secretora ( CA VI) [1 - 6]. AC contribuir a varias importantes funciones biológicas, como la respiración, la resorción ósea, renal, la acidificación, la gluconeogénesis y la formación de líquido cefalorraquídeo y de ácido gástrico [1, 7].

Es típico que los tumores sólidos para crear un gradiente de pH entre los compartimientos intracelular y extracelular por la acidificación de los tejidos circundantes a la disminución de pH que en el tejido normal adyacente. Extracelular acidificación se ha asociado con la progresión tumoral muchos efectos, como la pérdida de adhesión intercelular, el aumento de la metástasis y la migración, el aumento de la tasa de mutaciones y la reducción de la reparación del ADN y upregulation de proteasas y factores de crecimiento [4]. Con el fin de mantener el gradiente de pH, las células tumorales expresan las proteínas de transporte de iones, incluidas vacuolar H ^+-ATPasa, Cl ^- / HCO ₃ ^- y el intercambiador de Na ⁺ / H ⁺ intercambiador [8, 9]. Anteriormente, el ácido láctico ha sido considerada una de las principales fuentes de acidez de los tumores [4]. Estudios más recientes han indicado, sin embargo, que el dióxido de carbono también hace una importante contribución a la acidez del tumor, lo que implica firmemente a la importancia de la actividad en CA oncogénesis. Esta hipótesis ha sido apoyada indirectamente por los recientes hallazgos de que varios inhibidores de CA puede suprimir la capacidad de invasión de células malignas líneas [4].

CA XIII es una novela enzima, que se expresa en varios tejidos humanos, incluyendo las glándulas salivales, riñón, intestino delgado, colon, útero y testículos. Modelización de CA XIII reveló que la proteína es una molécula globular, y tiene la más alta (alrededor del 60%) de identidad con las isoenzimas citosólicas CA I, II y III. Por lo tanto, CA XIII se agrupan como citosólicas / isoforma intracelular. En el anterior informe, que describe la producción recombinante de las proteínas de ratón CA XIII, que se utilizó en detallados estudios de inhibición de la actividad y [2, 10]. CA CA XIII demostrado moderada con actividad catalítica k _cat / K _m de 4,3 × 10 ⁷ M ^-1 s ^-1, k _gato y del 8,3 × 10 ⁴ s ^-1 a 25 ° C y pH 7,5 [2]. Curiosamente, CA XIII mostró inhibitoria propiedades únicas en comparación con CA I, II y IX [10]. El utilizarse clínicamente sulfonamidas incluyendo acetazolamida, methazolamide, dichlorophenamide, y dorzolamida demostrado potente inhibición CA XIII, con K _i 's en el rango de 17-23 nM. Otro grupo de los inhibidores, la sulfanilyl derivados de los compuestos, obtenido por reacción de aminosulfonamides con 4-acetamido-benzenesulfonyl cloruro mostró muy potente inhibidor propiedades CA XIII, con K _i 's en el rango de 1.3-2.4 nM, mientras que estos compuestos fueron en general Mucho menos eficaces como los inhibidores de las isoenzimas I, II y IX.

CA diferentes isoenzimas se han convertido en objetivos atractivos en estudios destinados a los mecanismos moleculares de la carcinogénesis. CA IX y XII han sido claramente asociadas con ciertos tipos de cáncer [11 - 21]. También isoenzimas citosólicas CA Iy II han sido investigados en algunos tumores incluyendo cáncer colorrectal [22, 23]. Dado que no había datos anteriores sobre CA XIII en tumores, que hemos reunido una serie de neoplasias colorrectales y los tejidos adyacentes normales, y ellos analizados por un método de tinción inmunohistoquímica de la expresión de esta novela de isoenzimas.

El conejo anti-mouse/human CA XIII anticuerpo que se ha descrito en un artículo reciente [2]. Se planteó en contra de un péptido sintético (AC-) DGDQQSPIEIKTKEC (-COOH). La afinidad y la especificidad de los anticuerpos fue confirmado por análisis de ELISA título, el Western Blot e inmunohistoquímica. En tinción inmunohistoquímica, CA XIII ha mostrado un patrón de distribución claramente diferentes en comparación con la localización de CA Io II [2]. Este hallazgo indica que la lucha contra la CA XIII anticuerpos no tienen una reacción cruzada con CA I ó II en relación con el presente tinción condiciones. Conejo en contra de antisueros humanos CA Iy II se han producido y caracterizado anteriores [24].

Las muestras de tejido normal del intestino grueso y la correspondiente benigna y / o muestras neoplásicas malignas Se recogen de forma prospectiva en el Hospital de la Universidad de Oulu (Oulu, Finlandia). La normal de las muestras por separado fueron extirpados 20 centímetros proximal de la resección de tumores sitio. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad de Oulu y realizarse de acuerdo a las directrices de la Declaración de Helsinki.

32 ámbitos distintos (tanto normal de los tejidos y las lesiones patológicas) de la mucosa colorrectal humano han sido examinados entre el 12 de los pacientes. Se trataba de 11 muestras por separado de histológicamente humano normal colon o recto y 17 de lesiones de colon, de los cuales 6 adenomas y 11 adenocarcinomas. En 4 muestras, se encontró tejido normal adyacente a la neoplasia y se incluyó en el análisis. El grado de displasia moderada y grave en el 3 en 3 adenomas. El grupo de 11 tumores malignos de colon constaba de 4 bien diferenciados y 4 adenocarcinomas moderadamente diferenciado, y 3 adenocarcinomas con un componente mucinoso. Cabe señalar que cada paciente tiene uno o más (1-3) que se analizaron las lesiones.

Los especímenes fueron fijados en Carnoy del fluido (etanol absoluto cloroformo + + ácido acético glacial 6:3:1) durante 6 horas. Las muestras fueron luego deshidratados, incluidas en parafina en una estufa de vacío a 58 ° C, y de las secciones de 5 μ m gelatina se colocaron en el microscopio en revestida de las isoenzimas El CA se immunostained por el complejo biotina-streptavidina método, de acuerdo con las siguientes medidas: ( A) pre-tratamiento de las secciones con puro suero de leche de vaca del calostro (Biotop Oy, Oulu, Finlandia) durante 30 minutos y enjuague de búfer en fosfato salino (PBS), (b) una incubación de 1 hora con anticuerpos primarios diluido 1:100 en 1% de albúmina sérica bovina-PBS (PBS-BSA), (c) una incubación de 1 hora con biotina de cabra anti-conejo IgG (Zymed laboratorios inc., South San Francisco, CA) diluido 1:300 en el 1% de BSA-PBS, (D) una incubación de 30 minutos con streptavidina-peroxidasa de rábano (HRP) conjugada (Zymed laboratorios) diluido 1:750 en PBS y (e) de incubación de 2 minutos en DAB solución que contiene 4,5 mg de 3,3 '-diaminobenzidine tetrahydrochloride ( Fluka, Buchs, Suiza) en 7,5 ml de PBS + 2,5 μ l 30% de H ₂ O _2. Las secciones se lavaron tres veces durante 10 min después de la incubación en PBS pasos byc, y cuatro veces por 5 min en PBS después paso d. Todas las incubaciones y lavados se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Las secciones fueron montadas en Neo-Mount (Merck, Darmstadt, Alemania). Las secciones fueron teñidas examinados y fotografiados con microscopio Zeiss Axioskop 40 (Carl Zeiss, Göttingen, Alemania). La intensidad de la inmunomarcación se puntuó en una escala de 0 a 3, como sigue: 0, ninguna reacción, 1, la debilidad de la reacción, 2, la reacción moderada, 3, la fuerte reacción.

XIII de la anhidrasa carbónica es una enzima descubierta recientemente, que se expresa en diferentes tejidos de mamíferos. La creación de modelos estructurales reveló que es más relacionados con los isoenzimas citosólicas, CA I, II, III y con cerca de un 60% de identidad de secuencia, y por lo tanto, esta isoenzima se agrupan en el grupo de citosólicas / isoformas intracelular. A pesar de que el anterior documento se describe la distribución de CA XIII en varios tejidos normales, no se dispone de datos se ha publicado hasta la fecha sobre su expresión en los tejidos neoplásicos. Para obtener una mejor comprensión de los cambios en la expresión que se produzcan durante el desarrollo de la neoplasia, analizamos tanto normales como patológicos colorrectal muestras de los mismos individuos.

Figuras 1 y 2 muestran algunas imágenes de CA XIII inmunoticción en los tumores colorrectales y de la mucosa normal. Reacciones de CA Iy II se muestran para la comparación. La inmunomarcación de puntuación resultados se muestran en la Figura 3. Los resultados indicaron que en general CA XIII immunoreactions seguir una pauta similar con CA I y II, es decir, las señales más débiles se convirtió, junto con el aumento de la displasia y el grado de malignidad. Hubo algunas excepciones, y, en particular, CA II expresión es relativamente alto en los adenocarcinomas con un componente mucinoso, mientras que CA Iy XIII se redujeron al igual que en otros adenocarcinomas (Fig. 2].

Estudios anteriores han indicado que CA IX y XII se sobreexpresa en algunos tumores, incluidos los de adenomas y carcinomas colorrectales [18, 23]. Han sido funcionalmente vinculados a la acidificación extracelular en tumores que aparece para regular el comportamiento invasivo de las células tumorales. En consecuencia, la expresión de CA IX se ha asociado con mal pronóstico de algunos tumores malignos [19, 20, 25, 26]. Sobre la base de los resultados actuales y anteriores [23], las isoenzimas citosólicas I, II, XIII y probablemente no juegan un papel significativo en la regulación de pH en los tumores. En lugar de ello, pueden ser factores importantes para la fisiología normal intestinal. Esta propuesta plantea una importante cuestión de por qué, al menos, tres isoenzimas citosólicas se expresan en la mucosa colorrectal normal. Aunque no podemos responder a esta pregunta en este momento, es de interés que estos representan AC con diferentes isoformas cinética o propiedades inhibitorias. CA II exhibe el más alto y yo CA y CA XIII moderada hydratase actividades de dióxido de carbono [2]. Debido a las diferentes características bioquímicas, es poco probable que todos estos isoenzimas puede contribuir a la regulación del pH mismo proceso. Si este es el caso, se podría sugerir que las enzimas con actividades de baja o moderada debe representar algún tipo de "basura" las proteínas en el proteoma. Sin embargo, hay otras explicaciones posibles que podrían considerarse más sólida en un sistema biológico. En primer lugar, varias isoenzimas CA han surgido durante la evolución, ya que CA actividad enzimática es muy necesario para las reacciones fundamentales en el cuerpo. En caso de que uno de isoenzimas es funcionalmente defectuosa, y los demás podrían compensar la falta uno. Estos mecanismos de compensación se explica en parte por qué las diferentes deficiencias CA normalmente no producen, o sólo leves cambios fenotípicos [27 - 29].

Otro posible papel de citosólicas AC podría estar vinculado a una hipotética función de supresor de tumor. Es notable que CA1, CA2 y CA13 genes están estrechamente vinculados localización en el brazo q del cromosoma 8. Simultánea pérdida de la expresión pueden ser el resultado de una supresión o mutaciones puntuales de regulación dentro de las regiones o alelos especificando estos genes. El descenso de regulación también podría resultar de la reducción de los niveles de un factor de transcripción. Independientemente del mecanismo, tres isoenzimas citosólicas CA se ven afectados de tumores colorrectales, y sería tentador proponer que normal CA I, II y / o XIII proteínas podría tener un tumor supresor de la función en las células epiteliales, y la supresión de los alelos podrían Un factor importante en la cascada de eventos que contribuyen a la carcinogénesis colorrectal. Aunque el cáncer colorrectal se ha asociado con ganancia del cromosoma 8q en una serie de estudios previos, y no se han reportado pérdidas [30 - 33], existen ciertos indicios de que 8q21 contiene una aún no identificada gen supresor tumoral [34, 35]. Sin embargo, más grandes conjuntos de los tumores se requiere para definir explícitamente, CA si estos genes están implicados en las alteraciones genéticas de los tumores colorrectales.

CA XIII expresión está claramente disminuido en los tumores de colon en comparación con el tejido normal en un patrón similar al CA I y II. Pérdida de la expresión de estrechamente vinculada CA1, CA2 y CA13 genes puede dar lugar a la disminución de los niveles de un factor de transcripción o de la pérdida de alelos especificando estos genes.

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Todos los autores participaron en el diseño del estudio. JS, conocimientos tradicionales y Azad Jammu y Cachemira el recogido muestras de tejidos. LK SP y redactó el manuscrito. JMH y SP caracteriza los anticuerpos. LK realizó la tinción inmunohistoquímica. LK, JK y SP analizaron los resultados de la tinción. Todos los autores leer, modificado y aprobado el manuscrito final.

La historia previa a la publicación de este documento puede accederse en:

Http://www.biomedcentral.com/1471-2407/5/41/prepub