Cancer Cell International, 2005; 5: 12-12 (más artículos en esta revista)

Dietética ácidos grasos omega-3 y la radiación ionizante sobre el cáncer de mama humano xenoinjertos crecimiento y la angiogénesis

BioMed Central
W Elaine Hardman (hardmawe@pbrc.edu) [1], LuZhe Sun (sunl@uthscsa.edu) [2], Nicholas corto (cameron@uthscsa.edu) [2], Ivan L Cameron (cameron@uthscsa.edu) [2]
[1] Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, Baton Rouge, Louisiana 70808 USA
[2] University of Texas Health Science Center at San Antonio, Department of Cellular and Structural Biology, San Antonio, Texas 78229 USA

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Resumen
Antecedentes

Los efectos de un omega-3 (n-3) una dieta enriquecida en ácidos grasos por sí solo y en combinación con radiación gamma (IR) en ratones desnudos teniendo un humano MDA-MB231 xenoinjertos de cáncer de mama se pusieron a prueba. El cáncer de células fueron inyectadas en la almohadilla de grasa mamaria de ratones jóvenes. Seis semanas después, los ratones fueron divididos aleatoriamente en dos grupos de la dieta: 1) los ratones con un 10% de aceite de maíz (rico en ácidos grasos omega 6) en su alimentación, 2) los ratones que consumen un 10% de la dieta de grasa que se enriqueció en grasos n-3 Ácidos. Después de dos semanas de la dieta, el tratamiento con 200 cGy de IR cada segundo día durante cuatro tratamientos (total 800 cGy) se inició en la mitad de la dieta de los ratones de cada grupo. Algunos ratones en cada uno de los 4 grupos fueron sacrificados 24 horas desde el final de la IR en tanto que el resto de los ratones fueron seguidos durante 3 semanas adicionales. Tumor secciones fueron teñidas con células endoteliales con CD31 y PAS y de la hipoxia inducible factor 1 α (HIF-α).

Resultados

El tumor de la corteza en 100 micrones de la cápsula bien vascularizada tenían poca vascularización. Los vasos sanguíneos, capilares, y endoteliales pseudopods se encontraron en las zonas de más de 100 micras de la cápsula (subcortex). Ratones en la dieta de aceite de maíz y tratados con 24 horas antes de IR o no irradiado ratones alimentados con la dieta n-3 tienen tumores con menos vasos sanguíneos en el subcortex endotelial pseudopods y más en la proyección de hipoxia (HIF-α positivo) zonas que hizo ratones De los no irradiados grupo que recibió aceite de maíz. La tasa de crecimiento del tumor de los ratones que recibieron de infrarrojos o de que se alimentaron los n-3 ácidos grasos dieta enriquecida fue significativamente más lento que en los ratones alimentados con el 10% de la dieta de aceite de maíz. Estos efectos colaterales perjudiciales se encuentra sólo en los ratones tratados IR.

Conclusión

El ácido graso omega-3 dieta enriquecida demostrado ser un método seguro para retardar el crecimiento del tumor y la vascularización.

Antecedentes

Y de los animales y los estudios epidemiológicos indican que el aumento del consumo de omega-3 (n-3) frente a la ingesta de ácidos grasos de omega-6 (n-6) ácidos grasos disminución en el riesgo de cáncer [1 - 10]. Los estudios en animales indican que el aumento del consumo de ácidos grasos n-3 pueden disminuir el crecimiento de xenoinjertos de cáncer y puede aumentar la eficacia y reducir los efectos secundarios de varios agentes de quimioterapia [11 - 18]. Aunque el consumo de un n-3 ácidos grasos dieta enriquecida se ha demostrado reducir el crecimiento tumoral en animales xenoinjertos, es más probable que se utilice en combinación con quimioterapia o con radiación ionizante (IR) en el tratamiento de pacientes con cáncer. Más de la mitad de todos los pacientes de cáncer reciben terapia de IR durante el ciclo de tratamiento [19]. Por tanto, parece importante para determinar el crecimiento del tumor retardar los efectos de infrarrojos y de un n-3 ácidos grasos dieta enriquecida tanto por sí solo y en combinación. Como ambos IR [20, 21] y la dieta ácidos grasos n-3 [22, 23] se informa de suprimir la angiogénesis tumoral, se razonó que el uso combinado de estas dos modalidades de tratamiento pueden tener un efecto aditivo sobre la represión del crecimiento tumoral y De la angiogénesis. También se decidió poner a prueba la idea de que la continuación del consumo de ácidos grasos n-3 a raíz de un curso de terapia de infrarrojos puede reprimir rebrote de la IR tratarse tumor, tal vez por la continua supresión de la angiogénesis tumoral.

El estudio que aquí se diseñó para investigar el potencial de los ácidos grasos omega-3 en la dieta para inhibir el crecimiento y la angiogénesis de un humano xenoinjertos de cáncer de mama y comparar los efectos de: 1) un curso de uso de infrarrojos que supongan exposición a 200 CGy cada dos días por un total de 800 cGy, 2) un n-3 ácidos grasos dieta enriquecida, y 3) una combinación de estos dos regímenes de tratamiento sobre el crecimiento del tumor, en la angiogénesis tumoral, y sobre los efectos secundarios de cada tratamiento. A pesar de que este estudio utilizó todo el cuerpo IR terapia, la mayoría de infrarrojos de la terapia de pacientes humanos, se limita a determinadas regiones del cuerpo general de reducir al mínimo los efectos secundarios del tratamiento de infrarrojos.

Nuestro estudio resultados demuestran el potencial de la n-3 enriquecido en ácidos grasos dieta para inhibir el crecimiento del tumor y la angiogénesis sin efectos secundarios perjudiciales.

Resultados

Los cuatro grupos de ratones son: 1) la dieta de aceite de maíz, no trato de infrarrojos, 2) dieta con aceite de maíz IR tratamiento, 3) n-3 enriquecido la dieta, el no tratamiento de infrarrojos, 4) n-3 con una dieta enriquecida IR tratamiento.

Una vez que los ratones se dividieron en grupos de tratamiento, el peso corporal de cada ratón se midió cada 3 a 4 días para el resto de la prueba. Como se ilustra en la Fig. 1, los dos grupos que recibieron la terapia de IR cada segundo día durante 4 dosis perdida de peso corporal durante el inicio de terapia IR y duradera para unos 8 o 9 días. Tras la finalización de la terapia de infrarrojos, los ratones irradiados de nuevo comenzó a recuperar su peso hacia el medio de peso de los dos grupos de ratones no sometidos a la terapia de infrarrojos. La media del peso corporal de los grupos de ratones que no recibieron IR aumentaron continuamente hasta el final de la prueba y no fueron diferentes debido a la dieta.

Fig. 2 ilustra el volumen de los tumores significa para cada uno de los cuatro grupos de ratones a partir del principio de la terapia de infrarrojos. Todos los tumores en cada uno de los cuatro grupos de menos de 35 mm 3 y la media de los tamaños de tumor de los cuatro grupos fueron similares al inicio del periodo de tratamiento de infrarrojos. La media de la tasa de crecimiento de los tumores de los ratones no irradiados que recibieron la dieta de aceite de maíz fue significativamente más rápida (p <0,001) que la de los otros tres grupos de ratones (Fig. 3]. El tumor de las tasas de crecimiento de los otros tres grupos de ratones no fueron significativamente diferentes unas de otras.

Vascularización del tumor se determinaron los patrones de midsections examen histológico de los tumores de PAS manchadas. Los tumores con un volumen superior a 35 mm 3 demostrado una cápsula de tejido conectivo con vasos sanguíneos (Fig. 4A]. La zona cortical de los tumores en cerca de 100 μ m de la cápsula reveló algunos vasos sanguíneos mientras que la zona subcortical mayor de 100 μ m de la cápsula mostró pruebas de los vasos sanguíneos y capilares con muchos endotelial pseudopods extender fuera de los capilares (fig. 4B & C]. Localización inmunohistoquímica de CD-31, utilizado como un marcador específico del endotelio, demuestra una reacción positiva a los vasos sanguíneos, capilares, y pseudopods (Fig. 4D]. Las áreas de necrosis tumoral se observaron por debajo de la zona subcortical (Fig. 4E & F]. Inmunohistoquímica localización de hipoxia-inducible factor 1 - α (HIF-α) reveló la zona subcortical del tumor para contener HIF positivo mientras que el tumor de células de la cápsula, corteza y áreas necróticas del tumor demostrar ninguna evidencia de HIF. Así, la zona que se encuentra HIF positivo fue enriquecido en pseudopods endotelial.

Ocular red interceptar conteo se utilizó para cuantificar la vascularización del tumor en 8 μ m de espesor PAS manchadas histológicos de los tumores. Los números de red intercepta ocular se anotó en la subcapsular regiones del tumor más vasos sanguíneos y capilares, pseudopods endoteliales y más de la zona sin que haya indicios de estas estructuras. Este método ha demostrado ser una útil medida de la densidad de volumen ocupado por las estructuras reconocibles. Los resultados de la puntuación de los vasos sanguíneos y de pseudopods endotelial en la regiones subcorticales de los tumores se resumen en la Fig. 5A & B. Como se ilustra en la Fig. 5A & B, en el n-6 ratones alimentados, el volumen de densidad de los vasos sanguíneos del tumor se redujo significativamente, pero la densidad de volumen de tumor pseudopods fue significativamente en el aumento de un día después de la última dosis de irradiación en comparación con los alimentados con n-6 Ratones que no recibieron IR. El vaso sanguíneo y densidades pseudopods volumen de los tumores tratados de IR ratones alimentados con aceite de maíz regresó al nivel de los no irradiados, los ratones alimentados con aceite de maíz en 22 días después de la última dosis de irradiación. Sin embargo, no irradiado en ratones alimentados con la n-3 ácidos grasos dieta enriquecida, el tumor de los vasos sanguíneos volumen fue significativamente menor densidad y la densidad pseudopod volumen fue significativamente mayor que en los no irradiados n-6 ratones alimentados. IR tratamiento no cambió de forma significativa el volumen de una de las densidades de los vasos sanguíneos o pseudopods en los tumores de n-3 ratones alimentados. El análisis estadístico de la media de densidad de los vasos sanguíneos volumen versus la densidad de volumen pseudopod reveló una significativa correlación (r = 0,970, Fig. 6] a un ajuste exponencial. Por lo tanto, como la densidad de los vasos sanguíneos, aumento de volumen, la densidad endotelial pseudopod volumen disminuido.

Secciones histológicas de las zonas viables del tumor incluyendo tanto la corteza y las regiones subcorticales se anotó el número de cifras de metafase. Por lo menos 1000 células cancerosas fueron contados en cada uno de H & E manchadas tumor. Los resultados se resumen en la Fig. 7. Los tumores del grupo que recibió aceite de maíz no tratados con IR tenían el índice más alto metafase. Los grupos de tumores de los ratones alimentados con ácidos grasos n-3, ya sea con o sin IR tratamientos tuvieron significativamente menos metafase cifras de los tumores de ratones que fueron alimentados con la dieta de aceite de maíz, pero que no fueron tratados con IR.

Para evaluar los efectos secundarios, los ratones fueron sacrificados en un día y dos a 22 días después de la última exposición de infrarrojos. Los datos sobre el hígado y el bazo pesos se resumen en la Tabla 1, y los datos sobre los recuentos sanguíneos se resumen en la Tabla 2. No hubo diferencias estadísticamente significativas en el peso del hígado media entre los grupos de tratamiento en la anterior o posterior mata. Por otra parte, en un día después de su última exposición de infrarrojos, el bazo pesos de los dos grupos de ratones que recibieron IR fue significativamente menor que el bazo ponderaciones de los grupos que no recibieron IR. La media del bazo ponderaciones de los ratones tratados IR recuperado a por lo menos el nivel de los no irradiados, los ratones alimentados con aceite de maíz en 22 días después de su última exposición de infrarrojos.

Hubo una disminución significativa en el recuento de leucocitos, glóbulos rojos, plaquetas y los cargos atribuidos a IR en el 1 día después de la final de IR tratamiento (Tabla 2]. No se encontraron diferencias significativas en el recuento de leucocitos, glóbulos rojos, plaquetas y los cargos atribuidos a la n-3 ácidos grasos dieta. En 22 días después del final de la IR tratamiento, el recuento de leucocitos y glóbulos rojos en cuenta los dos grupos de infrarrojos no es tan bajo como lo fueron un día después de infrarrojos, pero sigue siendo significativamente menor que la de los dos grupos no irradiado. Ambos grupos habían IR plaquetas significativamente mayor que cualquiera de los otros grupos por 22 días después del final de la terapia de infrarrojos. Evidentemente, plaquetas han hecho una importante recuperación de compensación por este momento.

Micronúcleos son piezas rotas de los cromosomas después de más de la izquierda es el núcleo de un extruido RBC madura y normalmente son una indicación de daño genético. El análisis estadístico de los micronúcleos cuenta indica que no existen diferencias significativas en la fracción de eritrocitos con micronúcleos entre cualquiera de los cuatro grupos, ya sea en el momento de la eutanasia.

Otra medida de lo posible los efectos secundarios fue el marcador de la actividad mitótica en las criptas duodenales. La división de las células, como las de las criptas duodenales, son particularmente sensibles a los IR. Fig. 8 resume los resultados de la actividad mitótica en las criptas duodenales de ratones sacrificado un día después de la final de la terapia de infrarrojos. La metafase en el índice de las criptas duodenales IR tratamiento ratones alimentados con aceite de maíz fue significativamente menor que en los ratones que no recibieron IR, lo que indica que la división de células murieron. Sin embargo, el índice de metafase en el duodenal criptas de la n-3 que los ratones alimentados con IR fueron tratadas no fue significativamente diferente de la de los n-3 alimentado ratones que no fueron tratados IR.

Discusión

Como era de esperar, tanto el IR y n-3 ácidos grasos dieta enriquecida trabajado para suprimir el crecimiento tumoral. Los análisis estadísticos de los datos de la tasa de crecimiento tumoral (Fig. 3] permitir las comparaciones de la eficacia de los cuatro procedimientos de tratamiento. El n-6 alimentó ratones no tratados con IR tenían la tasa de crecimiento más rápido del tumor. El IR disminuido la tasa de crecimiento del tumor en un 90% en n-6 ratones alimentados. En comparación con los no irradiados n-6 ratones alimentados, el n-3 dieta sola redujo la tasa de crecimiento del tumor en un 66%, mientras que la combinación de los n-3 y RE disminuyó la tasa de crecimiento del tumor por un 78%. El tumor de las tasas de crecimiento de los tres grupos de tratamiento no fueron significativamente diferentes. Así, en este estudio, un n-3 ácidos grasos enriquecido la dieta sola es tan efectiva en la disminución de la tasa de crecimiento de MDA-231 MB como en el n-6 ácidos grasos que contiene la dieta en combinación con la radiación. Radiación en combinación con la dieta n-3 no fue significativamente más efectiva que los n-3 dieta sola. Dado que el tratamiento de infrarrojos tan buenos resultado en la supresión de tumores, pero no podemos determinar si la n-3 ácidos grasos dieta aumento de la eficacia de la IR tratamiento o no. Un modelo diferente en la que el tratamiento dio lugar a IR parcial supresión de los tumores de crecimiento se necesitarían para hacer una conclusión acerca de la capacidad de los ácidos grasos n-3 para aumentar la eficacia de la terapia de infrarrojos.

Entonces, ¿cuáles son los posibles factores que intervienen en la disminución observada en la tasa de crecimiento del tumor debido a los diferentes protocolos de tratamiento? Los datos sobre densidad de los vasos sanguíneos volumen indican que, ya sea solo o infrarrojos de la n-3 sólo dieta son igualmente eficaces en la reducción de la densidad de los vasos sanguíneos de los tumores en comparación con la de los no irradiados grupo que recibió aceite de maíz. El IR tratamiento solo en el grupo que recibió aceite de maíz reprimidas tumor volumen densidad de los vasos sanguíneos como evaluó un día después de la final de la terapia de infrarrojos. Con el tiempo, el volumen de densidad de los vasos sanguíneos en los tumores tratados de la IR, que recibió aceite de maíz grupo recuperó el nivel de la de los tumores en el que recibió aceite de maíz no irradiado grupo. Sin embargo, la combinación de los n-3 de ácidos grasos de la dieta y la continuación de infrarrojos para reprimir la densidad de los vasos sanguíneos en los tumores de 22 días después de terminado el tratamiento de infrarrojos.

La rápida proliferación de las células del cáncer requiere de la angiogénesis para mantener los suministros de oxígeno y nutrientes a la creciente tumor. Las células tumorales que están lo suficientemente lejos de distancia (más de 100 a 150 μ m) de un vaso sanguíneo puede convertirse en hipoxia, lo que provoca que estas células tumorales para producir HIF-α y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [21]. El VEGF estimula las células endoteliales luego de brotar y producir pseudopods ese proyecto en las zonas de hipoxia del tumor [21]. Los brotes endoteliales y pseudopods forma vacuolas que se funden con los lúmenes capilares, que permiten la entrada de las células sanguíneas. Otras medidas incluyen la angiogénesis en la degradación de la membrana basal en torno a los buques existentes, la contratación de pericyte músculo liso y células, la proliferación de las células endoteliales, lumen formación, la generación de una nueva membrana basal, la fusión de los buques de reciente formación y puesta en marcha de la circulación de la sangre. La observó relación inversa entre el volumen de la densidad de los vasos sanguíneos y de pseudopods, combinado con el hecho de que pseudopods son más abundantes en la zona del tumor más enriquecido en HIF-α, pseudopod indica que la densidad de volumen es un indicador de hipoxia en las regiones Tumor. Dada esta relación, el aumento de la densidad de volumen pseudopod como se observa en los tumores sugiere que las áreas subcorticales son hipóxica. Pseudopods tumor fueron significativamente aumentado un día después de la terapia de infrarrojos en el que recibió aceite de maíz ratones. En los ratones alimentados con aceite de maíz, el volumen pseudopod densidad disminuyó el volumen como la densidad de los vasos sanguíneos en comparación con el aumento de los no irradiados, los ratones alimentados con aceite de maíz durante los 22 días de recuperación tras el final de la terapia de infrarrojos. El hecho de que la n-3 retrasado la recuperación de los vasos sanguíneos del tumor, pero no retardar la formación de pseudopods sugiere que la dieta n-3 está trabajando para retardar la angiogénesis en una o varias de las siguientes medidas después pseudopod formación.

Hay informes de que un n-3 ácidos grasos dieta enriquecida puede reprimir mitosis y el crecimiento de los tumores de colon y de mama [1, 6, 9]. Por lo tanto, no es sorprendente encontrar que la dieta n-3 también suprimida la metafase índice viable en zonas de los tumores de cáncer de mama en este estudio.

En total, los datos revelan que el consumo de los n-3 que contiene la dieta resultó en una disminución de la tasa de crecimiento del tumor, la proliferación de las células (Fig. 7] y de los vasos sanguíneos volumen densidad (Fig. 5A]. Hardman [24] ha examinado algunos de los posibles mecanismos moleculares implicados en la represión del crecimiento tumoral mediante la adición de ácidos grasos n-3 a la dieta. Los mecanismos involucrados en la supresión del crecimiento del tumor por un ácido graso omega-3 enriquecido dieta incluyen: 1) disminución de la expresión de la ciclooxigenasa-2, la reducción de la disminución de la angiogénesis y la proliferación de las células del cáncer, 2) supresión del factor nuclear κ B, la activación y expresión de bcl-2, Que permite la apoptosis de las células del cáncer, 3) supresión de la AP-1 oncogenes ras y, 4) la diferenciación inducida de las células cancerosas, 5) reducción de la actividad de la aromatasa que disminuye los niveles de estrógenos, 6) la inhibición de la más adelante en el proceso de la angiogénesis tumoral.

No ha habido preocupación de que la adición de ácidos grasos n-3 en la dieta pueden aumentar el daño a la radiación de acogida. N-3 los ácidos grasos insaturados son más que una n-6 ácidos grasos con el mismo número de carbones. Los dobles enlaces son sensibles a la radiación y el daño al incorporarlo en fosfolípidos celulares podría aumentar la susceptibilidad de una célula a la radiación inducida por la peroxidación lipídica. Sin embargo, hemos demostrado que la producción de enzimas antioxidantes endógenos se incrementa en las células normales (pero no en las células tumorales) en ácidos grasos n-3 se incluyen en la dieta [18]. Este aumento de las enzimas antioxidantes endógenos podrían proteger a las células normales del daño oxidativo. Los daños a la médula ósea debido a la dieta n-3 no parece que se basa en el aumento tanto de glóbulos o número de micronúcleos. Parece que la basal más baja en el índice mitótico de las criptas duodenales n-3 ratones alimentados también puede haber contribuido a la protección del intestino daños de la radiación. La irradiación es más perjudicial para la multiplicación de las células. La menor tasa de proliferación basal se podría esperar que en el resultado menos IR inducida por el daño a las células con capacidad de proliferación. El índice de la metafase duodeno criptas de n-3 después de los ratones alimentados con IR es mucho más cercano al de los ratones no irradiados que en el n-6 ratones alimentados después de IR, lo que indica la recuperación más rápida, ya sea inicial o menos por asesinato IR proliferativa de las células En el duodeno en el n-3 ratones alimentados.

La irradiación corporal de los ratones que se esperaba para demostrar efectos secundarios significativos dentro de un día siguiente a la de ocho días de curso de la terapia de infrarrojos. Los efectos adversos incluyeron descensos significativos en WBC, RBC, y de plaquetas, así como la pérdida de peso del bazo. Estos efectos secundarios mensurables servir como referencia para la comparación con los efectos secundarios de la n-3 enriquecido la dieta sola o en combinación con terapia de infrarrojos. En este estudio, no hubo pruebas de aumento de los efectos secundarios debido a la n-3 dieta ni se parecen disminuir significativamente los efectos secundarios de medirse IR terapia. Este fracaso de la n-3 dieta para disminuir los efectos secundarios de la terapia IR difiere de los últimos informes que el ácido graso omega-3 suplementos mejorado los efectos secundarios de varios agentes quimioterapéuticos [11 - 15]. La mayoría de los efectos secundarios observados con todo el cuerpo de irradiación son limitados en pacientes humanos, por la orientación de IR a las regiones tumorales.

El n-3 sólo dieta significativamente el crecimiento del tumor. Sin embargo, a corto plazo, la eficacia de la terapia de infrarrojos no fue significativamente mayor en los ratones que consumieron el n-3 enriquecido que en la dieta de los ratones que consumieron la dieta de aceite de maíz. Otros han informado de que la eficacia de la terapia de radiación se incrementó en presencia de un n-3 que contiene la dieta [25]. Se especuló que los n-3 dieta rica en aceite de reducido volumen densidad de los vasos sanguíneos, causando el aumento de las zonas del tumor para convertirse en hipoxia, lo que hace que estas zonas de hipoxia del tumor menos sensibles al daño oxidativo de IR. Nuestro experimento ha continuado durante más de tres semanas después de la radiación, los resultados podrían haber sido diferentes. Angiogénesis represión de la dieta n-3 se han seguido para suprimir el crecimiento de tumores residuales en el n-3, pero los ratones alimentados con tumores residuales en el n-6 ratones fueron alimentados estimular la angiogénesis y podría haber reanudado el crecimiento. En apoyo de esta idea, los análisis de crecimiento tumoral en el tratamiento de IR n-3 y n alimentado a 6 de ratones alimentados a partir de 7 días desde el final de la radiación indica que puede haber una reanudación del crecimiento del tumor residual en el n-6 Alimentado ratones, pero no en el n-3 ratones alimentados. La tasa de crecimiento tumoral (media ± DE) de análisis de regresión lineal de los últimos cuatro puntos de los datos disponibles de la n-6 alimentados, IR ratones tratados es de 2,3 ± 0,5 mm 3 / día, una disminución significativa (p 60; 0,05) tasa de crecimiento positiva . Sin embargo, la tasa de crecimiento tumoral (media ± SEM) de la n-3 alimentados, IR ratones tratados durante los últimos cuatro puntos de datos se -1,0 ± 1,0 mm 3 / día, un ritmo que no es significativa (p = 0,5) diferente de 0. Debido a los pocos puntos, las tasas de crecimiento de estos tumores no son significativamente diferentes (p = 0,07), sin embargo, los datos no sugieren que en un estudio a más largo plazo, n-3 pueden proporcionar un mejor tratamiento ventaja que se indica con los resultados de este estudio .

Conclusión

En conclusión, un ácido graso omega-3 se encontró una dieta enriquecida de reducir significativamente la tasa de crecimiento y la angiogénesis de un humano xenoinjertos de cáncer de mama sin evidencia de efectos secundarios perjudiciales.

Métodos

Todos los animales y el uso de atención de los procedimientos fueron aprobados por el animal de Atención Institucional y el Empleo Comisiones de la Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio y del Centro de Investigación Biomédica Pennington. El cáncer de mama humano línea celular MDA-MB-231 se obtuvo de la American Type Culture Collection. Las líneas de células se cultivaron en McCoys del 5A suplementado con piruvato, vitaminas, aminoácidos, antibióticos, y el 10% de suero fetal bovino [26]. La MDA-MB-231 células fueron cosechadas exponencial de las culturas y las inoculadas en el 2 × 10 6 células / inóculo en la almohadilla de grasa mamaria inguinal área de 160 mujeres athymic nude mice, de 6 semanas de edad (comprados en Harlan Sprague Dawley, Inc , Indianapolis, IN). Los animales fueron alojados bajo condiciones libre de agentes patógenos y alimentaron una AIN-76 semipurified dieta ligeramente modificado para contener un 10% w / w de aceite de maíz durante el período inicial de crecimiento del tumor. El crecimiento de xenoinjertos se vigila cada uno tres veces por semana por el exterior medición de los tumores en tres dimensiones utilizando calibradores digitales. Xenoinjertos de volumen (V), se determinó mediante la siguiente ecuación: V = (L × W × D) × 0,5, donde L es la longitud, W es la anchura y la D es la profundidad de un xenoinjertos. Cuando los tumores alcanzado un diámetro medio de unos 3 mm después de 5 semanas, los ratones se dividieron en 2 grupos, de tal manera que la media y la mediana del volumen de los tumores de los grupos fueron acompañadas de cerca.

La mitad de los ratones alimentados con el 10% w / w dieta rica en aceite de maíz para el resto del estudio, la mitad de los ratones fueron colocados en la dieta experimental que contenía 5% w / w ácidos grasos n-3 suplemento (AAFA, Incell, Corp ., LLC, San Antonio, TX) y el 5% w / w de aceite de canola. El aceite de maíz es de 61% de ácido linoleico (18:2 n-6) y alrededor de un 1% n-3 ácidos grasos, por lo tanto, proporciona principalmente n-6 AG. El 5% w / w aceite de canola se utiliza como fuente esencial de n-6 AG en el n-3 dieta. Aceite de canola es de 20% de ácido linoleico y también contiene alrededor de un 10% de ácido alfa-linolénico (18:3 n-3). Cinco por ciento w / w n-3 FA suplemento (AAFA), que contiene 6% n-6 de ácidos grasos y 61% total de ácidos grasos n-3 se añadió a aumentar en gran medida el contenido de n-3 de esta dieta. El total w / w composición de la dieta n-6 fue 0,1% n-3 FA y el 6,1% n-6 AF n-3/n-6 con un ratio de 0,1. El total w / w composición de la dieta n-3 fue 3,65% n-3 FA y el 1,3% n-6 AF con un ratio n-3/n-6 AF de 2.8:1. Estas dietas siempre grandes diferencias en los ácidos grasos pensamiento que se asocia con el cáncer de crecimiento, el ácido linoleico y omega-3 FA.

La mitad de los tumores de los ratones con dieta de cada grupo recibieron una dosis acumulativa de 800 cGy de IR (200 cGy cada segundo día durante 4 ciclos). Los 200 cGy / día, la dosis se basa en los resultados preliminares de un estudio dosis-respuesta utilizando el mismo modelo de ratón y en el hecho de que 180 a 250 cGy / día es de uso común la dosis aguda de la radioterapia de los seres humanos. Acerca de 815 cGy de irradiación corporal es la LD50/30 para ratones (50% letal dentro de los 30 días). Los animales fueron trasladados a una jaula circular con compartimentos individuales para cada ratón durante la irradiación. Los ratones fueron irradiados en un 137 Cs Cell Gamma-40 Irradiator (de la Energía Atómica de Canadá) en la instalación de nuestro Departamento de Radiología. Un análisis dosimétricos de este instrumento se realiza mensual para el cálculo de una precisa exposición de 200 cGy. Los ratones fueron sacrificados en un día o 22 días después del último tratamiento de radiación.

Los ratones fueron profundamente anestesiados utilizando una ketamina / rompun mezcla preparada por el UTHSCSA veterinario de animales de laboratorio, cervically dislocada, y luego se exsanguinated por punción cardiaca. La sangre fue recogida en un microtube que contiene EDTA para sanguíneos completos.

El tumor, duodeno, hígado y bazo fueron retirados en el momento de la eutanasia. Las muestras del duodeno y el tumor se fija en Omni Fix II (Mt Vernon NY) y embebidos en parafina. Embedded tejidos se cortaron 4 μ m u 8 μ m de espesor, cortar secciones se colocaron en el microscopio entonces deparaffinized y teñidas con hematoxilina y eosina o con ácido periódico de Schiff (PAS) para el análisis morfológico. Secciones adicionales fueron preparados para inmunohistoquímica.

Para determinar el efecto del tratamiento sobre la angiogénesis del tumor, que mide la vascularización de los tumores extirpados. Tumor de tejidos fueron fijados e incluidos en parafina. Mediados tumor secciones (8 μ m de espesor) fueron cortadas de los tejidos incrustados y teñidas con ácido periódico de Schiff (PAS). Las secciones fueron examinadas por microscopía de luz. CD31 inmunoticción ratón para los vasos sanguíneos, el 4 μ m de espesor secciones se realizó por secciones incubando tumor con una rata antimouse CD-31 (PECAM-1) anticuerpo monoclonal (PharMingen) a los 5 μ g / ml durante 30 minutos a 37 ° C. Las secciones fueron incubadas con un biotina-etiquetados de cabra anti-IgG de rata (Zymed; dilución 1:200) por 30 min a temperatura ambiente, seguida de ABC kit de reactivos (Vector Laboratories) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Color de reacción se realizó con 3, 3'-diaminobenzidine (Vector Laboratories) y counterstained con hematoxilina. Hypoxia-inducible factor alfa-1 (HIF-1 α) inmunohistoquímica se realizó después de la instrucción para la recuperación de antígeno (Biogenex protocolo) y iso-IHC (inno-Genex Mouse-a-Mouse iso-kit IHC) con estos cambios: fue con Dewaxing 3 cambios de xileno, 10 minutos / cambio. Rehidratación en el 100%, 90% y 70% de etanol durante 10 minutos cada uno. La dilución inicial de los anticuerpos se 1:200. Stressgen anti-HIF-1 alfa, producto # OSA-601, es el anticuerpo utilizado. Todas las secciones fueron codificados, y por encima de tratados como la medida de los vasos sanguíneos, las células endoteliales pseudopods superficie total y densidad de volumen se anotó utilizando una rejilla ocular. El número de línea de la cuadrícula, intercepta más de los vasos sanguíneos y endoteliales pseudopods dio una medida de la densidad de volumen total de estas estructuras.

Un contador de células de sangre con envase veterinaria se utiliza para la cuenta de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas en la sangre anticoagulada EDTA de los ratones. Nuestro Laboratorio de Recursos Animales división realizó esta prueba. Micronúcleos cuenta se determinará sobre delgadas frotis de sangre total. Muestras de sangre fueron teñidas con 0,1% naranja de acridina buffer fosfato salino (pH 7,4) durante 10 segundos. Las láminas fueron examinados luego de la presencia de micronúcleos utilizando un microscopio de fluorescencia y un objetivo de inmersión en aceite de 100X. Por lo menos 1000 acridina naranja manchado glóbulos rojos fueron contados y el porcentaje de eritrocitos que contienen micronúcleos se determinó [27].

Fijo especímenes de duodeno fueron recortados, procesados y orientada a la inserción de parafina. Cuatro μ m de espesor de las secciones de los bloques de parafina fueron montadas en láminas. Complete midaxially seccionó criptas sobre H & E manchadas diapositivas fueron seleccionados para análisis. Complete criptas fueron definidas como aquellas con: 1) la cripta base en la muscularis mucosa, 2) una luz de la boca abierta a la base y 3) una única columna de las células epiteliales hasta cada lado de la cripta. El número de cifras de metafase por cripta midaxial sección fueron contados por 10 criptas de cada ratón.

SAS programas de computadora se utilizó para los análisis estadísticos de datos numéricos. Las pruebas de normalidad (estadísticas básicas) se utilizaron en cada conjunto de datos. De una vía y de dos vías de análisis de varianza, seguido por Student-Newman-Keuls gama múltiples pruebas, en su caso, se utilizó para determinar si fueron estadísticamente significativas (p ≤ 0,05), las diferencias en ningún parámetro medido debido a los tratamientos. Prism ™ (Graphpad Software, Inc) fue utilizado para los análisis estadísticos de los datos de crecimiento del tumor. El promedio de tasa de crecimiento para cada grupo se determinó a través de mínimos cuadrados análisis de regresión lineal de media el volumen de los tumores con el tiempo. Los análisis de varianza de las pendientes de la regresión lineal (tasa de crecimiento) se utiliza para determinar diferencias estadísticas en el promedio de las tasas de crecimiento entre los grupos de tratamiento.

Conflicto de intereses

WEH CIT y son asesores científicos de Incell, Corp, LLC. Ellos no reciben una compensación financiera de apoyo a la investigación y no se recibió de Incell, Corp, LLC.

Contribuciones de los autores

WEH y CIT contribuido igualmente a la redacción de este manuscrito. LZS siempre las células del tumor, NS asistido diariamente con el cuidado de los animales y el gráfico preparación. Todos los autores han leído y aprobado este manuscrito.

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada por el Instituto Americano para la Investigación del Cáncer de subvención 01A010, CA 75253 NIH subvención y fondos de la Fundación de Investigación Biomédica de Pennington.